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问答题简答题酶固定化后，性质会发生哪些改变，其原因是什么？
（1）固定化对酶活性的影响：
固定化以后，酶活性下降，反映速率下降。原因是固定化以后，酶结构、构象的变化会导致活性中......
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酶与载体应结合牢固，从而使酶能回收贮藏，利于反复使用所选载体不与废物、产物或反应液发生化学反应固定化酶成本要低，以利于工业使用操作简单，处理条件温和，酶的高级结构和活性中心的氨基酸残基不易被破坏，能得到酶活回收率较高的固定化酶。但容易受缓冲液影响，在离子强度高的条件下进行反应时，酶往往会从载体上脱落。界面聚合法利用在微滴的界面通过加成或缩合反应形成水不溶性多聚体制成微囊包埋酶。例：以尼龙膜包埋酶时，将酶液及亲水性单体（如己二胺）溶于水制成水溶液。另外，将疏水性单体（癸二酰氯等）溶于氯仿或甲苯等与水混溶的有机溶剂。然后，将这两种互不相溶的液体混和在一起。加入乳化剂乳化，使酶液分散成小液滴。此时，亲水性的已二胺与疏水性的癸二酰氯就在二相界面聚合成半透膜，将酶包埋在小球内。再加Tween—20，使乳化破坏，用离心分离即可得用半透膜包埋的微囊型固定化酶。表面活性剂乳化液膜法在酶的水溶液中添加表面活性剂，使之乳化形成液膜达到包埋的目的。该法不含化学反应，简便，而且固定化是可逆的，但有渗漏的可能性。酶经固定化后，提高了对蛋白质变性剂和抑制剂的抵抗能力氨基酰化酶与固定于DEAE-Sephadex的氨基酰化酶比较，前者在6mol、2mol胍、1％SDS和4mmol丙酮溶液中活力分别为9％、49％、1％和55％，而后者在相应溶液中活力则分别为146％、117％、35％和138％。靶向前体药物是将药物化学修饰成不显活性的衍生物，导向到靶组织后，被特异的酶转化为活性药物。微球制剂和脂质体制剂也可以偶联抗体以增强靶向性。细胞表面的糖复合物也可作为靶向目标。需将单抗人源化以避免异源物质引起的免疫反应肿瘤细胞免疫原性弱，不均一，难以找到普适的抗体制备困难、造价高三、固定化酶的性质固定化后酶活力的变化固定化对酶稳定性的影响固定化酶的最适温度和最适pH变化固定化酶的米氏常数变化1、固定化后酶活力的变化固定化酶的活力大多比天然酶小，其专一性也能发生改变。固定化胰蛋白酶对高分子底物只显示原酶活力的30%，而对低分子底物的活力保持80%。固定化酶活力低于原酶的原因：固定化过程影响活性中心的构象固定化影响酶分子活性中心对底物分子的定位作用内扩散阻力使底物分子与活性中心的接近受阻酶被包埋时，半透膜影响大分子底物与酶的接近2、固定化对酶稳定性的影响大多数情况下，酶经过固定化，其稳定性都有所增加。包括热稳定性提高；对各种有机试剂及酶抑制剂的稳定性提高；对不同pH、蛋白酶、贮存和操作条件的稳定性提高。原因：固定化防止了酶分子的伸展变形；固定化使酶活力缓慢释放；抑制酶的降解固定化酶的热稳定性变化1—固定化酶；2—天然酶大多数酶在固定化后与溶液酶相比，有较高的热稳定性。氨基酰化酶溶液酶在75℃保温15min，活力为0；DEAE-Sephadex固定化酶在同样条件下仍有80％；DEAE-纤维素固定化酶在同样条件下还有60％活力。其他如固定化乳酸脱氢酶、脲酶等都比溶液酶的热稳定性提高，溶液酶经固定化后提高了对蛋白酶的抵抗能力。氨基酰化酶在胰蛋白酶作用下活力仅存20％，而将其固定于DEAE-纤维素上在同样条件下仍有80％的活力。3、固定化酶的最适温度和最适pH的变化固定化后酶的最适温度随之提高。