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北京现货硅胶膜离心吸附柱再生液厂家
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nginx/1.4.1一种层析柱及核酸提取方法
一种层析柱及核酸提取方法
【专利摘要】本发明提供了一种层析柱及核酸提取方法，所述层析柱包括至少两个不同的固体层，以双层层析柱为例，由第一固体层和第二固体层串联耦合组成，所述第一固体层是由阴离子交换膜或微珠组成，所述第二固体层是由硅胶膜或微珠组成，利用所述层析柱进行核酸提取时：（1）第一固体层，当含有核酸的第一溶液流经时，其中核酸结合到此层，并在第二溶液流经时核酸被洗脱；（2）第二固体层，当第二溶液流经时，其中被洗脱的核酸可结合到此层，并在第三溶液流经时被洗脱。在溶液经过第一固体层然后通过第二固体层这种方式下，从而使得第一固体层串联耦合到第二固体层；所述层析柱结构简单、使用方便，该核酸提取方法特别适合分离体积大而且浓度低的核酸。
【专利说明】—种层析柱及核酸提取方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，尤其一种层析柱及核酸提取方法。
【背景技术】
[0002]核酸提取被用于许多分子生物化学试验和诊断，是克隆、转化、酶切、体外转录、扩增、测序等重要的第一个步骤。然而由于细胞内存在大量蛋白质、碳水化合物、原始样品中的代谢物以及其它污染物，提取高质量的核酸并非易事。现阶段的核酸提取方法包括:
[0003](I)硅胶为基础的提取方法:硅胶或二氧化硅为基础的提取方法已成为一种流行的核酸提取方法，其中包括使用控制的微孔玻璃，嵌入二氧化硅颗粒的滤膜，硅胶颗粒，二氧化硅构成的藻土型树脂，和玻璃纤维。基本过程为，在高浓度离液盐的存在下，DNA或RNA会粘结到硅胶树脂或膜的表面，其它污染被冲洗走，然后用水或低盐缓冲液洗脱DNA或RNA。
[0004]以硅胶为基础的提取原理是依据在高浓度的离液盐，例如碘化钠(NaI)，高氯酸钠(NaC104)，盐酸胍(GuHCl )，和异硫氰酸胍(GuTC)等的条件下，带负电荷的DNA骨架与带正电的硅胶表面具有高度的亲和力。
[0005]现阶段已对离子强度、温度、pH值、DNA大小和构象与核酸结合到硅胶表面上的影响进行了研究，例如，在硅胶表面的结合能力与离液盐浓度是呈线性相关的。此外，在一个给定的离液盐浓度下，PH值越低则所有类型的DNA与硅胶表面的结合能力越高。
[0006]异硫氰酸胍(GuTC)和盐酸胍(GuHCl)是常用的将核酸与硅胶表面粘结的试剂。碘化钠(NaI)和高氯酸钠(NaC104)也被少量的使用。异硫氰酸胍(GuTC)在浓度为4M至6M时效果最好，而盐酸胍(GuHCl)则在6M的较高浓度下使用。在乙醇或异丙醇的条件下其结合效率显著改善。以及控制结合试剂PH值为6至7.5的醋酸钠和Tris-HCl缓冲液。而且，已知的可有效地裂解细胞并使蛋白质变性的胍盐，例如异硫氰酸胍(GuTC)的使用则免除了添加蛋白酶等变性酶的需求。
[0007]这种层析柱常用硅胶树脂或膜作为固定相，并常用离心或真空来驱动，例如Promega公司的PureYield质粒小量提取系统和WizardPlus小量DNA制备纯化系统,来自Qiagen公司的QIAprep小量制备试剂盒,和Bioland公司的EZgene质粒小量制备纯化试剂盒。
[0008]以硅胶为基础的DNA提取方法具有快速、简便、有效的特点，所纯化的DNA质量高并可以用于多种下游应用。然而由于高达3倍体积的离液盐溶液被添加到I份体积的DNA或RNA样品中方可达到硅胶结合DNA所需的有效离液盐的浓度，因而对血浆等标本的起始体积受到很大限制。
[0009](2)阴离子交换为基础的DNA提取方法:通常也使用阴离子交换树脂及膜的方法来分离核酸。这一过程中在低PH值及低盐浓度下DNA可与阴离子交换剂结合，随即可用高PH值及高浓度的盐溶液来洗脱DNA。
