09-1409-1409-1409-1409-1409-1409-1409-1409-1409-14最新范文01-0101-0101-0101-0101-0101-0101-0101-0101-0101-0101-0101-0101-0101-0101-01(2011)第二部分 酶化学A5
&&&&第二章 酶 (a) 第二章 酶 (a)enzymes第一节（一）、酶的定义酶学概论一、 酶的定义和认识过程 enzyme是希腊文 en = in ， zyme = yeast 酶是生物体活细胞产生的具有特殊催化活性和特定空间 构象的生物大分子，包括蛋白质及核酸。 酶是一&&&&类具有高效率、高度专一性、活性可调节的生物 催化剂。 酶(enzyme)核酶(ribozyme)脱氧核酶(deoxyribozyme)二 酶催化剂的特点：1、与一般催化剂的共性① 催化效率高，用量少（细胞中含量低)。② 加快反应速度但不改变化学反应平衡点（不改变平 衡常数）。只加快正反应速度吗
δg°=-rtlnkeq`= -nfδe° ` ③ 降低反应活化能。 活化能：在一定的温度下，1mol分子全部进入其活 化态所需要的自由能。 正 v 10→100 逆 v 5→50④ 反应前后自身结构不变。o6-甲基鸟嘌呤甲基转移酶removes the methyl group. the methyl group is transferred to the protein itself, inactivating the protein.2.酶作用的特性（1）、催化效率更高（高效性）酶催化反应速度是相应的无催化反应的108-1020倍，并且高出非酶催化反应速度至少几个数量级。碳酸酐酶是目前已经知道的催化反应速度最快的酶之一。每个碳酸酐酶分子每秒能 够催化6×105个co2, 碳酸酐酶催化上述反应的速度比非酶催 化的上述反应速度快107倍。转换数（turnover number, tn or kcat） vmax= kcat[e]一级反应速率常数,催化常数酶被饱和时，每秒钟，每个酶分子转换底物的分子数(微摩尔数），或每秒钟每摩尔酶转换底物的摩尔数(微摩尔数） 。酶催化剂的特点(续)（2）专一性高是酶对底物的一种选择性 是酶和一般催化剂最重要的差别 决定于酶活性中心的催化部位或全酶的脱辅酶部分酶催化剂的特点(续)（3）反应条件温和（酶易失活：酶的敏感性）常温、常压，中性ph环境。（4） 活性可调节别构调节、酶的共价修饰、酶的合成、活化与降解等。 一些蛋白质可作抑制剂：豆类中的胰蛋白酶抑制剂(对 豆类本身蛋白质分解无关)，鸡蛋里面的抗生物素蛋白（5）酶的催化活性需要辅酶、辅基、金属离子酶催化剂的特点(续)1. 酶的催化效果是由于（ ） 单选或多选2010浙江大学生物化学a.增加反应底物和产物的自由能差 b.降低反应底物和产物的自由能差c. 减少反应所需的能量d. 增加反应所需的能量2. 关于酶的陈述正确的是（b.）a. 酶的浓度必需和底物的浓度一致才有催化效果增加了反应的平衡常数，因此有利于反应c. 酶加快了底物向产物转化的速率 d. 酶确保把全部底物转化为产物e. 酶确保产物比底物更好的热稳定性f. 酶可以降低底物向产物转化的活化能 g. 酶在反应过程中会被消耗。浙江大学生物化学抗生物素蛋白丙酮酸羧化酶苹果酸酶丙酮酸羧化酶-atp抗生物素蛋白奇数碳脂肪酸的氧化丙酰coa羧化酶反刍动物需要两种维生素:生物素和b12抗生物素蛋白乙酰coa羧化酶脂肪酸合成的限速步骤选择丙二酸单酰coa的意义思考常吃生鸡蛋有害身体健康，说明其中的原因解析：因为生物素可作为羧化酶的辅酶。生鸡蛋的蛋清中含 有抗生物素蛋白质（因子），它能抑制脂肪酸酸合成的限速 酶，即乙酰辅酶a羧化酶的活性，因为该酶需要生物素作为 辅助因子。如果细胞内脂肪酸合成受阻，会导致乙酰辅酶a 积累，从而转而生成酮体，产生轻度酮体症。当抗生物素因 子被降解后或排出后，一切恢复正常。 另外，在糖异生过程中，生物素是丙酮酸羧化酶的辅酶，丙 酮酸羧化酶催化糖异生的第一个反应，即丙酮酸生成草酰乙酸的反应。由于抗生物素因子可与生物素特异性高效结合，从而会阻断糖异生的过程。三、 酶的化学本质及其组成（一）酶的化学本质：绝大多数酶是蛋白质证据 （1）酸水解的产物是氨基酸，能被蛋白酶水解失活； （2）具有蛋白质的一切共性，凡是能使蛋白质变性的因 素都能使酶变性；（具有蛋白质的颜色反应）。
少数酶是rna（核酶：ribozyme ）(1) 80年代初,thomas cech 四膜虫l19rna具有生物催化功能,催化rrna前体的剪接 (2) 1983年 altman和pace e.coli rnase p中的rna具有加工trna前体的催化功能（二） 酶的化学组成据酶分子 组成分类单纯蛋白质酶类 (simple enzyme)： 酶蛋白（脱辅酶)） 结合蛋白质酶类(conjugated enzyme):辅助因子金属离子 小分子有机物（1）单纯蛋白质酶 ：多肽链除了氨基酸不含任何其他化学 物质如胰脏的核糖核酸酶、淀粉酶等、脲酶、脂肪酶。 （2）结合蛋白质酶： 蛋白质部分和非蛋白质部分组成，结 合蛋白质酶的蛋白质部分称为脱辅酶，非蛋白质部分称 为辅因子。脱辅酶与辅因子结合后形成的复合物称为 “全酶”酶的化学组成酶蛋白：决定反应的专一性和催化机制：量多 全酶辅助因子：传递电子、原子或某些化学基团的作用，决定酶促反应的类型和反应的 性质：量少辅 辅酶(coenzyme)：与酶蛋白结合较松，可透析或超过 助 滤除去。 （例如：nad nadp） 因 子 辅基(prosthetic group)：与酶蛋白结合较紧。不可透析或超过滤除去（fad） 一种酶蛋白一般只与一种辅助因子结合同种辅助 因子可与不同的酶蛋白结合全酶才有催化活性酶蛋白或辅助因子单独存在时都不具有活性，只有两者结合 组成全酶才有催化活性。一种酶蛋白只能与一种辅助因子结合成一种特异的酶，而一种辅助因子可以与多种酶蛋白结合成不同的特异酶。辅助因子金属离子:– –金属酶: 金属离子与酶结合紧密，提取过程中不易丢失。金属激活酶: 金属离子与酶结合得疏松。金属离子的作用：– – – –a. 传递电子； b. 在酶与底物之间起连接作用；c. 维持酶分子的活性构象；d. 中和阴离子。某些维生素与辅酶名称维生素b1 维生素b2 泛酸 维生素pp 维生素b6 生物素 叶酸 维生素c 硫辛酸 抗坏血酸别名硫胺素 核黄素 遍多酸 尼克酸和尼 克酰胺 吡哆醛、 吡哆胺 维生素h辅酶tpp fmn、fad hscoa nad+、nadp + 磷酸吡哆醛、磷 酸吡哆胺 thfa主要生理功能参与α-酮酸氧化脱羧 氢载体 酰基载体 氢载体 参与aa转氨、脱羧 羧化酶的辅酶 一碳基团载体 氧化还原作用 酰基载体、氢载体2009浙江大学生物化学名词解释: hscoacoenzymes & metabolism四、酶的命名和分类（一）酶的分类单体酶按亚基组成寡聚酶 多酶复合体多酶融合体1、单体酶：由一条或多条共价相连的肽链组成的酶分子牛胰rnase鸡卵清溶菌酶 胰凝乳蛋白酶124 a.a129 a.a 三条肽链单链单链酶的分类2、寡聚酶：由多个相同或不同亚基以非共价键连接的酶亚基之间以非共价键结合。①含相同亚基的寡聚酶：苹果酸脱氢酶（鼠肝） 2个 ②含不同亚基的寡聚酶：乳酸脱氢酶 4个亚基★大多数寡聚酶是胞内酶，而胞外酶一般是单体酶。天冬氨酸转氨甲酰酶（atcase）酶的分类3. 多酶复合体（multienzyme complex） ：若干个功能相关的酶缔合形成的结构和功能实体。其中每一个酶催化一个反应，所有反应依次进行，构成一个代谢途径或代谢途径的一部分。有利于化学反应的 进行，以提高酶的催化效率，同时便于机体对酶的调控。如：脂肪酸脱氢酶系、丙酮酸脱氢酶系多酶复合体所谓“多酶体系”是指一个代谢过程中几个酶形成一个反应链体系，多酶体系中的酶通常具有以下性质。 （ ） ① 只是在功能上相互有联系，在结构上互不相关，不存在相互作用；② 不仅在功能上相互有联系，在结构上也有相互联系， 形成复合体； ③ 上述两种情况都存在。中国科学院2002年多酶体系（multienzyme system）是：在完整细胞内的某一代谢过程中，由几个酶形成的反应体系。多酶体系与多酶复合体概念相同!（2版生化）多酶复合体上海交通大学2000举例(两个或以上)说明多 酶复合体中&长的灵活的臂&模式在催化中的作用大肠杆菌丙酮酸脱氢酶复合体由三种酶组成：4、多酶融合体（多功能酶、串联酶）一条多肽链上含有两种或两种以上催化活性的酶，往往 是基因融合的产物。生物进化中,外显子跳动产生的结果.有 利于酶的协同作用,提高催化效率. 例如：糖原分解过程中的脱支酶 a. 大肠杆菌聚合酶ⅰ b. 哺乳动物脂肪酸合酶 c. 哺乳动物乙酰-辅酶a羧化酶 d. 