酶固定化后，对底物作用的最适pH和酶活力-pH曲线常发生偏移。原因:微环境表面电荷性质的影响。带负电荷的载体，往往导致固定化酶的最适pH向碱性方向移动；带正电荷的载体则相反。天冬酰胺酶固定化前后的酶活力-pH曲线　　1—固定化酶；2—游离酶4、固定化酶的米氏常数变化固定化酶的表观米氏常数随载体的带电性能变化载体电中性时，表观Km上升载体电荷与底物相反时，表观Km低于溶液酶Km载体电荷与底物相同时，表观Km显著增加固定化酶制备物性质取决于所用的酶及载体材料的性质(1)酶固定化后的变化主要是活性中心的氨基酸残基、高级结构和电荷状态等发生变化(2)载体影响主要是在固定化酶的周围形成了能对底物产生立体影响的扩散层及静电的相互作用等引起的变化总结影响固定化酶性能的因素四、固定化酶的应用药物控释载体生物传感器药物应用临床不顺利的原因:蛋白类药物被胃酸破坏；被肝和血液中的酶系统清除；难以穿透细胞膜；药物本身毒副作用；免疫问题；药物稳定性差药物新剂型发展的核心特点：从时间和空间的分布上控制药物的释放1、药物控释载体聚合物修饰用适当的水溶性高分子对药物加以修饰以改善其性能。药物的聚乙二醇(polyethyleneglycol,PEG)修饰即PEG化,是将活化的聚乙二醇通过化学方法偶联到蛋白质、多肽、小分子有机药物和脂质体上。药物的聚乙二醇修饰技术能够延长药物的半衰期,增强药物的稳定性,降低免疫原性和抗原性;改变了药物的分子结构从而改进了药物动力学和药效学的性质,提高了作用部位的血药浓度。同时,比未修饰药物表现
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纤维素基固载酶材料的制备及乙酰胆碱酯酶的固定化性能_郭明
　第29卷第10期　2013年10月高分子材料科学与工程POLYMERMATERIALSSCIENCEANDENGINEERINGVol.29,No.10Oct.2013纤维素基固载酶材料的制备及乙酰胆碱酯酶的固定化性能郭　明,燕冰宇,周　珊,王春鹏,储富祥11122(1.浙江农林大学化学系,浙江临安.中国林业科学研究院林产化学工业研究所,江苏南京210042)摘要:采用新型水热氧化合成方法制备了纤维素基质固定化乙酰胆碱酯酶载体材料―――双醛纤维素(DAC)。通过红外光谱(IR)、核磁共振(NMR)、X射线衍射(XRD)和扫描电镜(SEM)对产物进行了表征。测试了DAC固载乙酰胆碱酯酶(AChE)的酶学性能,并与交联壳聚糖(CCTS)、双醛淀粉(DAS)固载AChE的酶学性能进行比较分析,构建了酶学性能理论方程。结果表明,新型水热氧化反应制得了高醛基含量的DAC;DAC固定化AChE与CCTS和DAS固定化AChE相比,稳定性好(10次重复利用率),可在25℃～55℃和pH4.0～8.0范围保持酶活性;建立的理论方程较好地表征了固载酶的酶学性能。关键词:双醛纤维素;水热合成;固定化乙酰胆碱酯酶;结构表征;酶学性能中图分类号:TQ352　　　文献标识码:A　　　文章编号:13)10-0150-05　　酶是具有高效催化功能的生物活性物质,但游离酶在溶液中易变性失活,反应后难以分离回收利用,限制了酶的应用。将酶通过物理或化学方法制备固定化酶可以在保留酶固有活性的同时使其能被反复使用,这就极大拓宽了酶的应用范围,其已成为当前研究的前沿领域。通过固定化技术获得性能优异固载酶的关键是载体材料的制备。目前,已有多种材料用于酶的固定化,其中,纤维素衍生物是极具前景的酶固定化载体材料。但传统方法制备的纤维素衍生物载体材料不尽如人意。