[0010]其结合原理是基于DNA主链上的带负电荷的磷酸根离子与分子表面上带正电的DEAE等基团之间的相互作用，溶液中的盐浓度和pH值决定了是否结合或洗脱DNA。
[0011]通常以微珠为基础的阴离子交换柱多是重力流动型的，例如QIAGEN公司的基因组柱试剂盒。QIAGEN公司的树脂是由多孔型硅胶微珠为基质并加有一层二乙基氨基乙醇(DEAE)官能团的涂层；其它的则包括PALL公司的AciOSep层析柱，它是由弱的阴离子交换树脂DEAE陶瓷HYPERD F微珠以及Q强阴离子交换陶瓷HYPERD F微珠组成的。
[0012]与基于微珠柱子相比，通常使用的为离心型或真空抽吸驱动型阴离子交换膜式柱子，例如Vivapure弱阴离子交换微型D膜离心柱和Vivapure强阴离子交换Q膜离心柱，它们具有流速高、成本低、高通量的优势。
[0013]阴离子交换柱提供了 一个简单、安全、可靠的用于从各种样品中分离核酸的方法，其所制备的核酸具有相当于两次CsCl梯度离心纯化的超纯度。然而因为在洗脱液中含有高浓度的盐，洗脱的核酸是不能直接使用的，通常需要一个额外的步骤，例如，乙醇或异丙醇沉淀以去除盐。
[0014]因此，我们研发了一种新的层析柱，以及基于该新的层析柱的核酸提取方法，用以克服前述基于硅胶提取和基于阴离子交换提取核酸两者的缺点，使核酸提取方法更加简单、快速、高效、可靠，且具有成本效益，将具有非常重要的应用价值。
【发明内容】
[0015]本发明所要解决的技术问题在于提供一种层析柱。
[0016]本发明所要解决的另一技术问题在于提供一种应用所述层析柱的核酸提取方法。
[0017]为解决上述技术问题，本发明的技术方案是:
[0018]一种层析柱，包括至少两个不同的固体层，以双层层析柱为例，由第一固体层和第二固体层串联耦合组成，所述第一固体层是由阴离子交换膜或微珠组成，所述第二固体层是由娃胶膜或微珠组成。
[0019]优选的，上述层析柱，所述阴离子交换膜或微珠为阴离子交换剂二乙胺(D或DEAE)，季铵(Q)或二乙基氨基丙基(ANX)。
[0020]上述层析柱应用时:(I)第一固体层，当含有核酸的第一溶液流经时，其中核酸结合到此层，并在第二溶液流经时核酸被洗脱；(2)第二固体层，当第二溶液流经时，其中被洗脱的核酸可结合到此层，并在第三溶液流经时被洗脱。在溶液经过第一固体层然后通过第二固体层这种方式下，从而使得第一固体层串联耦合到第二固体层。
[0021]一种应用上述层析柱的核酸提取方法，具体步骤为:
[0022](I)含有样本核酸的第一溶液通过所述第一固体层后再到第二固体层，当该第一溶液流过该第一固体层时其中的核酸即结合到第一固体层上；
[0023](2)第二溶液通过时则将步骤(I)中第一固体层内结合的核酸洗脱，该核酸通过第二固体层时便结合到第二固体层；
[0024](3)第三溶液通过时则将步骤(2)中第二固体层内结合的核酸洗脱，从而提取出所需核酸；其中，
[0025]所述第一溶液为ρΗ5.0-8.0的盐溶液；
[0026]所述第二溶液含有高浓度的离液盐，所述离液盐为2-8Μ的异硫氰酸胍(GuTC)、盐酸胍(GuHCl )、碘化钠(NaI)或高氯酸钠(NaC104)；[0027]所述第三溶液为ρΗ7.0-9.0的盐溶液。
[0028]优选的，上述核酸提取方法，所述第一溶液为ρΗ6.0-8.0的含20mMTris_HCl的盐溶液；和/或所述第三溶液为PH8.0-9.0的含IOmM Tris-HCl加0.1mM EDTA的盐溶液。
[0029]优选的，上述核酸提取方法，所述第一溶液为pH7.5的含lOmMTris-HCl，ImM EDTA的盐溶液；和/或所述第二溶液为PH7的含4M GuTC,0.5M NaCl的20mM Tris-HCl。
[0030]优选的，上述核酸提取方法，具体步骤为:
[0031](I)含有样本核酸的第一溶液通过所述第一固体层后再到第二固体层，当该第一溶液流过该第一固体层时其中的核酸即结合到第一固体层上；
[0032](2)层析柱中加入pH6.0-8.0的IOmM Tris-HCl溶液，用来洗去第一固体层内的蛋白质、碳水化合物和小的代谢物等污染物；
