奥林巴斯显微镜，反卷积显微镜的算法
&&发布者：admin&
&在过去的十年里，各种简单和复杂的算法已经发展到协助在从数字图像去除模糊。&最普遍使用的算法的卷积在光学显微镜可分为两大类：&去模糊和图像复原&。&去模糊算法基本上二维的，因为它们适用于操作面，由面内的每个二维三维图像栈的平面。&与此相反，因为它们在一个三维图像堆栈同时操作上的每一个像素的图像恢复算法被适当地称为&三维&。
在继续之前，有几个专业术语必须被定义。&的对象指的是光在视显微镜的字段由发射结构的三维图案。RAW图像是指从显微镜获得的未处理的数字图像或图像栈。&的图像中感兴趣的特定区域被称为特征&。
去模糊算法
虽然通常被称为近邻&，&多邻居&，&无邻居&，和反锐化掩模常用算法基本上是二维的，它们被归类为这个讨论，&去模糊算法的目的。&作为一类，这些算法适用于操作面，由面内的每个二维三维图像栈的平面。&例如，最近邻算法运行在z平面通过模糊相邻平面（Z + 1和z - 1，用数字模糊滤波器），然后从z平面中减去模糊的平面。&多邻居的技术扩展这个概念飞机的用户可选择的数字。&一种三维堆叠是通过应用该算法的每一个平面的协议栈进行处理。&在这种方式中，模糊的估算值是从每个平面中移除。&图1给出了从光学部分的三维堆叠中选择一个单一的焦平面，前处理（图1（a）），以及去卷积通过最近邻算法（图1（b））之后。&从非洲爪蟾的制备细胞染色微管购入的数据。
去模糊算法是计算经济，因为它们涉及对单个图像平面表现相对简单的计算。&但是，有几个主要的缺点这些方法。&首先，从几架飞机噪声相加。&第二，去模糊算法去除模糊的信号，从而降低整体信号电平。&三，功能特点的点扩散函数特别z平面重叠可在飞机，他们并不真正属于进行锐化（实际上，特征明显位置可能会改变）。&去模糊单个二维图像时，因为它们常常包含来自将被削尖，好像他们是在焦平面上的其它结构的衍射环或轻这一问题尤为严重。&综上所述，这些发现表明，去模糊算法提高对比度，但他们这样做在降低信号噪声比为代价，也可能引入的图像中的结构构件。
二维去模糊算法可能是在一个快速去模糊操作是必要的，或当电脑的电源是有限的情况下非常有用。&这些例程在具有荧光结构离散分布，特别是在z轴标本效果最好。&然而，简单的去模糊算法诱导像素的相对强度伪迹的变化，应谨慎（或最好，一点都适用），以目的地为形态的测量，定量荧光强度测量，并且强度比计算的图像被应用。
图像复原算法
在反卷积显微图像复原算法的主要功能是处理模糊的三维问题。&而不是减去模糊的，他们试图重新分配模糊的光，以适当的对焦位置。&这是通过反转所固有的成像系统中的卷积运算进行的。&如果成像系统被建模为与点扩展函数的对象的卷积，然后将原始图像的去卷积应该恢复的对象。&然而，该对象不能被完全因为固有的成像系统的基本限制和图像形成模型的恢复。&可以做的最好的是估计给定的这些限制的对象。&恢复算法估计的对象，以下，该对象的一个好的估计是1，当与点扩展函数的卷积，产生原始图像的逻辑。
此制剂的优点在于，在大矩阵（如三维图像栈）的卷积操作，可以计算非常简单地使用傅立叶变换的数学技术。&如果图像与点扩散函数被变换成傅立叶空间中&，该图像由点扩展函数的卷积可以简单地乘以它们的傅立叶变换来计算。&然后将得到的傅立叶图像能重新转化成真实的三维坐标。
逆滤波算法
待开发的第一个图像去卷积算法被称为逆滤波器&。&这种过滤器，随着他们的堂兄弟的正规化逆滤波器&，已自20世纪60年代受聘于电子信号处理，并首次应用到图像上世纪70年代末。&在大多数图像处理软件程序，这些算法去了各种各样的名字，包括维纳去卷积&，&正则化最小二乘法&，&线性最小二乘&，和吉洪诺夫-米勒正规化&。