嘧啶合成的个别酶:真核生物中,合成途径的前三个酶和后两个酶各为 一个多功能酶,更有利于以均匀的速度 合成umpdebranching enzyme大肠杆菌的dna聚合酶ⅲ1. dna聚合酶工、ⅱ、ⅲ都属于多功能酶。 ( 是非题 )南京大学2000年2.何谓多酶复合体和多功能酶 试举例阐明两种酶的结构 体内有些酶彼此聚合在一起,组成一个物理的结合体,此特点及其在代谢中的作用.(10分) 结合体称为多酶复合体.若把多酶复合体解体,则各酶的催化 活性消失.(2分)。一个酶分子中存在多种催化活性部位的酶 称为多功能酶.多功能酶在分子结构上比多酶复合体更具有优越性,因为相关的化学反应在一个酶分子上进行,比多酶复合体更有效.(2分)上海交通大学医学院学期大肠杆菌的dna聚合酶ⅰ多酶复合体:丙酮酸脱氢酶复合体.催化丙酮酸生成乙酰 coa的反应.含3个酶,五个辅酶.包括丙酮酸脱氢酶,二氢硫辛酸 乙酰转移酶及二氢硫辛酸脱氢酶.参与的辅酶有tpp,硫辛 酸,fad,nad+,辅酶a.(3分) 多功能酶: dna聚合酶ⅰ为一条多肽链上具有三种酶的 活性.其大片段称为klenow片段,具有两种催化活性,一为5′→3′ 的dna聚合功能,另一为3′→5′外切酶的活性,从3′端水解dna 产生3′单核苷酸,这种3′→5′外切酶活性对保证dna复制的真 实性具有重要的意义.小片段则具5′→3′外切酶的活性,它能从 5′→3′方向一个挨一个切除,产物为5′单核苷酸,或跨过若干个 核苷酸再进行酶解,从5′末端释放一寡核苷酸.可除去冈崎片段 5′端的rna引物和在dna损伤修复中起重要的作用.(3分)四、酶的命名与编号习惯命名1. 依据底物来命名（绝大多数酶）蛋白酶、淀粉酶2. 依据催化反应的性质命名：水解酶、转氨酶 3. 结合上述两个原则命名：琥珀酸脱氢酶。 4. 有时加上酶的来源胃蛋白酶、牛胰凝乳蛋白酶 习惯命名法不够系统，不够准确，难免会出现一酶 多名或一名多酶的现象。为此1961年国际酶学委员会（enzyme commission，ec）提出了系统命名法。系统命名系统名应包括底物名称,反应性质以及反应名称,最后加 “酶”字。若作用的底物有两种,则须同时列出,并用&:&将其隔开;若作用物之一为水,则可略去.底物的名称必须确切,l,d型及a,b型均应列例如：-酮戊二酸 + 丙氨酸谷氨酸 + 丙酮酸习惯名称:谷丙转氨酶系统名称:丙氨酸：-酮戊二酸氨基转移酶酶的国际系统分类法及编号（ec编号）类 别水解酶 hydrolases 氧化还原酶 oxidoreductases 转移酶 transferases占总酶比例%26 27 24利用率%65 25 5裂合酶 lyases 异构酶 isomerases连接酶 ligases12 56~5 ~1~1酶的国际分类1.氧化还原酶类：催化氧化还原反应（最大的一类酶） 通式：ah2+b→bh2+a 其中：a为质子供体，b为质子受体 如：乳酸脱氢酶催化的反应： 乳酸＋nad+→丙酮酸＋nadh2 2. 转移酶类：催化底物之间基团的转移反应. 通式：ar+b→br+a 其中：r为转移基团，r不为2h 如：己糖激酶、转氨酶、脂酰转移酶、糖基转移酶等酶的国际分类3. 水解酶类：催化底物的水解反应通式：ab+h2o→ah+boh 如：淀粉酶，脂肪酶，蛋白质酶等4. 裂合酶类：催化底物裂解或缩合反应（可逆），通式： ab→a+b 如：醛缩酶，水合酶，脱氨酶等。醛缩酶酶的国际分类5.异构酶类：催化同分异构体底物之间相互转换通式：a→b 其中：a、b为同分异构 如：磷酸甘油酸变位酶、6-磷酸葡萄糖异构酶等。磷酸甘油酸变位酶酶的国际分类6. 合成酶类：也称连接酶类，催化两种或两种以上化合物合成一种 化合物的反应。反应需吸收能量，通常与atp的分解相偶 连，atp分解产生能量用于合成反应。 通式：a+b+atp→ab+adp+pi 或 a+b+atp→ab+amp+ppi如：乙酰辅酶a羧化酶催化的反应：ch3coc0a+co2+atp→hoocch2coc0a+amp+ppi合成酶与裂合酶的差异就是前者的合成反应需要atp(判断）2009中山大学生物化学酶的国际分类氨基酸+atp+trna→氨基酰-trna+amp+ppi氨基酰-trna合成酶酶的国际分类碳酸酐酶催化反应co2+h2o→h2co3,则此酶属于:( ) a. 水解酶 b.转移酶 c.裂合酶 d.合成酶锌起催化作用的酶-碳酸酐酶和羧肽酶碳酸酐酶是已知转换数最高的酶之一dna聚合酶属于哪一类酶
酶的国际命名酶的系统编号：4位数字第一位：代表六大类反应类型 第二位：亚类（作用的基团或键的特点） 第三位：亚亚类（精确表示底物/产物的性质）第四位：在亚亚类中的序号乳酸脱氢酶 ec 1. 1. 1. 27第1大类，氧化还原酶 第1亚类，氧化基团choh 第1亚亚类，h受体为nad+ 该酶在亚亚类中的编号五、酶的专一性概念：酶只能催化某一化合物或某一类化合物，发生一定的化学变化，生成一定的产物。（酶对底物的选择性）两种类型 结构专一性氨酰-trna合成酶的专一性1、绝对专一性： 2、相对的专一性族专一性 键专一性立体异构专一性1 旋光异构专一性 2 几何异构专一性（一）、酶的专一性类型1、结构专一性(1) 绝对专一性 指酶对底物的要求非常严格,只作用于一种底物,而不作用于其它任何物质.指酶可作用于一类底物.如:脲酶只能催化尿素分解 生成氨和二氧化碳,而对尿素的衍生物甲基尿素 则不起作用.nh 2 c o nh 2h 2o 脲酶co 2 + 2nh 3结构专一性（续）（2）相对专一性（relative specificity） 族专一性or 基因专一性具相对专一性的酶作用于底物时，对底物键两端的基团 要求的程度不同，对其中一个基团要求严格，对另一个则 要求不严格，这种专一性又称族专一性or 基因专一性。如 α-d- 葡萄糖苷酶，胰蛋白酶。 a—b 或 a— b 键的专一性有一些酶，只要求作用于一定的键，而对键两端的基团 并无严格的要求。这种专一性称键的专一性。如脂肪酶o r 1c or 2 + h 2o酯酶r 1cooh + r 2oh2. 立体异构专一性(1) 旋光异构专一性例如l—氨基酸氧化酶只能催化l—氨基酸氧化，而对d— 氨基酸无作用(2)几何异构专一性当底物具有几何异构体时，酶只能作用于其中的一种。例如， 琥珀酸脱氢酶只能催化琥珀酸脱氢生成延胡索酸（反－丁烯二酸）立体专一性在实践中的应用全世界手性药物需求逐年上升00
300 0(unit: 100 million $) 614 706 812 934 95 98 021600200517182008氯霉素消旋体中(r，r)－氯霉素有活性，而对映体 4 (s，s)－氯霉素则无活性。沙立度胺事件沙立度胺（反应停，thalidomide）事件，发生在20 世纪60年代，欧洲用该药缓解妊娠妇女的孕吐反应。 r(+)-和s-(-)-沙立度胺都有镇静作用，可用于缓解妊娠妇女 的晨吐反应，因而我国仿制时将 其称为“反应停”。该药s-对映体有致畸性，而r-对映体无致畸性，但同样有镇静作 用，如当初将消旋体拆分， 单用r-对映体就可避免此畸 形惨祸。(二)酶作用专一性假说lock and key modelemil fischer (1890) 认为整个酶分子的天然构象是具有刚性结构的， 酶表面具有特定的形状。酶与底物的结合如同 一把钥匙对一把锁一样酶作用专一性假说2、诱导契合学说（induced-fit hypothesis)（koshland，1958）：酶活性中心的结构有一定的灵活性，当底物（激活剂或抑制剂）与酶分子结合时，酶蛋白的构象发生了有利于与底物结合的变化，使反应 所需的催化基团和结合基团正确地排列和定向，转入有效的作用位臵。酶作用专一性假说3、“三点结合”的催化理论认为酶与底物的 结合处至少有三个点，而且只有一种情况是完全 结合的形式。只 有这种情况下， 不对称催化作用才能实现。“三点结合”的催化理论酶能区分从有机化学观点来看是属于对称分子中两个等 同 的基团，只催化其中的一个基团，而不催化另一个。顺乌头酸酶催化的立体异构专一性：什么是酶的活性部位，如何解释酶的专一性2009年中科院生物化学与分子生物学六、酶的活力测定与分离纯化（一）、酶活力、活力单位和比活力1、酶活力：在一定条件下，酶催化某一反应的反 应速度（一般测初速度）的能力。酶促反应速度：单位时间、单位体积中底物的减少量或产物的增加量。 单位：浓度/单位时间 2、酶的活力单位（u）（表示酶量多少）活力单位：一定时间内将一定底物转化成产物所需要酶量 如何测定酶的多少（含量）酶的活力单位（u）（表示酶量多少）（1）、习惯单位：人们习惯沿用的单位，表示方法不统一。 如：淀粉酶的活力单位可用每小时催化1克淀粉的酶量表示 （1g/hr）。 也可用每小时催化1ml 2% 淀粉所要的酶量表示。 （2）. 国际单位iu:( international unit）：在最适条件下，每 分钟内催化1微摩尔（μmol）底物转化为产物的酶量为一个酶活 力单位。