[0033](3)第二溶液通过时则将步骤(I)中第一固体层内结合的核酸洗脱，该核酸通过第二固体层时便结合到第二固体层；
[0034](4)第三溶液通过时则将步骤(3)中第二固体层内结合的核酸洗脱，从而提取出所需核酸；
[0035]优选的，上述核酸提取方法，在所述核酸结合到第二固体层后，层析柱中加入浓度为2-8M的离液盐溶液，以洗去第二固体层的蛋白质、碳水化合物和小的代谢物等污染物，该离液盐溶液可与第二溶液相同或不同；继续使第三溶液将第二固体层内结合的核酸洗脱。
[0036]优选的，上述核酸提取方法，在所述核酸结合到第二固体层后，层析柱中加入浓度为2-8M的离液盐溶液中含乙醇或异丙醇。
[0037]优选的，上述核酸提取方法，在所述核酸结合到第二固体层后，层析柱中加入浓度为2-8M的离液盐溶液的pH值为6-8 (如，ρΗ7.5)，并含IOmMTris-HCl和80%乙醇。
[0038]优选的，上述核酸提取方法，所述步骤(I)中的核酸包括DNA、RNA或可嵌合蛋白质(如，病毒)。
[0039]优选的，上述核酸提取方法，所述步骤(I)中的核酸为体积大而且浓度低的核酸(如，血浆中提取的少量核酸)。
[0040]优选的，上述核酸提取方法，所述步骤(2)中第二溶液还含有用于增加离子强度的盐，和/或含有乙醇或异丙醇。
[0041]优选的，上述核酸提取方法，所述步骤(2)中第二溶液中用于增加离子强度的盐为NaCl 或 KCl。
[0042]本发明的有益效果是:
[0043]本发明所述层析柱结构简单、使用方便，应用该层析柱的核酸提取方法特别适合同時分离RNA和DNA，以及用于提取如病毒等被蛋白质包裹的核酸，和用于分离体积大而且浓度低的核酸，如血浆中提取少量的核酸；所提取的核酸可直接用于下游应用。
【专利附图】
【附图说明】
[0044]图1是一个双层层析柱的示意图，在所示的例子中，1-第一固体层，2-第二固体层，其中，第一固体层是一种阴离子交换膜，例如DEAE膜；第二固体层是硅胶膜，它们是呈顺序性的串联耦合；溶液流过第一固体层，然后通过第二固体层；[0045]图2显示了双层层析柱内的提取过程，以DEAE膜为第一固体层和硅胶膜为第二固体层为例，箭头表示溶液流过DEAE膜，然后通过硅胶膜；双弯曲的线则代表核酸，按照第一溶液及第二溶液的顺序被结合到DEAE膜上然后被洗脱；再根据所述第二及第三溶液的顺序核酸被结合到硅胶膜上，然后被洗脱；
[0046]图3显示了一个示例的双层层析柱，1-第一固体层，2-第二固体层，其中，第一固体层是由五张Whatman DE81片材组成的DEAE膜，而第二固体层则是的硅胶膜，直径7毫米;
[0047]图4标示出了用I %琼脂糖凝胶来检测的所提取的Ikb梯度DNA标记物及人类基因组DNA的大小，其中，泳道M是未经处理的Ikb梯度DNA标记和基因组DNA混合控制物，泳道I?4是用不同条件下的第二溶液洗脱的Ikb梯度DNA标记物和人类基因组DNA，泳道5?8是第一溶液的滤液，泳道9至12中的I XTE洗涤缓冲液的滤液。
【具体实施方式】
[0048]实施例1
[0049]一种层析柱，为双层层析柱，由第一固体层I和第二固体层2串联耦合组成，所述第一固体层I用DEAE阴离子交换膜作为第一阴离子交换介质，所述第二固体层2用硅胶膜作为第二硅胶介质(图1)。
[0050]本发明所述层析柱在使用过程中，溶液流过第一固体层，然后通过第二固体层，可通过真空抽吸或离心来驱动溶液的流动，当含有核酸的第一溶液流过第一固体层时，核酸既结合于此层(图2);当第二溶液流经已结合核酸的第一固体层时，即可洗脱已结合的核酸，当它流经所述第二固体层，将已洗脱的核酸结合至第二固体层。在这个意义上“串联耦合器”即第二溶液将核酸从第一固体层洗脱下来，然后将核酸结合到第二固体层上；当第三个溶液流经已结合核酸的第二固体层时可洗脱出核酸。
[0051]此外，作为双层的组成物，第一固体层还可为其他阴离子交换膜或微珠。阴离子交换膜或微珠构成一个支承介质及一个以共价连接的阴离子交换剂。可使用弱阴离子交换剂的二乙胺(D，或DEAE)，强阴离子交换剂的季铵盐(Q)，以及另一个弱的阴离子交换剂二乙基氨基丙基(ANX)(表I)。