本工作将水热合成反应引入氧化纤维素的制备中[2,3][1]化硫代乙酰胆碱(AtchI):Sigma公司;5,5-二硫二硝基苯甲酸(DTNB):Sigma公司;其他试剂均为分析纯,实验用水为双蒸蒸馏水。1.2　氧化纤维素的水热合成微晶纤维素(MCC)置于14%NaOH溶液中活化润胀24h,蒸馏水洗至中性。活化微晶纤维素与1∶2倍质量的NaIO4置于水热合成反应釜(25mL,不锈钢外套,聚四氟乙烯内衬)内胆中,蒸馏水填充系数0.6～0.9,130℃密闭水热合成反应8h,洗涤固体,抽滤干燥,碱消耗法测定样品中醛基含量[6]。,将合成的性能优良的固载材料应用于乙1.3　水热合成纤维素衍生物的结构表征IRPrestige-21型傅里叶变换红外光谱仪(Shi-madzu,日本)测定样品的红外光谱,扫描范围500cm-1～4000cm-1。AVANCEII/400MHz(Bruker,瑞士)核磁共振仪测定样品的CP/MAS1313酰胆碱酯酶(AChE)的固定化。AChE能够选择性地催化底物乙酰胆碱水解,AChE在环保、医学、生化等领域用途广泛[4,5]。制备的新型氧化纤维素基固载乙酰胆碱酯酶具有良好的酶学性能。1　实验部分1.1　实验试剂纤维素:层析级,粒度90μm,AcrosOrganics公司;壳聚糖:脱乙酰度≥90%,国药集团化学试剂有限公司;双醛淀粉:醛基含量&80%,北京鑫鼎有限公司;乙酰胆碱酯酶:200u/g,上海源叶生物科技有限公司;碘C-NMR固体核磁谱,观测频率C75MHz,魔角自旋速度3.8MHz,分辨率4.88Hz,内参考物为氨基乙酸。XRD6000型粉末衍射仪(Shimadzu,日本)分析样品的结晶度,定性、步进扫描方式,扫描范围2θ=5°～50°,Cu靶。SS-550型扫描电镜(Shimadzu,日本)观察分析样品的表观形貌,样品制样方法为干燥样品置于SS-550-IC型溅射仪中,15mA电流下喷金90s。收稿日期:基金项目:国家国际科技合作专项项目(2011DFA32440);浙江省科技厅重大科技专项()通讯联系人:郭　明,主要从事生物质材料研究,　E-mail:guoming@　第10期郭　明等:纤维素基固载酶材料的制备及乙酰胆碱酯酶的固定化性能1511.4　固定化乙酰胆碱酯酶的性能测试及分析1.4.1　固定化乙酰胆碱酯酶的制备及酶活力测定:氧化双醛纤维素、戊二醛交联壳聚糖(3%戊二醛37℃交联1.5h)、双醛淀粉均匀分散于0.1mol/L的磷酸缓冲溶液(PBS,pH=7.4)中,加入乙酰胆碱酯酶,28℃搅拌反应6h后取出分离,二次蒸馏水洗涤至无游离乙酰胆碱酯酶。紫外法测定游离乙酰胆碱酯酶与固定化乙酰胆碱酯酶的活力[7]。凯氏定氮仪(VELP,意大利)测定载体上固载酶的氮含量W(N)。1.4.2　温度与pH对酶活力的影响测定:将制备的固定化酶和游离酶在不同温度和不同pH条件下进行酶促反应,按1.4.1节方法测定酶活力。1.4.3　固定化酶的稳定性测试及米氏常数测定:固定化乙酰胆碱酯酶与底物AtchI在32℃连续反应10次,滤出固定化酶,洗净后测定酶活力并进行比较分析。测定游离AChE与固定化AChE酶催化分解0.01mol/L～0.08mol/L底物溶液体系(0.05mol/LPBS,pH=7.4)的反应速率,用底物浓度的倒数和反应速率的倒数作图,线性拟合获得米氏常数Km。2　结果与讨论2.1　氧化纤维素的水热合成水热合成法制备氧化纤维素的方程式如Fig.1所示