既：1iu = 1μmol/min （3）. 国际单位kat单位（katal）：每秒钟能催化1摩尔 （mol）底物转化为产物的酶 量定为一个kat单位。既： 1kat = 1mol/s. kat与iu的换算如下：1kat = 60×106 iu3、酶的比活力酶的比活力specific activity纯度的重要指标定义：每毫克酶蛋白所具有的酶活力。单位：u/mg蛋白质。酶的比活力是分析酶的含量与纯度的重要指标。比活力=活力u／mg蛋白=总活力u/总蛋白mg 所以，酶的定量就是测定酶的活力，也即测定酶 促反应的速度什么是酶的活力和比活力2009年中科院生物化学思考题1. 称取25mg蛋白酶粉配制成25毫升酶溶液，从中取出0.1毫升酶液，以酪蛋白为底物，用folin-酚比色法测定酶活力，得知每小时产生1500微克酪氨酸。 另取2毫升酶液，用凯氏定氮法测得蛋白氮为0.2毫克 （蛋白质中氮的含量比较固定：16％）。若以每分钟 产生l微克酪氨酸的酶量为1个活力单位计算。根据以上数据求：（a）1毫升酶液中所含蛋白质量及活力单位。（b）比活力。 （c）1克酶制剂的总蛋白含量及总活力。思考题答（1）蛋白浓度=0.2×6.25mg/2ml=0.625mg/ml；活力单位= (1500微克/60min) ÷ 0.1ml=250u（2）比活力= ml/0.1ml÷0.625mg/ml=400u/mg （3）总蛋白=0.625mg/ml×1000ml=625mg； （4）总活力=625mg×400u/mg=2.5×105u。思考题分析(1)由题意可知,2ml酶液中含氮0.2毫克,则1ml酶液中含 氮0.1g.因为蛋白质的平均含氮量为16%,所以0.1氮相当于蛋白质 的量为0.1 / 16%=0.625(毫克),即1毫升酶液中所含的蛋白质量 为0.625g.又知0.1ml酶液每小时产生1500mg酪氨酸.根据定义: 每分钟产生1mg酪氨酸的酶量为1个活力单位(或一个酶单位u). 因此,1毫升酶液所含的酶单位为1500×10 / 60=250(u). (2)酶比活力是指每毫克酶蛋白所具有的酶活力,一般用单位/毫 克蛋白表示. 0.625毫克酶蛋白含有250酶单位,那么,1毫克酶蛋 白含有的酶单位数为:250×1 / 0.625=400(酶单位/毫克酶蛋白) (3)由题意可知每毫升醇含1毫克蛋白酶粉(酶制剂).由(1)得到每 毫升酶制剂含0.625毫克酶蛋白,所以每克酶制剂含0.625克酶蛋 白.又因为总活力=比活力×酶蛋白总量,即总活力 =400×625=2.5×105(酶单位)思考题2. 有一克淀粉酶制剂，用水溶解成1000毫升，从中取出1 毫升测定淀粉酶活力，测知每5分钟分解0.25克淀粉，计算 每克酶制剂所含的淀粉酶活力单位数(已知淀粉酶活力单位 的定义为：在最适条件下每小时分解l克淀粉的酶量称为1个 活力单位。提示：已知：lml酶制剂相当于1mg酶制剂，根据酶活力单位定义： 每小时分解1克淀粉的酶量为1个活力单位，则lmg酶 制剂每小时分解淀粉的酶的活力单位=0.25g/5分钟 ×60÷1=3活力单位 每克酶制剂所含活力单位=3个活力单位 ×活力单位思考题3. 称取50mg商品蛋白酶粉，配制成25ml酶溶液。取出0.1ml酶液，在以酪蛋白为底物的测活体系中检测蛋白酶活力，得知，30min后，可以产生900μg的酪氨酸(tyr);另取5ml酶液，用凯氏定氮法测得蛋白氮为0.40mg。以每分钟产生1μgtyr的酶量为1个活力单位，请计算：(1)每ml的酶溶液的酶活力;(2)酶的比活力;(3)1克样品所具有的总活力单位。厦大研究生2007（二）、反应速率、初速率和酶活力测定1. 化学反应的速率及其测定：测产物分光光度法(spectrophotometry) 利用底物和产物在紫外或可见光部分的光吸收的不同。 例: 人血清乳酸脱氢酶活力的测定l-乳酸 + nad+ 乳酸脱氢酶丙酮酸 + nadh + h+荧光法(fluorometry) 酶蛋白分子中的tyr、trp、phe残基以及一些辅酶。电化学法和同位素法分光光度法测乳酸脱氢酶活力ldh可溶于水或稀盐溶液。组织中ldh含量测定方法 很多，其中紫外分光光度法更为简单、快速。鉴于nadh, nad+ 在340nm及260nm 处有各自的最大吸收峰，因此 以nad+为辅酶的各种脱氢酶类都可通过340nm光吸收值 的改变，定量测定酶活力，如苹果酸脱氢酶、醇脱氢酶、 醛脱氢酶、甘油－3－磷酸脱氢酶等。 测乳酸脱氢酶活力，是在一定条件下，向含丙酮酸及 nadh的溶液中，加入一定量乳酸脱氢酶提取液，观察 nadh在反应过程中340 nm 处光吸收减少值，减少越多 ，则ldh活力越高。其活力单位定义是：在25℃，ph7.5 条件下每分钟a340下降值为1.0的酶量为1个单位2. 反应初速率的概念及其条件（1）、测初速度（底物变化量不能超过5%；不超过5分钟）①测初速度原因：（a）底物浓度的降低、产物的增加而造 成的逆反应的加快。（b）产物的抑制作用（c）酶本身的逐渐失活 （d）ph改变②反应速度：单位时间、单位体积中底物的减少量或产物的增加量。3. 酶的活力测定反应初速率的条件（1）[s]远大于[e]:[s]在5km以上，并非越多越好 初速度与[s]呈零级反应 初速度与[e]呈一级反应（2）外界条件：最佳温度、最佳ph、最佳离子强度（3）反应体系有适宜的辅助因子、激活剂酶的活力测定（1）反应进程曲线：是指酶反应时间与产物生成量(或底物减少量)之间的关系曲线。在酶反应的最初阶段里，底物或产物的变化量一般随反应时间而线性地增加，反应速度恒定 。换言之，测定酶活力应该在进程曲线的初速度时间范围内进行。（2）酶浓度曲线：初速度-酶浓度曲线，确定线性关系的酶浓度（3）对照：酶失活反应进程曲线（二）、酶的分离纯化 酶的分离纯化即蛋白质的分离纯化：包括酶 制剂的浓缩与纯化。 判断分离提纯方法的优劣的两个指标： 总活力的回收， 比活力的提高。酶的分离纯化：低温下进行！ 选材 保存 破碎 结晶 抽提 分离纯化酶的分离纯化 p41 总活力=活力单位数/ml酶液×总体积（ml） 比活力=活力单位数/ml蛋白（氮）=总活力单位数/总蛋白（氮）mg每次比活力
纯化倍数＝ 第一次比活力每次比活力 回收率（产率）＝─────── × 100% 第一次比活力酶的提纯过程中，总蛋白减少，总活力减少，比活力增高。由于酶的特殊性，在纯化过程中要注意1．全部操作在低温0～4℃。2．在分离提纯过程中，不能剧烈搅拌3．在提纯溶剂中加一些保护剂，如少量edta、少量β-巯基乙醇。4．在分离提纯过程中要不断测定酶活力和蛋白 质浓度，从而求得比活力，还要计算总活力。 酶分离纯化的一般原则(1) 酶原料的选择 (2) 选择有效的纯化方法 (3) 防止酶失活变性 (4) 酶活性的测定贯穿纯化的始终思考题1020 1801809思考题(课后11）11. 1g 鲜重的肌肉含有 40 单位的某种酶，其转换数为6×104 min-1，试计算该酶在细胞内浓度（假设新鲜组织含水 80%，并且全部在细胞内）。[8.33×10-7mol/l]解： 40 单位=40 μmol/min,(1): 酶量 = 40 μmol/min÷6×104 min-1 = a(μmol)=a×10-6mol(2): 体积：1g 鲜重的肌肉含水 80%=0.8g=0.8×10-3 =b(l) （3）所以浓度=a×10-6mol÷bl= 8.33×10-7mol/l思考题(课后12）12.焦磷酸酶可以催化焦磷酸水解或磷酸，其相对分子质量为120×103 ，由6个相同亚基组成。纯酶的vmax 为 2800u/mg 酶。它的一个活力单位规定为：在标准测定条 件下，37℃、15min 内水解 10μmol焦磷酸所需要的酶量。 问：（1）每 mg 酶在每秒钟内水解多少 mol 底物 （2）每 mg酶中有多少 mol 的活性部位（假设每个亚基上 有一个活性部位）（3）酶的转换数是多少 解：1u= 10μmol/ 15min （1）2800u/mg=2800×10μmol/15分钟（单位换算） =a÷15 = bμmol/分钟=c÷ 60×106=d mol/秒 = 3.11×10-5 mol /秒思考题(课后12）（2）焦磷酸酶相对分子质量为 120×10 3 ，由 6 个相同亚基组成。每 mg酶有酶1÷120×103 =a(mmol)=a×10-3mol活性部位= a ×10-3mol×6= 5×10-8 mol活性中心（3）酶的转换数是多少 第一问：每 mg 酶在每秒钟内水解3.11×10 5mol底物 第二问：每 mg酶中有5×10-8mol活性部位 所以酶的转换数是（3.11×10-5mol /秒）÷ 5×10-8 mol活性中心=622 /秒3．酶的保存将酶制品浓缩，结晶，以便保存（-20） 注意：酶易失活，不可烘干。 可用的方法： (1) 低温保存浓缩的酶液：注意：酶溶液浓度越低越易变性，不能保存酶的稀溶液。