通过拍摄图像的傅立叶变换，并通过傅立叶分割的逆滤波器函数变换的点扩散函数的。&因为在傅立叶空间中划分是反卷积在实际空间中的等价物，这是为了扭转产生的模糊图像的卷积的最简单的方法。&的计算是快速的，约快如上面所讨论的二维去模糊的方法。&然而，这种方法的实用性是由噪声放大的限制。&在傅立叶空间划分，在傅立叶噪音小的变化变换通过除法运算放大。&其结果是，模糊消除受到损害作为对在噪声增益的折衷。&此外，被称为振铃神器可以推出。
噪声放大和振荡可以通过使左右，导致了该图像的对象的结构的一些假设被减小。&例如，如果对象被认为是相对平滑的，嘈杂的解决方案具有粗糙的边缘可以被消除。&这种方法被称为正规化&。&正则逆滤波器可以被描述为适用某一种约束就可能估计，给出关于对象的一些假设的统计估算：在这种情况下，平滑度。&在光滑的约束使得算法来选择一个合理的估计出大量可能出现，因为噪音变异可能估计。
正则可以在一个步骤中施加于逆滤波，或者可以重复地被应用。&其结果通常是平滑（剥离了更高的傅立叶频率）。&多的图像中被移除的&粗糙度&的发生在傅立叶频率远远超出了分辨率极限，因此，该方法不消除记录的的结构。&然而，因为有详细的损失的电位，反向滤波器的软件实现通常包括一个可调节的参数，使得控制平滑和噪声放大之间的折衷的用户。
约束迭代算法
为了提高逆滤波器的性能，各种附加的三维算法可以应用于图像恢复的任务。&这些方法被统称为约束的迭代算法&，并工作在连续循环（因此，术语&迭代&）。&此外，这些算法通常也适用于可能的解决方案，这不仅有利于减少噪声和其他失真，而且还增加了电源恢复模糊信号的限制。
一个典型的约束迭代算法操作如下。&首先，对象的初始估计被执行，它通常是将原始图像本身。&估计，然后用点扩散函数的卷积，和由此产生的&模糊预测&与原来的原始图像进行比较。&这种比较是用来计算，代表有类似的模糊估计是原始图像的误差标准。&通常被称为品质因数&，该误差准则，然后用于改变的估计值以这样一种方式，该误差减小。&一种新的迭代然后发生：新的估计是卷积的点扩散函数，一个新的误差准则计算，依此类推。&最佳估计将是一个最小化的误差标准。&作为算法的进行，每次误差准则被确定为不被最小化时，新的估算，再次模糊，误差准则重新计算。&重复整个过程，直到误差准则最小化或达到定义的阈值。&最终恢复的图象可以是在最后一次迭代的对象的估计。
在图2中所给出的数据从含有70光学切片的三维图像堆栈被采纳，并通过单一XLK2细胞记录，以0.2微米的间隙。&一个宽视场，搭载了高数值孔径（1.40）油浸物镜，被用来采集图像。&左侧图像（图2（a）所示，标记的原始数据&）是从三维堆叠采取任何数据处理的应用程序之前，单个焦平面中。&通过去模糊最近邻点算法产生的图像中显示的结果标记为最近邻&（图2（b））。&第三图像（图2（c）中，&老式&）示出恢复由一个商业销售约束的迭代解卷积软件产品的结果。&既去模糊和恢复提高对比度，但在信号与噪声的比率是显著较低的去模糊的图像比在恢复图像。&在图2（c）中的标尺表示2微米的长度，并且将箭头（图2（a））表示的线图在图4中呈现的位置。
大部分的算法目前应用于光学图像的反卷积从纳入约束允许的估计范围。&通常使用的约束被平滑化或正则化，如上面所讨论的。&随着迭代过程中，算法将趋于放大噪音，因此大多数实现抑制这种与平滑或正则过滤器。
另一种常见的限制是非负性&，这意味着，在估计该迭代过程中变为负的任何像素值被自动设置为零。&像素值经常可以变成负的算法中进行傅立叶变换或减法运算的结果。&非负约束是现实的，因为对象不能有负面的荧光。&它本质上是可能的估计值约束，考虑到我们的对象的结构的知识。&其它类型的约束，包括边界约束的像素饱和，对噪声统计的约束，和其他统计的约束。
经典算法约束迭代反卷积
约束迭代反卷积算法，在拍摄的图像中第一个应用程序是基于对杨松-范Cittert（JVC）的算法，首先开发用于光谱应用程序的过程。&阿加德后来在一个具有里程碑意义的一系列调查修改这个算法的数字显微镜图像分析。&商业公司如Vaytek，智能成像创新，应用精密，卡尔蔡司，和位面目前市场阿加德的改进算法的各种实现。&此外，几个研究小组已经开发已经销售的Vaytek和Scanalytics一个正规化的最小二乘方最小化方法。&这些算法利用一个加法或乘法误差准则来更新估计在每一次迭代。