[0052]表I第一固体层的阴离子交换剂的功能基团
【权利要求】
1.一种层析柱，其特征在于:包括至少两个不同的固体层，即至少包括第一固体层和第二固体层，当含有核酸的第一溶液流经第一固体层时，其中核酸结合到此层，并在第二溶液流经时核酸被洗脱；当第二溶液流经第二固体层时，其中被洗脱的核酸可结合到此层，并在第三溶液流经时被洗脱；在溶液经过第一固体层然后通过第二固体层这种方式下，从而使得第一固体层串联耦合到第二固体层，所述第一固体层是由阴离子交换膜或微珠组成，所述第二固体层是由硅胶膜或微珠组成。
2.根据权利要求1所述的层析柱，其特征在于:所述阴离子交换膜或微珠为阴离子交换剂二乙胺(D或DEAE)，季铵(Q)或二乙基氨基丙基(ANX)。
3.一种应用权利要求1或2所述层析柱的核酸提取方法，其特征在于:具体步骤为:
(1)含有样本核酸的第一溶液通过所述第一固体层后再到第二固体层，当该第一溶液流过该第一固体层时其中的核酸即结合到第一固体层上；
(2)第二溶液通过时则将步骤(1)中第一固体层内结合的核酸洗脱，该核酸通过第二固体层时便结合到第二固体层；
(3)第三溶液通过时则将步骤(2)中第二固体层内结合的核酸洗脱，从而提取出所需核酸;其中，
所述第一溶液为PH5.0-8.0的盐溶液；
所述第二溶液含有高浓度的离液盐，所述离液盐为2-8M的异硫氰酸胍(GuTC)、盐酸胍(GuHCl )、碘化钠(NaI)或高氯酸钠(NaC104)；
所述第三溶液为PH7.0-9.0的盐溶液。
4.根据权利要求3所述的核酸提取方法，其特征在于:所述第一溶液为pH6.0-8.0的含20mM Tris-HCl的盐溶液或为pH7.5的含IOmM Tris-HCl, ImM EDTA的盐溶液；和/或所述第二溶液为PH7的含4M GuTC, 0.5MNaCl的20mM Tris-HC和/或所述第三溶液为ρΗ8.0-9.0 的含 IOmM Tris-HCl 加 0.1mM EDTA 的盐溶液。
5.根据权利要求3所述的核酸提取方法，其特征在于:具体步骤为:
(1)含有样本核酸的第一溶液通过所述第一固体层后再到第二固体层，当该第一溶液流过该第一固体层时其中的核酸即结合到第一固体层上；
(2)层析柱中加入ρΗ6.0-8.0的IOmM Tris-HCl溶液，用来洗去第一固体层内的蛋白质、碳水化合物和小的代谢物等污染物；
(3)第二溶液通过时则将步骤(1)中第一固体层内结合的核酸洗脱，该核酸通过第二固体层时便结合到第二固体层；
(4)第三溶液通过时则将步骤(3)中第二固体层内结合的核酸洗脱，从而提取出所需核酸；
6.根据权利要求3或5所述的核酸提取方法，其特征在于:在所述核酸结合到第二固体层后，层析柱中加入浓度为2-8Μ的离液盐溶液，以洗去第二固体层的蛋白质、碳水化合物和小的代谢物等污染物，该离液盐溶液可与第二溶液相同或不同；继续使第三溶液将第二固体层内结合的核酸洗脱。
7.根据权利要求6所述的核酸提取方法，其特征在于:在所述核酸结合到第二固体层后，层析柱中加入浓度为2-8Μ的离液盐溶液中含乙醇或异丙醇。
8.根据权利要求6所述的核酸提取方法，其特征在于:在所述核酸结合到第二固体层后，层析柱中加入浓度为2-8M的离液盐溶液的pH值为6-8(如，pH7.5)，并含IOmM Tris-HCl和80%乙醇。
9.根据权利要求3所述的核酸提取方法，其特征在于:所述步骤(2)中第二溶液还含有用于增加离子强度的盐，和/或含有乙醇或异丙醇。
10.根据权利要求9所述的核酸提取方法，其特征在于:所述步骤(2)中第二溶液中用于增加离子强度的盐为NaCl或KCl。
【文档编号】B01J20/281GKSQ
【公开日】日
申请日期:日
优先权日:日
【发明者】丁少峰, 刘强
申请人:丁少峰, 刘强细胞库/细胞培养
ELISA试剂盒
实验室仪器/设备
原辅料包材
体外检测试剂
&&硅胶膜离心吸附柱再生液 DNA纯化
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