思考题1、 酶的纯化过程中最需要关注的指标是(a. 总蛋白量变化和总活力变化)b. 蛋白质浓变化和比活力变化 c. 比活力变化和总活力变化 d. 总活力变化和蛋白质浓度变化中科院2006年2、在酶的分离纯化中最理想的结果是（a. 纯化倍数高，蛋白含量低 b. 回收率小但纯化倍数高 c. 蛋白回收率最高）d. 比活力最大思考题3 一个酶经多次纯化过程后，下列哪个说法正确:a. 总蛋白增加，比活力增高c. 总蛋白增加，比活力不变 e. 总蛋白减少，比活力降低b. 总蛋白增加，比活力减少d. 总蛋白减少，比活力增高 f. 总蛋白减少，比活力不变中国药科大学2005年生物化学4. 在测定酶活性时要测定酶促反应的初速度，其目的是: a. 为了提高酶促反应的灵敏度 b. 为了节省底物的用量 c. 为了防止各种干扰因素对酶促反应的 d. 为了节省酶的用量思考题5. 测定酶活性时要测定酶促反应的初速度,其目的是为了 a 为了节约底物 b 为了使酶促反应速度与酶浓度成正比 c 为了尽快完成测定工作 d 为了防止出现底物抑制e 为了使反应不受温度的影响6.酶促反应的初速度：a. 与[e](酶的浓度)成正比 b．与[s](底物浓度)无关c．与km(米氏常数)成正比 d．与[i](抑制剂浓度)成正比 7、酶的某次纯化后总活力提高了，可能原因是什么思考题8. 如果要从一种粗制酶中分离和纯化出α-淀粉酶， 并对其结 果进行评价，请你：① 写出该实验的主要纯化方法（至少3种 或3种方法以上）和简要步骤； ② 用什么指标评价该酶的纯化 质量和效率； ③ 介绍一种α-淀粉酶活性测定的原理和方法。 （12分）南京农业大学2006年硕士研究生考试生物化学试题 9. 称取50mg商品蛋白酶粉，配制成25ml酶溶液。取出0.1ml酶液，在以酪蛋白为底物的测活体系中检测蛋白酶活力，得知，30min后，可以产生900μg的酪氨酸(tyr);另取5ml酶液，用凯 氏定氮法测得蛋白氮为0.40mg。以每分钟产生1μgtyr的酶量为1个活力单位，请计算：(1)每ml的酶溶液的酶活力;(2)酶的比活力;(3)1克样品所具有的总活力单位。厦大研究生2007酶的活力测定华东师范大学基础生物化学考研真题（2007）判断10.1 酶活力的测定实际上就是酶的定量测定。 10.2 有1g粗酶制剂经纯化后得到10mg电泳纯的酶制 剂，那么酶的比活力较原来提高100倍。 10.3. nadh脱氢酶是指以nad+为辅酶的脱氢酶的 总称。 11. 请解释什么是酶的活力和比活力，并说出这两个 指标在酶的纯化过程中可以说明什么2008年江南大学酶的活力测定1. 酶促反应的初速度（a. 与温度成正比 c. 与[i]成正比）b. 与km成正比 d. 与[e]成正比2. 判断一个纯化酶的工作的重要指标是（a. 酶的纯度 c. 重复性 b. 活性回收率 d. 综合以上三种因素）厦门大学2009生物化学七、核酶(ribozyme)1、定义：核酶(ribozyme)是一类具有生物催化功能的rna 2、发现： (1) 1982年,美国的t.cech发现原生动物四膜虫的 26s rrna前体能够在完全没有蛋白质的情况下,自我加工, 拼接,得到成熟的rrna. 1986年,t.cech发现在一定条件下 , l19 rna 可 以 催 化 poly c 的 切 割 与 连 接 。 (2) 1983年,s.atman和pace发现,将rnase p的蛋白质与rna分离,发 现蛋白质部分没有催化活性,而rna部分具有与全酶相同的 催化活性.为此cech和altman共同获得了1989年度诺贝尔 化学奖。 核糖体23s rrna具肽酰转移酶活性2010年中科院生化与分子真题名词解释：核酶原生动物四膜虫的26s rrna自我加工第三次转酯反应第一次转酯反应第二次转酯反应l19 rna的催化作用ribozyme一词于1982年由thomas cech 首先提出的， 关于其译名有几个，如核糖酶、核酶、类酶rna 以及酶 rna等。目前，对此译名尚无定论，有待商榷。3、核酶的种类按作用底物方式不同分为，自然界现有（1）催化分子内反应的核酶，自我剪接核酶（四膜虫 rrna，需鸟苷和mg2+）自我剪切核酶 (不需鸟苷)（2）催化分子间反应rna的核酶。自我切割区内有锤头结构4、ribozyme发现的重大意义：（1）rna具有酶的催化活性，向酶的化学本质是蛋白质这 一 传统概念提出了挑战。 （2）在理论上，对于生物起源和生命进化的研究具有重要 启示。 （3）生物催化分子进化的可能性： rna rna-蛋白质 酶或辅基 蛋白质-rna 蛋白质 蛋白质-辅（4）在实践上，由于ribozyme的内切酶活性，可定点切割 mrna，破坏mrna，抑制基因表达，为基因、病毒和肿瘤治疗 提供了可行途径。rna worldrna可能是地球上最早的巨分子生物化学中把核苷酸酶称为核酶。（判断）南开大学2006八、 酶分子工程1. 化学修饰酶-----对纯酶进行化学修饰以改善性能 2. 固定化酶-----指被结合到特定支持物上并能发挥作用 的一类酶。是化学酶工 程中具有强大生命力的主干。 四种方法 吸附、交联、共价结合、包埋a、可以用离心法或过滤法很容易地将酶与反应液优点：分离开来。在生产中十分 方便有利 b、可以反复使用,达上千次,节约成本 c、稳定性能好3、抗 体 酶(abzyme)（一）抗体酶（abzyme）是指既是抗体又具有催化功能的一类特殊蛋白质。因为它是具有催化活性的抗体，故又称为“催化 性抗体（catalytic antibody）。 1986年richard lerrur and peter schaltz根据过渡态理论 和免疫学原理，运用单克隆抗体技术成功地制备了具有酶活性 的抗体，得到了抗体酶 。他们成功地关键是巧妙地利用了过渡 态类似物作为半抗原，再结合蛋白质成为结合抗原，然后免疫动物，制备单克隆抗体，经过筛选获得具有催化功能的抗体。名词解释：抗体酶2011年中科院生化与分子真题抗 体 酶(abzyme) 将抗体转变为酶可通过诱导法、拷贝法、引入法、化学修饰法等途径。– 诱导法是利用反应过渡态类似物为半抗原制作单克隆抗体， 筛选出具高催化活性的单抗即抗体酶。 – 拷贝法主要根据抗体生成过程中抗原-抗体互补性来设计的。（酶→抗体→抗抗体）– 引入法则借助基因工程和蛋白质工程将催化基因引入到特异抗体的抗原结合位点上，使其获得催化功能。– 化学修饰法对抗体进行化学修饰，使抗体与催化基团相连。抗体酶意义及应用抗体酶的应用前景： 1.为蛋白质结构的研究提供新手段 2.设计抗肿瘤等的新型生物药物 3.应用于工业制药（立体专一性抗体酶）这些抗体酶具有下列特点：1、可使所催化的反应加速 102-105倍；2、符合米氏方程式；3、具有专一性；4、催 化活性依赖于ph值、温度、并可被抑制剂抑制。抗体酶具有酶的一切性质（判断+）北京大学20044. 酶的蛋白质工程（1）、定义：在化学酶工程基础上发展起来的，是以 酶学和dna重组技术为主的现代分子生物学技术相结合的产物。 亦称高级酶工程。（2）、分类：（a）用dna重组技术大量地生产酶（克隆酶）（b）对酶基因进行修饰，产生遗传修饰酶（突变酶） （c）设计新的酶基因，合成自然界不曾有过的能稳 定、催化效率更高的新酶第9章 酶促反应动力学 概念研究各种因素对酶促反应速度的影响，并加以定量的阐述。
影响因素包括有
底物浓度：米氏方程 酶浓度：vmax=k3 [e]ｖ＝vmax[s]km + [s]
抑制剂：可逆抑制剂和不可逆抑制剂激活剂： ph：最适ph 温度：最适温度一. 化学动力学（一）、反应速度及其测定：（二）、反应分子数和反应级数1. 反应分子数单分子数 2分子数 3分子数 4分子数2. 反应级数及特征一级反应：反应速率与反应物的浓度的一次方成正比。 二级反应：反应速率与两种物质浓度的乘积成正比。 零级反应：反应速率与反应物浓度无关的反应。混合级反应：思考题1. 酶促反应的初速度不受哪一因素影响:a. [s]c. [ph]b. [e]d. 时间华南理工大学 2006年2. 在测定酶促反应的初速度时，酶促反应的初速度不受哪一因素影响不受哪一因素影响:a. [s]c. [ph]b. [e]d. 时间二、底物浓度对酶促反应速度的影响酶促反应动力学方程式 米氏方程（michaelis-mentent equation）:表示一个酶促反应 的起始速度（υ）与底物浓度([s])关系的速度方程 条件：单底物，单产物的反应理论基础：中间产物学说假设：反义速率(v)和[es]成正比 发展: (1) 最初.michaelis和menten 是根据“快速平衡 假说” 推出米式方程。 (2) 以后.briggs和haldane的“稳态平衡假说”及其对米式方程的发展：（一） 中间复合物假说中间产物学说认为：当酶催化某个反应时, 酶和底物 先结合形成一个中间复合物, 然后中间复合物再分解, 生成产物并释放出酶。