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【求助】real-time PCR 空水作模板,怎么30循环后也有曲线?
我做了2管SRY基因扩增(1和2号),2管HBB基因扩增(3和4号),1管SRY引物空水对照(5号),结果:1号和5号一模一样,都有曲线,2号空白,3、4号一致108bp，
接着又做了2管SRY引物空水对照(5和6号)（跟上面5号管一模一样），2管HBB基因空水对照（7和8号）, 结果：4个管子均有曲线，5、6号跑出50bp左右条带（一致），大概引物二聚体，7、8号跑出108bp条带（一致）。
7和8号加不加模板，怎么一个样？3、4、7号real-time曲线一致，8号曲线明显很低，5、6号曲线比1号曲线低，但是所有曲线都在30循环后，我用的是SYBY GREEN法！清高手指点！谢谢！你说了这么多,也不知道是你的体系污染了,还是引物二聚体产生的荧光强度,建议你帖扩增曲线图和熔解曲线图上来看看啊,我觉得你用SYBY GREEN法做后,如果你有引物二聚体的产生,看多少循环后有扩增是不准确的啊,因为每一循环都会产生引物二聚体SYBY GREEN同样会结合到其中,也会产生荧光,所以这个时候建议你最好用熔解曲线,看看有没有产物,通过产物的TM值和引物二聚体的TM值不一样,来看看有没有扩增啊,谢谢Modify的解答,我用的商品化用水,出现了smear,后改用临床注射用水,安剖装的,每次取了几十微升,剩下的丢弃掉,会不会注射用水里面也有微量的污染,主要搞不懂的是HBB基因扩增(3和4号)与2管HBB基因空水对照（7和8号）,结果一模一样,real-time 曲线一致,跑的电泳也是一致,怎么加不加模板,结果会是一样的呢?有没有战友做SYBY Green也碰到类似情况?PCR用水,最好能用去离子水,然后高压一下就能用了啊 !你说的跑的电泳是一致,是指都有产物,还是都没有产物啊,如果是都有产物,肯定是试剂污染了,如果都没有产物,那肯定是你的模板不行啊,real-time 曲线一致那如果都没有产物,也可能是引物二聚体产生的啊,都有产物,相同亮度!我是临床的医生,在临床拿的注射用水做的,每做一次开一支安剖,严格无菌操作,问了几个人,他们都说SYBY Green30循环后出现扩增曲线很正常,引物用不掉也会自我扩增,但是关键的的是加不加模板,跑出来的产物亮度\片段大小均一致,不好解释,哎 郁闷中…………如果阴性对照的溶解曲线与目的片段一致、跑胶片段长度也一致，可以考虑是污染。可以肯定你是污染了啊,试剂换了,水用自己高压的,换个实验室(说不定实验室污染了),再做一次试一下啊除了试剂和水外，移液枪也要换的，或者用带滤心的吸头，房间要灭菌或更换，标本处理最好有单独的房间，还要有生命安全柜是最好的。重新分装了一下引物，结果对了，但是偶尔出现标本的副管也出现空白，新的问题诞生了，但是溶解曲线不是太好．Hold out!!!
您的位置： &&怎么通过Q-PCR的扩增曲线和溶解曲线来分析结果,如何通过曲线来判断结果的好与坏?
怎么通过Q-PCR的扩增曲线和溶解曲线来分析结果,如何通过曲线来判断结果的好与坏?
具体要看你做什么实验,模板和扩增的基因实怎样的.1、扩增曲线：一般来说如果你做双ΔCT法那么你的扩增曲线必须是S型,有明显的四个时期,且复孔的CT值尽量一致,相差不要超过0.5个CT值（上限是1个CT值）；同一个基因在不同浓度的相同模板下扩增,其相差的CT值为相差浓度倍数的2次开方.比如同一种CDNA5倍浓度稀释,那么同一种基因扩增的前提下,5倍浓度模板的CT值会比1倍浓度模板的CT值提前2.3个循环左右,以此类推,当然这是理论值；另外阴性对照不能有扩增（40个循环以后出CT值属正常现象,也可算作没有扩增）.2、溶解曲线：溶解曲线是判断扩增产物是否单一的曲线,顾名思义,其跟模板（或其浓度）没有关系,扩增什么基因就应该有其相对应的溶解曲线,类似于电泳.那么你扩增几种基因就应该有几种对应的峰（一般SYBR法的目的基因在80~90℃之间）,我说的是一般情况,这个跟扩增片段长短有关系.出现其他峰就该考虑是否为引物二聚体（一般为60~75℃之间）视引物长度而定,而基因组DNA污染的峰会在90℃以后.出现引物二聚体可能是引物设计、引物加量等原因（也有可能是从加完反应液到上机开始PCR这之间的时间过长）所致；基因组DNA那么考虑设计跨内含子引物或者实验之前做gDNA的消除工作.而阴性对照有目的峰那可能就是模板污染,注意实验操作等避免模板污染.纯手打,支持下.