。IR谱图如Fig.2所示。从Fig.2可见,DAC的特征峰出现在1732cm-1和880cm-1左右。1732cm-1是羰基特征吸收峰;880cm出现半缩醛振动吸收峰。DAC-A在1732cm的吸收峰强度明显高于DAC-B,1025cm-1的吸收峰强度低于DAC-B,由此可以说明DAC-A的氧化度要高于DAC-B。2.2.2　核磁共振表征:CP/MAS13-1-1C-NMR对比分析DAC与MCC的结果见Fig.3。MCC的C1、C4和C6谱线分裂为尖窄的的低场和宽阔的高场,分别对应结晶区和非结晶区组分。δ=105.12、88.86、65.23、103.69、83.7和63.08分别对应结晶区和非结晶区的C1、C4、C6。δ=70.99～74.61强吸收信号来自于结晶区和非结晶区的C2、C3和C5。DAC的13C-NMR在δ200左右没有出现羰基吸收信号(理论上存在),可能是DAC中醛基以半缩醛形式存在造成的。　　Fig.3　CP/MAS13C-NMRSpectroscopyofMCCandDACFig.1　EquationofCelluloseOxidized　　水热合成法制备的氧化纤维素(DAC-A)的醛基含量为82.1%,传统方法制备的氧化纤维素(DAC-B)的醛基含量为63.4
%。　　DAC-B与MCC相比,信号峰的位置没有明显偏移,高场信号有所加强,由此判断DAC-B中的非结晶区组分少量增加。DAC-A与MCC相比,信号峰的位置发生微小偏移,但未出现明显的尖窄结晶峰。推断由于反应条件比较剧烈,DAC-A中大量的结晶区转变为非结晶区。Fig.2　IRSpectraofMCC,DAC-AandDAC-B2.2　水热合成氧化纤维素的结构表征2
.1　　Fig.4　X-RayDiffractionSpectraofMCC,DAC-A,DAC-B152高分子材料科学与工程2013年　2.2.3　X射线衍射分析:Fig.4为MCC、DAC-A、DAC-B的XRD图,结晶度Xc按公式Xc=Sc/(K×Sc+Sa)计算(其中:Sc―――XRD谱中晶区面积;K―――校正因子;Sa―――XRD谱中非晶区面积)。经计算,MCC的结晶度为57.7%,DAC-A的结晶度为32.2%,DAC-B的结晶度46.4%。DAC-B与MCC相比,衍射峰的位置没有发生明显变化,衍射峰的强弱发生了改变,因此,DAC-B保持了MCC原有的纤维素晶形,结晶度为46.4%。DAC-A在2θ=18.9°处只有1个非晶衍射峰,说明水热氧化反应发生时,由于反应条件的改变,纤维素分子链遭到一定程度地破坏,纤维素的晶区遭到破坏,非晶区更趋于无定型化,峰型趋于单一,结晶度降至32.2%。2.2.4　表观形貌分析:扫描电镜对MCC和DAC进行了表观形貌分析,如Fig.5所示
。Fig.5　SEMofMCC,DAC-AandDAC-B(×1000)　　MCC的表面十分光滑,DAC-B保留了MCC的主要形态结构,但是其主体结构由于氧化而轻微断裂,且有一些微纤维从表面露出。DAC-A分子失去了MCC的分子链特征,颗粒性较强,表面凹凸不平,裸露的活性反应基团可为乙酰胆碱酯酶提供更多的活性结合位点。2.3　固定化乙酰胆碱酯酶的酶学性质新型方法制备的氧化纤维素载体(DAC-A)的醛基含量较传统方法制备的产物(DAC-B)明显提高,以DAC-B为载体制备的固定化酶的酶学性质不在此处讨论。本工作以DAC-A为载体固载AchE,并与交联壳聚糖(CCTS)、双醛淀粉(DAS)固定化AchE的酶学性质进行了比较分析。2.3.1　固定化乙酰胆碱酯酶含量的测定:分别以DAC-A、CCTS、DAS为载体固定化乙酰胆碱酯酶,测定载体的酶蛋白含量,结果列于Tab.1。