一般以产物的生成速度代表整个 酶催化反应速度，而产物的生成取决于中间物的浓度. 因此, 整个酶促反应的速度取决于中间物的浓度.1903年henri用蔗糖酶水解蔗糖实验一 级 反 应v vmax[s]当底物浓度较低时：反应速度与底物浓度成正比关系； 反应为一级反应。混合级反应vvmax[s]随着底物浓度的增高：反应速度不再成正比例加速； 反应为混合级反应。零级反应v vmax[s]当底物浓度高达一定程度：反应速度不再增加，达最大速度； 反应为零级反应中间产物假说证据：（1）竞争性抑制实验（2）底物保护酶不变性 （3）结晶es复合物的获得。(4)底物和酶共沉降 （5） es复合物被电子显微镜或x-射线衍射法观 察到。中间产物假说证据思考：酶溶液加热时,随着时间的推移,酶的催化活性逐渐丧失.这是由于加热导致天然酶的构象去折叠.己糖激酶溶液维持在45℃12分钟后,活性丧失百分之五十.但是若己糖激酶与大量的底物葡萄糖共同维持在45℃12分钟,则活性丧失仅为3%.请解释,为什么在有底物存在下,己糖激酶的热变性会受到抑制答:酶-底物复合物比单独的酶更稳定.（二）. 酶促反应动力方程式1、米式方程的推导（1）早期的米氏方程基于快速平衡假说：三个假定① 在反应的初始阶段，[s]远远大于[e]，因此，[s]可以认为不变。 ② 因为研究的是初速度，p的量很小，由p+e es可以忽略不记。 ③ 游离的酶与底物形成es的速度极快（快速平衡），而es形成 产物的速度极慢，故[es] 的动态平衡与es
p+e没有关系 （既 k1、k2 ＞＞k3 ）③e
e&&&&① 2 k k4②早 年 的 米 式 方程e
e&&&&k2es的生成速度：k1（[et] - [es]）[s] es的分解速度：k2 [es]所以：k1（[et] - [es]）[s] = k2[es][ es ]
k 1[ e t ][ s ] k 2
k 3 [ es ] k 3 [ e t ][ s ]
v max [ s ] k s
[s ]ks现在称为底物常数表示对底物的亲和力ks =k2／k1（2）.briggs和haldane的“稳态平衡假说”其中两个同快速平衡假说的①和②相同 稳态平衡三个假说:① 在反应的初始阶段，底物浓度远远大于酶浓度,因此,底 物浓度[s]可以认为不变. ②因为研究的是初速度,p的量很小,由p+e →es可以忽略 为不变. 第③个不同：必须考虑[es]分解成产物p对于[es]动态平衡的影响稳态平衡假说的贡献在于发展了快速平衡学说的第③点。因为并不总是k3&&k2③k1 k 3 p
① k2 ②briggs和haldane 的“稳态平衡假说”所谓稳态是指反应进行一定时间后，es的生成速度和es的分解速度相等，亦即es的净生成速度为零，此时es的浓度不再改变，达到稳态，也称恒态。稳态理论下米氏方程的推导k1 k 3 p
k2自由酶： [e] = [et] - [es]es的生成速率 es的分解速率= k1( [e] - [es] ) [s]-= k2 [es] + k3 [es]等式k1( [e] - [es] )[s] = k2 [es] + k3 [es]稳态理论下米氏方程的推导提系数米 式 方 程[s]:底物浓度; v:不同[s]时的反应速度; vmax:最大反应速度(maximum velocity);km:米氏常数(michaelis constant)。 (不是反应平衡常数）当[s]《 km 时（一级反应） v vmax[s ]km
[ s ] vmaxvmax[s ]kmmax k ’s ] [当[s] 》km 时（零级反应） v [s ]km
[ s ]v[s ][s ]vmax当[s] = km 时v vmax[s ]km
[ s ]vmax22. 动力学参数的意义（1）. 米氏常数（km）的意义物理意义: 当反应速度达到最大反应速度（vmax)的一半时的底物浓度. 单位：mol· l-1或mmol· l-1km与酶的浓度无关① km是酶的特征常数之一。一般只与酶的性质、底物种类及反应条件有关，与酶的浓度无关。所以可以用于鉴定酶。对 于专一性不强的酶来说对于每一个底物都有一个相应的km值.②. 判断酶的专一性或最适底物（天然底物）同一个酶催化不同底物时km最小的底物称该酶的最适底物或天然底物蔗糖酶既可催化蔗糖水解(km=28mmol/l),也可催化棉子糖水解(km=350mmol/l),蔗糖为天然底物。v1/2vmax km [s]km能比较不同酶的催化效率吗酶1的底物在生物体内浓度为1mol/l 酶1的km值0.6mol/l 酶2的底物在生物体内浓度为1×10-6mol/l 酶2的km值0.6×10-6mol/l 酶1比酶2催化效率一定高吗 思考：不同酶的km值是否有可比性 合成维生素和酶和糖代谢酶的km③. 1/km 近似表示酶与底物亲和力k1 k 3 p
k2准确应用ks表示 ks =k2／k1★ ks是底物常数，只反映es解离趋势（底物亲和力）， 1/ks可以准确表示酶与底物的亲和力大小。 ★ 只有当k1 、 k2》k3时，km≈ks，因此，1/km只能近似 地表示底物亲和力的大小。 ★ 底物亲和力大不一定反应速度大（反应速度更多地与产物形成趋势k3／k1有关）★ 都是k3惹的祸判断问题：（1） km越小，底物亲和力越大（×）（2） ks越小，底物亲和力越大（√）（3） 天然底物就是亲和力最大的底物（×）（4） 天然底物就是km值最小的底物（√）（5） 底物亲和力越大酶促反应速度越大（×） （6） 对于不同的酶或同一种酶的不同底物，km越 小反应速度越大（×）米氏常数（km）的意义④、如果km知道，可以计算某一底物浓度时速度和最 高速度的比值。思考：如果要求酶促反应v=vmaxx90%，则s应为km的倍数是a、4.5 b、9 c、8 d、5 e、90上海交通大学2005⑤、推导某一代谢的方向
正逆反应方向：km小的反应方向趋势强 km最大的步骤常是限速步骤链式反应中的限速步骤：多条反应途径的方向：⑥：了解酶的底物在体内具有的浓度水平。对活细胞的试验测定表明，酶的底物浓度通常就在 这种底物的km 值附近，请解释其生理意义。为什么底 物浓度不是远远高于km 或远远低于km呢据 v-[s] 的米氏曲线，当底物浓度远远低于 km 值时，酶 不能被底物饱和，从酶的利用角度而言，很不经济；当底物 浓度远远高于 km 值时，酶趋于被饱和，随底物浓度改变， 反应速度变化不大，不利于反应速度的调节；当底物浓度在 km 值附近时，反应速度对底物浓度的变化较为敏感，有利于 反应速度的调节。另外，过高的底物浓度并不能明显提高反应速度，反而可能对细胞造成不良影响。米氏常数（km）的意义⑦ 判断可逆抑制剂的抑制类型。 竞争性变大，非竞争性不变，反竞争性减小 ⑧ 在测定酶活性时，要使初速度v基本上接近于 vmax，一般要[s]≥10～20km。换言之，在测 定酶浓度（活性）时 ，至少应该在0.9vmax 的[s]，使其酶促反应过程中s的消 耗量 ≤1%～5%。思 考1. 米氏酶进行酶活性测定时，[s]/km应该大于多少，底物 有10%的差别而所得初速度变化小于1%解：推出：[s]≥10km2. 何谓酶促反应动力学底物浓度, 温度和ph值对酶促反应速度各有什么影响试分析之.如果希望反应初速度达到其最大速度的90%, 底物浓度应为多大浙江大学2002年思 考3. 酶和底物的关系（ ）（1）如果酶浓度不变，则底物浓度改变不影响反应速率（2）当底物远多于酶时，酶被饱和，改变酶反应速率不变 （3）初速度是酶被饱和时的速度 （4）反应过程中，底物在增加，平衡常数将左移 （5）酶被饱和时，反应速率不再随底物增加而增加思 考(课后11）11. 下面的叙述哪一个是正确的胰凝乳蛋白酶的转换数 100s-1，dna 聚合酶是 15s-1。（1） 胰凝乳蛋白酶结合第五比 dna 聚合酶有更高的亲和性。ks （2） 胰凝乳蛋白酶反应速率比 dna 聚合酶反应速率更大。（3） 在特别的酶浓度和饱和底物水平下胰凝乳蛋白酶反 应速率比 dna 聚合酶在相同条件下更低。 （4） 在饱和底物水平下，两种酶的反应速率，假若 dna 聚合酶反应速率的 6.7 倍则与胰凝乳蛋白酶相等。（2）. vmax与k3（kcat）的意义vmax（不是酶的特征常数） maximum velocity① 定义:是酶完全被底物饱和时的反应速度,与酶浓度成正比. ② 意义:vmax=k3 [e] （k3是一级反应速率常数）如果酶的总浓度已知,可从vmax计算 酶的转换数即动力学常数k3catalytic constant③ k3代表酶被底物饱和时每秒钟每个酶分子转换底物的分子数，称为转换数（或催化常数，kcat）， 表明酶的最大催化效率e
s k 1 es k 3 p
k2（3）、kcat/km ：表观二级常数在生理条件下，大多数酶并不被底物所饱和，在体内[s]/km的比值通常介于0.01到1之间e