与《怎么通过Q-PCR的扩增曲线和溶解曲线来分析结果,如何通过曲线来判断结果的好与坏?》相关的作业问题
在荧光法定量PCR中溶解曲线直接表示了引物的特异性,如果是单一的峰,那么我们要看的是TM值在哪里,通常情况下都是80---90之间,如果太小那可能扩增出来的不是你想要的片段就是引物二聚体,如果两个峰那就说明出现了非特异性扩增
直接从生物组织中提取的DNA的量一般都是很少的,所以需要PCR进行扩增,使其达到一定的浓度,才方便进行下一步的操作.
你没有告诉我成本函数,这怎么能求出何时有最大利润?我想你这道题目应该是求最大收益或者是在假设中给出了厂商所面对的成本是0.如果题目像我说的那样的话,那不仅厂商在缺乏弹性的部分经营不能得到最大利润,在富于弹性的部分也不可能得到最大利润,最大利润只可能出现在弹性等于1的点.因为使厂商的收益最大,无非是求使得需求曲线与P,Q
33．（8分）请回答基因工程方面的有关问题： （1）利用PCR技术扩增目的基本复制四次,共有16个DNA分子,其中 只 含引物A的DNA片段有1个,由母链和
我是ls小号,度娘审核答案你看这个图,不就是在一段DNA上截吗?就是说复制出的DNA双链中有的不是目的基因,&这句话我不太懂.在不考虑DNA外显子和内含子以及复制时出现的染色体变异等等情况下,一模一样的DNA为什么会有不同的基因?额,因为这部分是选修,我们只学了基础理论.
看完楼上的回答,哥笑得无语了.一群饭桶在乱抽!PCR根本就不用ATP的,它是用dNTP(即三磷酸脱氧核苷酸)作原料的,与模板链结合时先生成焦磷酸,焦磷酸不稳定,容易转化为两个磷酸并释放能量(因为它其中含有高能磷酸键,高能磷酸键楼主就应该知道是什么吧)这就是PCR的能量来源.最后,还想奉劝一下楼上各位,大家会就会,不会就
“是的 只有编码区的基因才可以控制合成蛋白质 ”“当然,没有的话扩增不了的”.这两个全部是胡说.只要有一定长度的DNA模板,引物正确特异性好,PCR条件合适,就可以扩增模板,而模板是编码还是非编码没有区别.跟合成不合成蛋白质更是无关,你扩增的是核酸不是氨基酸；而能不能扩增主要看你的模板和引物的选择.目前发现,基因的5'
ATCG.原理就是体外环境模仿人体内环境,完成人体内的DNA复制,大概就这样.
大于a我认为是这样的.
额...我又翻书看了看...没错啊...-b表示需求曲线相对于价格轴的斜率,即-b=dQ /dP；原因和你说的一样,相对于价格轴,价格轴是纵轴,不提相对于价格轴的话就直接是斜率了啊.所以说：需求曲线在某一点的斜率为dP /dQ .（相对于Q（横）轴说的,符合人们一般的思维习惯.）至于：“需求的价格点弹性不仅取决于需求曲
目的基因与载体结合需要ATP用PCR技术扩增时也需要用限制酶切割质粒时是切开一个裂口
引物的功能是作为核苷酸聚合的起始点,引导DNA的合成.能设定循环次数,及控制复制次数.PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度.一般的循环次数选在30～40次之间,循环次数越多,非特异性产物的量亦随之增多.
PCR技术过程简介1.将目的基因与引物,以及耐高温的DNA聚合酶加入PCR扩增仪中.加热到90~95℃.让目的基因解旋.2.降温至55~60℃,让引物与①中的DNA单链结合.3.加热至70~75℃,让耐高温的DNA聚合酶工作,大量扩增目的基因.
②由于题图中的引物A和引物B均不在该片段的端点,因此第一轮循环后,得到的两DNA片段中两条脱氧核苷酸链都不等长,通过自行绘图可推知,第二轮中亦不会出现等长的,需到第三轮.