统计迭代算法
迭代算法的另一个家庭使用从统计理论。&可能性&，概率的反向变化，采用最大似然估计（MLE），并期望最大化（EM）借来概率误差准则由SVI，位平面，即兴，卡尔实施市售算法蔡司和Autoquant。&最大似然估计是在科学的许多分支应用的普及统计工具。&一个相关的统计度量，最大熵（ME&-不要与期望值最大化，EM混淆）已经在图像去卷积实施由。
统计算法比传统方法更密集计算，可以采取显著更长的时间才能达成解决方案。&然而，他们可能图像还原到稍高程度的分辨率的比经典的算法。&这些算法也有它们强加给预期的噪声统计（实际上，泊松或高斯分布）的限制的优点。&因此，统计算法比单纯的正则更为微妙的噪音政策，以及它们可能产生的噪声图像效果更佳。&然而，适当的噪声统计的选择可能依赖于成像条件，以及一些商业软件包比其他人在这方面更加灵活。
盲解卷积算法
盲解是一个相对较新的技术，大大简化了反褶积的应用对于非专业，但该方法尚未广泛使用在商业领域。&该算法通过改变最大似然估计过程，这样不仅上述目的，但也点扩散函数估计开发。&使用这种方法时，对象的初始估计是由与估计，然后与从所述成像系统的参数计算得到的理论点扩散函数的卷积。&所得到的模糊估算是与原始图像相比，进行校正计算，并且该修正被利用来产生一个新的估计，如上所述。&此相同的校正也适用于点扩散函数，生成一个新的点扩散函数的估计。&在进一步的迭代，点扩散函数估计和预测对象一起更新。
盲解工作得很好，不仅对高品质的图像，还对噪声的图像或来自球面像差的痛苦。&该算法与理论点扩散函数的开始，但它适应于特定的数据被卷积。&在这方面，它免去了用户从实验获得了高品质的经验点扩散函数的艰难过程。&此外，由于算法调整的点扩散函数的数据时，它可以部分地校正球面像差。&然而，这种计算校正应该是最后的手段，因为它是更为可取的图像采集过程中尽量减少球面像差。
采用三种不同的处理算法，以相同的数据集的结果示于图3。&原来的三维数据是用广角（1.25 NA油浸物镜）0.4微米的z轴的步骤获得了果蝇胚胎腿192的光学部分。&该图像表示从所述三维堆叠中选择一个单一的光学部分。&原始（原始）图像示于图3（a）所示。&去模糊的一个近邻算法，结果将显示在图3（b），与灰霾去除95％的设置处理参数。&去卷积之后的同一图像切片示出由逆（维纳）滤波器（图3（c）），并通过迭代盲解卷积（图3（d）），掺入一种自适应的点扩散函数的方法。
共聚焦和多图像解卷积
如可预期的，但也可以用来恢复用共焦或多光子光学显微镜获得的图像。&和反褶积技术的结合提高了超出一般可达到与单独的技术解析。&然而，解卷积共聚焦图像的主要好处是没有那么多的重新分配，作为出焦光，从而导致降低噪声平均。&多光子图像的去卷积也被成功地用于去除图像失真和提高对比度。&在所有这些情况下，必须小心将适当的点扩散函数，尤其是当共焦针孔孔径是可调节的。
解卷积算法的实现
处理速度和质量显着影响，如何在给定去卷积算法由软件来实现。&该算法可以的方式，减少迭代次数，加快融合，以产生稳定的估计行使。&例如，未优化杨松-范Cittert算法通常在50和100之间的迭代需要收敛到一个最佳的估计。&由预滤波的原始图像，以抑制噪声并与所述第一2次迭代的附加误差校正标准，算法收敛在仅5至10次迭代。&此外，平滑滤波器，通常引入每5次迭代，以减少噪声的放大。
当使用一个经验点扩散函数，使用噪点极少的高品质的点扩散函数是至关重要的。&无反褶积包目前在市场上使用直接从记录&原始&的点扩散函数。&相反，该包包含前处理例程，降低噪声并执行径向对称性通过计算点扩散函数的傅里叶变换。&许多软件包也执行轴对称的点扩散函数，因此假设不存在球面像差。&这些步骤降低噪声和畸变，并使得在修复体的质量有很大的差异。