s k 1 es k 3 p
k2k cat kmk 3 k1 k 2
k3 k1kcat/km的上限是k1（当k2非常小时）kcat/km ：为表观二级常数kcat/km的上限是k1，既生成es复合物的速度(酶促 反应的速度不会超过es的形成速度k1，在水相中不会超过108-109）。kcat/km可以客观地比较不同的酶或同一种酶催化不同底物的催化效率，kcat/km一般认为是用来 比较催化效率的最好的动力学参数.（有的书说是 km）e
s k 1 es k 3 p
k2kcat/km称为酶的专一性常数, 可以表示酶对相互竞争的几种底物的专一性.kcat / km大小可以比较不同酶或同一种酶催化不 同底物的催化效率。triosephosphate isomerase (tim)kcat/km= ~108central core of 8 parallel strands,surrounded by8
helices. this structural motif, calledan
barrel,isalso found inthree other glycolytic enzymes.kcat/kmkcat/km is the criterion of substrate specificity, catalytic efficiency and &kinetic perfection‖. – units of kcat/km = conc–1time–1. – kcat/km can be no greater than k1 (rate constant for association of e + s). (you're not responsible for the explanation of this.) – how fast 2 molecules can react (or bind in the case of e + s) is limited by how fast the molecules can diffuse to &bump into each other― in solution so they can react. – for molecules the size of an enzyme and a typical substrate, the maximum (diffusionlimited) k1 = ~ 108–109 m–1sec–1.uses of kcat/kmkcat/km used as a measure of 2 things at the same time: 1. enzyme's substrate preference (e.g., binding)2. enzyme's catalytic efficiency1. enzyme's preference for different substrates (substrate specificity) – the higher the kcat/km, the better the enzyme works on that substrate. – e.g., chymotrypsin: protease that clearly &prefers& to cleave after bulky hydrophobic and aromatic side chains.kcat/km ：表观二级常数动力学参数kcat和km对于不同酶的研究和比较具有普遍性 用途。 常数kcat并不令人满意。两种催化不同反应的酶可能 有相同的kcat，然而它们非催化的速度也许是不同的。因此, 由酶所引起的速度提高可能有很大的差别, 而且kcat反映的是 一种酶当它被饱和时的性质。在低[s]下，它则失去意义。 常数km由于它自身的原因也不很令人满意。由于当v ＝ vmax/2时, km ＝[s], km必须对细胞内的正常[s]有某种关系。一种能与以很低的浓度存在于细胞中的底物作用的酶,倾向于 有较低的km(与该酶处在正常丰度的底物下相比)。对于讨论 催化效率来说, 最有用的参数应该包含kcat和km两者。比较催化效率的最好的动力学参数e
k2问题：1、①为什么kcat/km比值能用来测定一种酶对它不同底物的优先权②什么是酶的kcat/km上限③ kcat/km值接近上限的酶常被说成达到“完美催化”。请解释。 解答：① kcat/km比值是酶专一性常数或对不同底物的优先 权的一种衡量。当两种底物以相同浓度竞争同一种酶的活性 部位时，它们转变成产物的速度比值是与它们的kcat / km比 值相等的。由于对每种底物来说，反应速度υ＝（kcat/km） [e][s]，而[e]和[s]又是相同的，所以kcat/km比值大者的底 物是酶优先选择的对象。比较催化效率的最好的动力学参数(2)② kcat / km上限大约是108~109 s－1。这是两个不带电荷的分子在生理温度下通过扩散相遇的最快速度。③ 一种酶的催化效率不能超过e和s形成es复合物的速度，最有效率的酶的kcat / km值接近它通过扩散与底物相遇的速度。在接近这个极限速度下，酶催化反应的速度是最快 的，因而可以成为有效的催化剂。比较催化效率的最好的动力学参数(2)kcat/km称为酶的专一性常数,它不受非生产性结合与中间产 物积累的影响,可以表示酶对相互竞争的几种底物的专一性1、如果某 单底物酶促反应是二级反应，e+s→es→p 那么决定其催化反应速度的常数是：（ ）① ② ③ ④kcat/km2、 一个酶有多种底物，判断其底物专一性强弱应依 据参数；（
） （1）kcat （2）km （3）kcat/km 3.一个酶催化正反应和逆反应的kcat或km值可以不同,但kcat/km比值通常是相同的 (判断-)思 考4. 米氏常数km是一个衡量（ ）（1）酶和底物亲和力的常数 vmax= kcat[e]（2）酶促反应速率大小的常数（3） 酶稳定性的常数（4）酶被底物饱和的常数 （5） 酶变构效应的常数 （6）催化单底物反应的酶的底物的平衡常数e
k2 k4亲和力的常数: ks=k2/k1 或有时km(k3远小于k2或k3时）速率常数：一级k3(kcat)，二级kcat/km平衡常数：k3/k4(对于基元反应）
酶被底物饱和的常数：v0/vmax比较催化效率的最好的动力学参数(2)5. 某一酶催化单一底物反应.s1,s2 都是该酶的底物,已知 他们的 kcat(或vmax)和 km 值,在 s1,s2 同时 存在并且浓度相同的情况下,请给出该酶催化 s1 和 s2 反应速度之间的表达式.中科院20056. 为验证羧肽酶a tyr 248 在催化中的作用，对其基因进 行定点突变－tyr 248（tat）定点突变为phe（ttt）；实 验结论是，tyr 248 参与了与底物的结合，但不是催化所必须的，此结论必定来自如下数据：a. kcat 突变后降低 b. km 变大 c. kcat/km 升高 d. kcat 不变 e. kcat/km 降低上海交通大学2007比较催化效率的最好的动力学参数(2)7. 根据以下各酶的kcat（sec-1）和km（m）值，判断最完善的酶是 （1）乙酰胆碱酯酶 kcat＝1.4×104，km＝9×10-5 （2）过氧化氢酶 kcat＝4×107，km=1.1 （3）富马酸酶kcat＝800，km＝1.8×10-5 （4）磷酸丙糖异构酶kcat＝4.3×103，km＝1.8×10-5 （5）β-内酰胺酶kcat＝2×103，km=2×10-58. 欲使某酶促反应的速度等于vmax的80％，此时底物浓度应是此酶km值的多少倍 （1）2 （2）4 （3）8 （4）10南京大学2005年8、km和vmax值的测定(1) 以v-[s]作图，可以得到vmax，再从1/2 vmax，可求得相应的[s]，即km值。要从实验数据 所得到的v-[s]曲线来直接决定vmax是很困 难的，也不易 求出km值km和vmax值的测定(续)（2）、 lineweaver-burk 双倒数作图法vo
s vmax s1 vo