Q点轨迹是以点（3,-4）为圆心,2为半径的圆. 再问： 请给出详细步骤，谢谢 再答： 设Q点对应负数w，在w=2Z+3-4i 2z=w-(3-4i) 因为|z|=1 所以|w-(3-4i)|=2 这说明Q点轨迹是以点（3，-4）为圆心，2为半径的圆。
供给不变,需求增长,均衡价格上升 入门级,可能错了
这题很烦的,要要耐心的一点点画一下还有快高考了,不要再纠结于这种题目了,跳过
引物本来就是单链的.书上画成双链才怪.PCR所用的DNA聚合酶只能顺着已经存在的一小段DNA的尾巴来接着合成,它不会自己起头.引物就是这么一小段用来起头的DNA.DNA本身很长很长,我们扩增时,只能扩增其中一小段基因.如何确定扩增哪一小段呢?就需要引物来帮忙了.引物具有特殊的核苷酸序列,使它正好能与DNA中某个特定的部
不需要解旋酶,是通过加热解旋的,当温度高于90度时,DNA就变性为单链. 再问： 可是一楼说需要，那？ 再答： 不需要的，这个内容我教过无数次了。不信，可去看看高中生物选修一。溶解曲线(溶解曲线,基因,扩增条件,扩增曲线) - PCR实验 - 生物秀
标题: 溶解曲线(溶解曲线,基因,扩增条件,扩增曲线)
摘要: [溶解曲线(溶解曲线,基因,扩增条件,扩增曲线)] 请问各位高手，我的溶解曲线不规则是什么原因呢？我扩是一个基因的溶解曲线峰很乱，扩增曲线的Ct值也完全没有规律，将qPCR产物电泳能看到在100bp左右有一条弥散的带。但是与这个基因一起扩增的其它基因扩增曲线和溶解曲线都没有问题，应该不是污染吧。之前做普通的PCR，相同的引物又能扩出条带，只是扩增条件不同。会不会是扩增条件需要调整下呢？这是我的qPCR的扩增步骤：1Cycle
关键词:[溶解曲线 基因 扩增条件 扩增曲线 不规则 条带 弥散]……
请问各位高手，我的溶解曲线不规则是什么原因呢？我扩是一个基因的溶解曲线峰很乱，扩增曲线的Ct值也完全没有规律，将qPCR产物电泳能看到在100bp左右有一条弥散的带。但是与这个基因一起扩增的其它基因扩增曲线和溶解曲线都没有问题，应该不是污染吧。之前做普通的PCR，相同的引物又能扩出条带，只是扩增条件不同。会不会是扩增条件需要调整下呢？这是我的qPCR的扩增步骤：1Cycle
95.0oCfor 00:3040Cycle
1: 95.0oCfor 00:05Step
2: 55.0oCfor 00:30Step
3: 72.0oCfor 00:30melt curve：1Cycle
95.0oCfor 01:001Cycle
55.0oCfor 01:0080Cycle
55.0oCfor 00:10我做普通PCR时的扩增步骤：1Cycle
for 5：0035Cycle
94.0oCfor 00:30 Step
51.0oCfor 00:30 Step
72.0oCfor 00:30
回复把ANNEALING提高，当然前提是你的引物及模板没有问题，回复1.调整TM2.重新合成primer回复建议先提高褪火温度和降低引物浓度，然后不行，只有重新设计引物了！因为从图中看出二聚体很严重，而且你融解曲线显示两个峰，也说明引物二聚体很严重。
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【求助】普通PCR可以扩出来，换定量PCR为什么就扩不出来呢？
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这个帖子发布于4年零69天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
引物、试剂和参数设置都是一模一样的，同样的条件在普通PCR仪上扩增良好，电泳见到了单一的目的条带；去定量PCR仪上扩却扩不出来了，Ct值基本上35-45之间！产物电泳也什么都看不到。用的是ABI StepOne。试剂都是TAKARA的预混试剂，含SYBR Green 1染料；模板DNA按说也都没有问题。真是郁闷极了。会是什么原因呢？
不知道邀请谁？试试他们
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能把反应条件说一下吗？仪器设置的有没有问题呢？
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tiantian 能把反应条件说一下吗？仪器设置的有没有问题呢？1.预变性 95℃，3min；2.变性 95℃，30s；3.退火 55℃，30s；4.延伸 72℃，50s；5.延伸 72℃，10min；（step2—4，45个循环）溶解曲线：75℃——95℃，0.2℃/s。反应条件是前人在做的过程中摸索出来的，基本照搬了(和别人用的PCR仪、试剂不完全相同)；对ABI StepOne仪器虽然不甚熟悉，但是有较熟悉的同学指导，应该不会有大的问题啊。曾经在DA7600的定量PCR仪上做过预实验，内参及阴性对照、引物、体系、反应条件均可，内参及目的基因扩增Ct值25左右。在普通PCR仪上也用相同条件扩增过，产物电泳分析确为单一目的条带。当然了，每次扩增用的不是同一个模板cDNA，但是理论上相差不远。谢谢支持！求思路啊！