去卷积算法的实现的另一个重要方面是将原始图像的预处理，通过例程，如背景减除，平场校正，漂白校正，和灯的抖动校正。&这些操作可以提高信号噪声比和消除某些类型的文物。&大多数商用软件包包括这样的操作，用户手册应征询其实施的具体方面的详细说明。
其他卷积算法实现问题的关注数据表示。&图像可以被划分为子卷或表示为整个数据块。&个别的像素值可以被表示为整数或浮点数。&傅里叶变换可以表示为浮点数或复数。&在一般情况下，更忠实的数据表示，去卷积的图像需要更多的计算机存储器和处理器时间。&因此，存在计算速度和恢复的质量之间的折衷。
迭代恢复算法从两个去模糊算法和共聚焦，因为它们不删除失焦的模糊，而是试图将其重新分配到正确的图像平面不同。&以这种方式，出焦信号被利用，而不是被丢弃。&恢复后，荧光结构内的像素强度增加，但是每个图像堆栈的总相加强度保持不变，如在以前的模糊区域的强度减弱。&模糊在对象的周围的细节发生向回移动到焦点，从而导致从背景的对象和更分化的更详细的定义。&更好的对比度和更高的信号 - 噪声比，也通常在同一时间完成。
这些性能示于图2中，在那里它被证实恢复提高了图像的对比度，并随后使更高分辨率的对象，而不发生在去模糊方法引入噪声。&或许更重要的是用于图像分析和定量，在原始图像中的信号的总和是相同的，在去卷积图像。&当正确实施，图像复原方法保持总信号强度却提高了调整的信号位置（图4）的对比。&因此，恢复图像的定量分析是可能的，并且，由于改进的对比度，经常期望的。
图形化的情节在图4中给出表示（线的位置在图2中箭头所示方向（一））沿横线穿过图2中所示的单元的像素的亮度值。&原始数据由绿线，由蓝线的去模糊的图像数据，并通过红线的恢复图像数据表示。&在数据是显而易见的，去模糊引起显著损失像素强度在整个图像，而恢复结果中强度的试件的细节的区域的增益。&图像强度的类似损失所看到的去模糊方法发生任何二维滤波器的应用。
当与广角镜配合使用，迭代重建技术是光效。&这个方面是最有价值的光限定的应用，如高清晰度，其中对象通常是小的，并且包含少量的荧光基团，或在活细胞荧光成像，其中曝光时间是由活细胞的极端敏感性，光毒性的限制。关注今日：29 | 主题：284330
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【求助】荧光定量 PCR扩增曲线异常，超奇怪，连专业人员都很困惑
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这个帖子发布于9年零302天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
扩增漂亮的是 标准品（含目的基因的质粒），起始荧光背景高的是样品（从肾脏用TRIZOL提RNA，反转录CDNA），用REAITIME产物跑了电泳，目的带 很亮且特异。并且这些模板都用普通PCR检测均有目的带，病毒含量应该很高的，难道是模板不纯抑制了。望各位前辈赐教，谢谢
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REAITIME产物跑的电泳，最右为阳性对照
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融解曲线结果，没有杂峰
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liuqiaoran edited on
分析可能 模板太浓，稀释10倍100倍1000倍，结果如图，稀释后有所转好，但CT值很大了，这样的结果可信吗？并且三者检测结果不成１０倍梯度关系。待测得病毒含量低的样品稀释后其不测不出了(敏感性标准品为10*1拷贝数）