v max 斜率= km/vmax 纵坐标上的截距=1/vmax 横坐标上的截距=- 1/km双倒数作图法的用途用于测km值和vmax值用于判断可逆性抑制反应的性质km和vmax值的测定1) use predefined amount of enzyme → e 2) add substrate in various concentrations→ s (x 軸)3) measure product in fixed time (p/t)→ vo (y 軸)4) (x, y) plot get hyperbolic curve, estimate→ vmax 5) when y = 1/2 vmax calculate x ([s]) → km1vo-1vmaxvo1/2 vmax 1kmdouble reciprocal 1/skmdirect plot skm和vmax值的测定(续)1 向酶促反应体系中增加酶的浓度时，可出现下 列哪一种效应（ ）a． 1/[s]对1/v作图所得直线的斜率减少 b． vmax一保持不变 c． v达到vmax/2时的底物浓度增大 d. v与[s]之间呈现s型曲线关系 e. v达到vmax/2时的[s]已全部转变成产物(1) (2) (3) (4) (5) 反应速度最大 反应速度难以测定 底物浓度与反应速度成正比 增加酶浓度，反应速度显著变大 [s]增大，km值也随之变大2 一个简单的米氏酶促反应，当[s]远远小于km时lineweaver-burk 双倒数作图法双倒数作图法的局限性动力学数据最佳在0.5~5km双倒数作图法的局限性(续2)双倒数作图法的局限性(续3)该作图的缺点是：实验点过分集中在直线的左下方，而低浓度s 的实验点又因倒数后误差较大，往往偏离直线较远。从而影响km和 vmax的准确测定。km和vmax值的测定(续3)（3）.hanes-woolf 作图法：v/[s]—v lineweaver-burk 双倒数方程,两边同乘[s]km和vmax值的测定(续4)（4）. eisenthal和cornish-bowden直接线性作图法 将米氏方程变换为：把[s]表在负半轴上， 把测的反应速度v的数 值标在纵轴上，相应 的[s]和v联成直线，这 一族直线交于一点， 这一点的坐标为vm和 km。直接作图法不需 要计算，可直接读出 vm和km值。vm=v+v/[s] ×kmkm和vmax值的测定(续5)（5）、eadie-hofstee v—v/[s]作图法km和vmax值的测定方法比较例题：vmax与米氏常数可以通过作图法求得，试比 较v-[s]图，双倒数图，v-v/[s]作图，[s]/v-[s]作图 及直接线性作图法求vmax和km的优缺点答：（1）v-[s]图是双曲线的一支，可以通过其渐近线求vmax，v=1/2vmax时对应的[s]为km；优点是比较直观，缺点是实际上测定时不容易达到vmax，所以测不准。 （2）1/v-1/[s]图是一条直线，它与纵轴的截距为 1/vmax，与横轴的截距为-1/km，优点是使用方便， vmax和km都较容易求，缺点是实验得到的点一般集中在直线的左端，作图时直线斜率稍有偏差，km就求不准。km和vmax值的测定方法比较(续)（3）v-v/[s]图也是一条直线，它与纵轴的截距为vmax，与 横轴的截距为vmax/km，斜率即为-km，优点是求km比较方便， 缺点是作图前计算较繁。 （4）[s]/v-[s]图也是一条直线，它与纵轴的截距为km/vmax ，与横轴的截距为-km，优缺点与v-v/[s]图相似 （5）直接线性作图法是一组交于一点的直线，交点的横坐标 为km，纵坐标为vmax，是求vmax和km的最好的一种方法，不 需计算，作图方便，结果准确。（三） 多底物的酶促反应动力学（一）双底物酶促反应动力学机理双底物双产物的反应按动力学机制可分为两大类 :a+bp+q1. 序列反应或单一臵换反应:（存在三元复合物阶段）
(1) 有序反应ordered reaction(2) 随机反应random reactions2. 乒乓反应或双臵换反应多底物的酶促反应动力学1、有序反应机制（ordered reactions)只有leading substrate (领先底物a)首先与酶结合，然后 b 才 能 与 酶 结 合 ， 形 成 的 三 元 复 合 物 eab （ ternary complex)转变为epq，b的产物p先释放，a的产物q后释放。 ★在缺少a时，b不能与e结合底物a、b与酶结合的顺序是一定的，产物p、q的释放顺序也是一定的。多底物的酶促反应动力学(续)2、随机反应机理（random reactions)（1）. 底物a、b与酶结合的顺序是随机的，形成的三元复合物aeb → qep，产物p、q的释放顺序也是随机的。 （2）. 限速步骤是aeb → qep （3）. a与q相互竞争e上的底物结合部位a，b 与p相互 竞争e上的底物结合部位b （4）. 反应的总方向决定于a、b、q、p的浓度和反应 的平衡常数多底物的酶促反应动力学(续)3、乒乓反应机理（double-displacement reactions)先结合第一个底物a，释放第一个产物p，酶的构象发谷丙转氨酶 a p b q生变化，结合第二个底物b，释放第二个产物q。e(ea)(fp)(f)(fb)(eq)e整个反应历程中只有二元复合物形式，没有三元复合物形式乒乓反应谷丙转氨酶三、 酶的抑制作用抑制与失活之间的关系 失活作用(inactivation) :使酶蛋白变性而引起酶活力 丧失的作用 ,变性剂对酶的变性作用无选择性.
抑制作用(inhibition) :酶的必需基团化学性质的改变，但酶未变性，而引起酶活力的降低或丧失(一)、抑制程度的表示方法其活性降低的程度，一般用反应速度的变 化表示。以v0表示无抑制剂时的反应速度，v1 表示有抑制剂时的反应速度，酶的抑制程度有 以下表示方式：（1）相对活力分数 a = v1/ v0（2）相对活力百分数（3）抑制分数 （4）抑制百分数a% = v1/ v0 ×100(%)i= 1- a = 1- v1/ v0 i% = (1-a) ×100(%)（二）抑制作用的类型不可逆性抑制 (irreversible inhibition) 专一不可逆性抑制 非专一不可逆性抑制 （1）竞争性抑制 可逆性抑制 (reversible inhibition) （2）非竞争性抑制（3）反竞争性抑制1、不可逆的抑制作用:不可逆的抑制作用定义：抑制剂 与酶的必需基团共价结合，使酶的活性下降，无法用透 析、超滤等物理方法除去抑制剂而使酶复活。 2. 可逆的抑制作用: 抑制剂与酶以非共价键结合而引起酶活力降低或丧失，能用物理方法除去抑制剂而使酶复活，抑制作用是可逆的3、可逆的抑制作用和不可逆的抑制作用的鉴定（1）物理方法：透析、超滤 （2）动力学方法：v-[e]分类通过可逆抑制剂的动力学曲线可以区分三种可逆 抑制作用(三) 可逆抑制剂的动力学1.竞争性抑制(competitive inhibition)：抑制剂具有与底物类似的结构，竞争酶的活性中心，并与酶形成可逆的酶-抑制剂复合物，阻止底物与酶结合。按照抑制剂的结构又分为两种情况: a:底物类似物抑制剂(同位抑制) b:别位竞争抑制剂（2）、竞争性抑制的特点a. 竞争性抑制剂结构往往和底物结构相似 b. 抑制剂与酶的结合部位与底物与酶的结合部位相同； c. 增加底物浓度可使抑制程度减小；抑制剂浓度越大 则抑制作用越大；抑制剂的抑制作用决定与底物与抑制剂浓度比值；所以可以通过增大底物浓度，即提高底物的竞 争能力来消除。 d. 动力学参数： km值增大， 双倒数直线 斜率上升 直线交于y轴vm值不变。(3) 竞争性抑制动力学vmax [s] v [i] k m (1 ) [s] kikm [i] 1 1 1
v vmax k i [s] vmax竞争性抑制动力学(续)（4）竞争性抑制举例：① 丙二酸对琥珀酸脱氢酶的抑制②. 另外甲醇中毒可用乙醇治疗③ 磺胺药对细菌fh2合成酶的抑制④ 过渡态的类似物为竞争性的抑制剂所谓过渡态底物是指底物和酶结合成中间复合体后被活化的过渡形式，一般用s*表示，由于其能障小，和酶结合就紧密得多。1. 对于一个酶而言,其过渡态的底物类似物与底 物的物相比较,是更有效的竞争性抑制剂（判断） 2. 酶与过渡态底物类似物的亲和力比酶与底物 的亲和力要（ ）。3. 低浓度的竞争性抑制剂对 别构酶是激活作用
竞争性抑制举例(续)⑤. 抗代谢物的抗癌作用抑制剂 氨基蝶呤5-氟尿嘧啶 （5-fu）被抑制的酶 二氢叶酸还原酶（胸苷磷合酶）竞争底物 二氢叶酸dump临床应用 抗白血病抗癌作用（抑制 核苷酸合成） 抗通风（抑制尿 酸生成）别嘌呤醇黄嘌呤氧化酶黄嘌呤，次黄嘌呤思考（1） 竞争性的抑制剂可以保护酶的活性中心，其他可逆 抑制剂不能→酶活性中心测定的差式修饰2、非竞争性抑制（1）、定义：非竞争性抑制(noncompetitive inhibition):酶可以同时与抑制剂和底物结合,底物与抑制剂两者无竞 争关系,与酶的结合互不干扰,但三者的复合物esi不能形成产 物,因此降低了酶反应活性.（山东大学）（2）、非竞争性抑制的特点a. 底物和抑制剂分别独立地与酶的不同部位相结合； b. 抑制剂对酶与底物的结合无影响，故底物浓度的 改变对抑制程度无影响； c 不能通过增加底物浓度使抑制程度减小；抑制剂的 抑制作用决定抑制剂浓度，与底物浓度无关d. 动力学参数：km值不变vm值降低。双倒数直线 斜率上升 直线交于x轴（3）非竞争性抑制的动力学方程:k m