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我这出现过一种情况，过去能扩增的体系忽然扩增效率大降甚至扩增失败，必须添加BSA成分的buffer才能正常扩增，可以尝试添加终浓度为0.01%的BSA试试，可能跟耗材有一定关系
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既然只有仪器不同，那只能在仪器方面找原因了pcr仪器的性能主要有两点:1,温度的准确度；2，温度的升降速率这两个参数对检测影响很大，建议找厂家校准温度不同仪器建议重新摸条件还有就是感觉你发上来的条件不像是做荧光定量pcr的条件，一般荧光定量是两步法，即没有延伸这一步，因为荧光定量pcr产物一般在150bp左右，不知道你的片段多大即便是用三步法延伸这个一步只需要15’左右即可，如果50‘这得是扩多大的条带啊
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yangrui2006114 1.预变性 95℃，3min；2.变性 95℃，30s；3.退火 55℃，30s；4.延伸 72℃，50s；5.延伸 72℃，10min；（step2—4，45个循环）溶解曲线：75℃——95℃，0.2℃/s。反应条件是前人在做的过程中摸索出来的，基本照搬了(和别人用的PCR仪、试剂不完全相同)；对ABI StepOne仪器虽然不甚熟悉，但是有较熟悉的同学指导，应该不会有大的问题啊。曾经在DA7600的定量PCR仪上做过预实验，内参及阴性对照、引物、体系、反应条件均可，内参及目的基因扩增Ct值25左右。在普通PCR仪上也用相同条件扩增过，产物电泳分析确为单一目的条带。当然了，每次扩增用的不是同一个模板cDNA，但是理论上相差不远。谢谢支持！求思路啊！每次扩增用的不是同一个模板cDNA，但是理论上相差不远。没有理论吧，要确保模板质量没问题哦。
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seuzsl 既然只有仪器不同，那只能在仪器方面找原因了pcr仪器的性能主要有两点:1,温度的准确度；2，温度的升降速率这两个参数对检测影响很大，建议找厂家校准温度不同仪器建议重新摸条件还有就是感觉你发上来的条件不像是做荧光定量pcr的条件，一般荧光定量是两步法，即没有延伸这一步，因为荧光定量pcr产物一般在150bp左右，不知道你的片段多大即便是用三步法延伸这个一步只需要15’左右即可，如果50‘这得是扩多大的条带啊嗯，最早是没有用荧光定量PCR的，只在普通PCR扩增，目的条带大约200bp；后来在原先的实验基础上做了部分改进，但是改过之后需要用定量PCR，现在设置的条件是在之前条件基础上稍作修改的；因为已有前人做过，所以没有再做修改。或许是模板的问题，我们提取的总RNA没有问题，但是反转录之后就不清楚了啊。昨天换了一个cDNA重新做，终于看到扩增曲线，虽不甚完美，也心安了许多。谢谢支持！我们今后会注意探索反应条件，对荧光定量PCR知识真的了解太少了，学习！
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sdhjw2008 每次扩增用的不是同一个模板cDNA，但是理论上相差不远。没有理论吧，要确保模板质量没问题哦。嗯，是啊，虽然确定了所提的RNA没有问题，可是反转录过程就不好说了……昨天我们换了一个模板，居然扩出来了，不是很完美的结果，但也过得去，很是开心啊！只是很不明白，为什么那份cDNA就不行，RNA是没问题的，反转录我们也做了那么多次了，误差应该很小的……如果找不到那份cDNA异常的原因，以后就还可能出现这样的问题啊。
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轩辕顽童 我这出现过一种情况，过去能扩增的体系忽然扩增效率大降甚至扩增失败，必须添加BSA成分的buffer才能正常扩增，可以尝试添加终浓度为0.01%的BSA试试，可能跟耗材有一定关系嗯，因为买的是比较省事的试剂盒，想着一般试剂盒里的东西都是比较好用不必操心的；我们用的pcr反应管倒真是很便宜的，担心会影响荧光信号检测，打算换进口的好一些的管子
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关于丁香园}