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模板释10倍100倍1000倍，REAITIME产物跑电泳结果如图从左到右：1000---100--10---阳性对照，梯度挺明显的呀
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怀疑是用TRIZOL从肾脏提RNA右问题，跑电泳如图从左到右：RNA三条带，15000MARKER(没跑开）。RNA完整性很好，用分光光度计测的２６０／２８０为１．８。纯度也没有问题，难道是反转录CDNA过程有问题，可都是按说明书一步一步做的，普通PCR电泳图很好的呀
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普通PCR电泳图
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没人回应呀
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看起来是样本提纯的问题，之所以浓度高的样本扩增曲线没有分得太开，可能的原因是样本不纯，存在很多其他的双链，导致荧光染料内插进双链发光，所以背景很高，虽然扩增结束后融解曲线有明显的峰，但背景高导致扩增产物经过很多循环其表征的荧光信号才能超越背景。稀释后杂质也相应减少了，所以背景有降低，曲线背景和平台期区分得更明显些。其实Ct值在13～30之间都可以采用，只是模板浓度越低，样本稀释等问题越容易导致结果不准确。事实上，一般检测1000拷贝一下的样本，使用realtimePCR的染料法要慎用了。在园子里检索一下，类似的问题有好多。
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谢谢，已经重新提模板了，希望有所改善
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即送15丁当
【求助】荧光定量熔解曲线结果不稳定
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请教一下大家，我刚做荧光定量PCR，第一次做A基因时，扩增曲线和熔解曲线都很好，Ct值在27-28之间，Actin也出的很好，但是我没跑电泳核对产物大小；第二次我重复之前的条件又做，熔解曲线就出现了两个峰，我怀疑是引物有污染，于是更换了新分装的引物和水，今天又做，五个组别，还是都出的双峰。为什么条件没变，熔解曲线差这么大呢？我已经更换了引物和水，结果还是双峰，说明不是污染的原因吗？下面熔解曲线图是我第一次好的结果和今天不好的结果，大家帮帮忙分析一下吧，谢谢！
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我也遇到同样的问题，求高手指点
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可以求助常州百代生物科技有限公司.cn/专业荧光定量PCR公司，有荧光定量PCR试剂盒，也可以做相关实验服务。2 qq：
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muziwen941600 我也遇到同样的问题，求高手指点 咱俩都摸索一下，有发现了沟通一下呗？
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我也遇到了这样的问题，请问您找到原因了吗？
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幽潭月映 我也遇到了这样的问题，请问您找到原因了吗？ 我后来换了退火温度，重新摸索的，就没事了。可能是之前的条件不稳定。
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