非竞争性抑制的动力学方程:动力学方程：当[i]=ki时，v是未加抑制剂vo多少相对活力：ki a
[ i ]ki i 1
[ i ] [i ]
[ i ]抑制分数：在一定[i] 下， ki 越大，抑制作用越小★抑制程度决定于[i]和ki ，与底物的km和[s]无关（4）例子：非竞争性抑制作用如某些金属离子（cu2+、ag+、hg）通常能 与酶分子的调控部位中的-sh基团作用，改变酶的 空间构象，引起非竞争性抑制；edta结合金属离子引起的抑制作用也属于非竞争性抑制。非竞争性抑制剂与酶活性中心以外的基团结 合。这类抑制作用不会因提高底物浓度而减弱思考问题：胰凝乳蛋白酶的竞争性抑制剂是β苯基丙酸盐，它 可保护酶活性部位的组氨酸（his57）不被烷基化修饰， 而非竞争性抑制剂却不能，为什么答：因竞争性抑制剂与亲和试剂tpck（n一对甲苯磺酞苯丙氨酸氯甲基酮）都能与酶的活性部位结合。这样， 若竞争性抑制剂与酶的活性部位结合后，tpck就不能再 与酶结合；而非竞争性抑制剂不能与酶的活性部位结合， 因此它不能阻止tpck与酶的结合。3、反竞争性抑制作用（1）反竞争性抑制定义：反竞争性抑制：抑制剂不能与游离酶结合，但可与es复合物结合并阻止产物生成，使酶的催化活性降低，称酶的反竞争性抑制。uncompetitive inhibitor kineticsuncompetitive inhibitor kinetics（2）反竞争性抑制的特点a. 抑制剂与底物与酶的不同部位结合；抑制剂与底物不相似b. 必须有底物存在，抑制剂才能对酶产生抑制作用； c. 动力学参数： km 减小，vmax减小 →双倒数直线 斜率不变为一组平行线→ kcat/km（表观二级常数） 有没有变化斜率= km/vmax = km/kcat[e]（3）反竞争性抑制的动力学方程:1 v
[ s ] vmax
1一组平行直线km及vmax都变小反竞争性抑制的动力学方程可逆抑制剂的动力学作用特征 与i结合的组分 竞争性 抑制 e 非竞争性 抑制 e、es 反竞争性 抑制 es表观kmvmax增大不变不变降低减小降低可逆抑制剂的动力学1. 抑制剂一定会增加km或减小vmax吗 2. 抑制剂一定会降低酶对底物的亲和力吗 3. 三种可逆抑制剂的判断：双倒数曲线和动 力学常数变化（课后题） 4. 无抑制剂(i)时反应速率是vmax,有抑制剂 时反应速率是vmax`, 这是什么抑制剂vmax`= vmax× ([e] - [i]) [e]可逆抑制剂的动力学公 式 km vm 斜 率正 常v= vmax［s］ /km+［s］kmvmkm/vmax竞争性的抑 制剂↑不变增 大非竞争性抑 制剂不 变↓增 大反竞争性抑 制剂↓↓不 变思考dixon作图法求ki19. lineweaver-burk双倒数作图法和求抑制剂ki的dixon作图法分别采 用 a. 1/v对于1/[s]作图和1/v对1/[i]作图; b. 1/v对于1/[s]作图和1/v对[i]作图; c. 1/v对于[s]作图和1/v对1/[i]作图; d. 1/v对于1/[s]作图和v对1/[i]作图.中国科学院2004年enzyme inhibition (mechanism)enzyme inhibition (plots)四、一些重要的抑制剂（一）、 不可逆抑制剂：1、非专一性不可逆抑制剂：与酶的活性中心以及活性中心外的某一类或几类必需基团反应 （1）、有机磷化物 a、抑制机理：与蛋白酶及酯酶活性中心ser的oh形成磷脂键。 b、例如：dfp（二异丙基氟磷酸）、敌百虫、敌敌畏、农药1605、沙林毒气毒理：强烈抑制乙酰胆碱脂酶（神经毒剂）。 解毒剂：pam（解磷定）可以把酶上的磷酰基团除去。胰脏凝乳蛋白酶的s195ser被difp抑制（2）、有机砷、汞化合物b、例如：路易斯毒气（有机砷化合物 ）对氯汞苯甲酸，可用过量巯基化合物如半胱氨酸或还原 型谷胱甘肽解除。 砷化物可破坏硫辛酸辅酶，从而抑制丙酮酸脱氢酶系统。 路易斯毒气(chcl=chascl2)能抑制几乎所有的巯基酶。砷a、抑制机理：有机砷、汞化物 与巯基作用，抑制含巯基的酶。化物的毒性不能用单巯基化合物解除，可用过量双巯基化合物解除，如二巯基丙醇等。它是临床上重要的砷化物及重金 属中毒的解毒剂。vc+海鲜=砒霜巯基酶的抑制解毒方法：二巯基丙醇、二巯基丁二酸钠非专一性不可逆抑制剂(续)③ 重金属ag+、cu2+、hg2+、pb2+ 、fe3+能使大多数酶失活， edta可解除。④ 烷化物含卤素的烷化物（碘乙酸、碘乙酰胺、卤乙酰苯等） 常用于鉴定酶中巯基。⑤ 氰化物、硫化物、co能与酶中金属离子形成较为稳定的络合物2. 专一性不可逆抑制剂①、 ks型不可逆抑制剂定义：具有与底物相似的结构，同时还带有一个能与酶活性中心或活性中心外的必需基团进行化学反应的活泼基团。专一性程度取决于它与活性中心及活性中心外的的ks之比 例如： 胰蛋白酶的底物及其ks型不可逆抑制剂— （tpck）胰乳蛋白酶的最佳底物：对-甲苯磺酰-l-苯丙氨酸甲酯 ks型不可逆抑制剂：对一甲苯磺酰-l-苯丙氨酰氯甲烷（tpck）-ch2-cl与酶活性部位的一个his-咪 唑基距离很近，易使之烷基化。②、kcat型不可逆抑制剂（自杀性底物,）定义： kcat型抑制剂（自杀性底物）不但有类 似天然底物的结构，而且本身也是酶的底物， 同时还有一种潜伏性的反应基团，可因酶催化 而暴露或活化，进而作用于酶活性中心或辅基 使酶失活。专一性高于ks型不可逆抑制剂例如：β -氯代-d-ala抑制丙氨酸消旋酶 的机制催化完成后产物与酶分子不可逆结合。中科院试题《生物化学与分子生物学》中科院试题《生物化学与分子生物学》3 是非题2006：“自杀性底物”是指在亲和标记法中使用的共价修饰剂。－4、“自杀性底物”指的是5、厦门大学2005：a，一种可逆抑制剂；b，一种亲核标记试剂；c，一种不可逆抑制剂。 痛风是因为体内____产生过多造成的，使用____作为 黄嘌呤氧化酶的自杀性底物可以治疗痛风。6 一个有效的自杀性抑制剂必须具备：（1）（（2）（ ），（3）（），）。（华南理工大学2007 ）中科院试题《生物化学与分子生物学》五、激活剂对酶活性的影响p380激活剂（activator):凡是能提高酶活性的物质。1、无机离子的激活作用 （1）金属离子：k+ 、na+、mg2+ 、zn2+ 、fe2+ 、ca2+ （2）阴离子：cl-、br -、po43（3）氢离子
不同的离子激活不同的酶。 不同离子之间有拮抗作用和可替代作用，如na+与k+mg2+与ca2+之间常常拮抗，但mg2+与zn2+常可替代。激活剂的浓度要适中，过高往往有抑制作用，1~50mm激活剂2、简单有机分子的激活作用①还原剂（如cys、还原型谷胱甘肽）能激活某些活性中 心含有—sh的酶。 ②金属螯合剂（edta）能去除酶中重金属离子，解除抑 制作用。3、蛋白酶对酶原的激活酶原可被一些蛋白酶选择性水解肽键而被激活，这些蛋 白酶也可看成为激活剂。六、温度对反应速度的影响1、双重影响（1）温度升高，酶促反应速度升高；（2）由于酶的本质是蛋白质，温度升高，可引起酶的变性，从而反应速 度降低 。2、最适温度 (optimum temperature):酶促反应速度最快时的环境温度。它不是酶的特征常数. 最适温度不是酶的特征常数，它与底物种类、作用时 间、ph、离子强度 等因素有关。反应时间越长最适温度越低温度对反应速度的影响3、温度系数 q10：温度升高 10 ℃，反应速度与原来的反应速度之比， q10一般为1~2 。最适温度酶的固体状态比在溶液中对温度的耐受力要高。通 常酶制剂以固体保存为佳。思考例如1：新掰下的玉米的甜味是由于玉米粒中的糖浓度高.可是 掰下的玉米贮存几天后就不那么甜了,因为50%糖已经转化为淀 粉了.如果将新鲜玉米去掉外皮后浸入沸水几分钟,然后于冷水 中冷却,储存在冰箱中可保持其甜味.这是什么道理答:采下的玉米在沸水中浸泡数分钟,可以使其中将 糖转化成淀粉的酶基本失活, 而后将玉米存放在冰箱中,可 以使残存的酶处于一种低活性状态,从而保持了玉米的甜度七、 ph对反应速度的影响1、 ph影响酶活力的原因：
(1) 过酸或过碱可以使酶的空间结构破坏，引起酶 构象的改变，酶活性丧失。 (2) 当ph改变不很剧烈时，酶虽未变性，但活力受 到影响。
（3）影响了底物的解离状态；
（4）影响酶分子活性部位上有关基团的解离； （5）影响到中间络合物es的解离状态，不利于催化生成产物。2、最适ph最适ph(optimum ph)：酶催化活性最大的环境ph。最适ph不是酶的特征常数注意：酶的提纯及测活时要选择酶的稳定ph, 常在某一缓冲液中进行 通八、酶浓度对反应速度的影响
06:08:34 04:11:36 01:53:53 04:03:04 07:47:15 23:42:45 17:29:23 18:46:16 18:40:57 05:11:28}