Tab.1　ComparisonofPropertiesBetweenDAC-A,CCTSandDASSampleDACCCTSDASAldehydegroup82.184.381.2Nitrogencontent2.672.312.78AchEcontent16.　　从Tab.1可见,3种载体材料的醛基含量相近,新方法制备的DAC载体携带的酶量高于载体CCTS,与DAS接近,可能是水热合成方法得到的氧化纤维素材料的粒径短、表面粗糙、比表面积大,酶与载体接触的空间位阻小,不但可以化学键连接而且可以物理吸附酶分子,整体达到化学交联-物理吸附酶的效果。2.3.2　温度对酶活力的影响:分别对游离酶和3种固定化酶在不同温度的活力进行测定,结果见Fig.6,拟合方程列于Tab.2
。Fig.6　EffectofTemperatureandpHValueontheEnzymaticActivity　　如Fig.6所示,游离AChE的最适动力学反应温度为32℃,温度达到65℃,游离酶即失活。以DAC、　第10期郭　明等:纤维素基固载酶材料的制备及乙酰胆碱酯酶的固定化性能153CCTS、DAS为载体制备的固定化AChE的最适反应温度分别为35℃、45℃、42℃,3种固定化乙酰胆碱酯酶的最适反应温度较游离酶均有提高,表现出一定的热稳定性。其中,DAC固定化乙酰胆碱酯酶在25℃～55℃温度范围内仍保持较高的酶活力,相对酶活力均保持在75%以上。2.3.3　pH对酶活力的影响:测定游离AChE和固定化AChE的最适作用pH值,数据如Fig.6所示,拟合方程如Tab.3所示。Tab.2　EquationfortheEffectofTemperatureonEnzymeActivityEnzymesystemAchEDACCCTSDASEquation(x-58.7--215.7×494.4381(x-62.7--215.6×(x-42.0706y=-74.7103+-266.8×(x-37.32877y=-101.9858+-268.1×R0..y:x:temperatureTab.3　EquationfortheEffectofpHontheEnzymaticActivityEnzymesystemAchEDACCCTSDASEquation32.5998(x-6.3+-21.2×106.7484(x-7.4+-23.6×60.639(x-.7089+-23.6×30.2+-221.×R0..y:x:pH　　如Fig.6所示,游离AChE的最适动力学反应pH为6.9,DAC、CCTS、DAS固定化AChE的最适反应pH分别为7.2、6.4、7.5。AChE经固定化后最适作用pH均有不同程度的改变,表现为固定化酶在较宽pH范围保持较高的酶活力。在测量pH范围内,DAC固定化AChE的相对酶活力均保持在80%以上,表现出
良好的pH耐受性,CCTS固定化AChE的最适pH向酸性方向偏移,可能是高浓度H条件下,壳聚糖上氨基被质子化的缘故。游离酶经过固定化后,固定化酶的耐酸碱性提高。所得数据非线性拟合,发现游离AChE与固定化AChE较好符合高斯方程。+Fig.7　TheStabilityandLieweaver-BurkCurvesofImmobilizedEnzyme2.3.4　固定化乙酰胆碱酯酶的稳定性:通过连续测定固定化AChE的活力,酶活力的关系,如Fig.7所示,拟合方程列于Tab.4。从Fig,3AChE均表现154高分子材料科学与工程2013年　出良好的稳定性,重复使用10次后相对酶活力均保持在60%以上。其中以DAC固定化AChE的重复使用性最佳,稳定性能曲线下降平稳,重复使用10次后酶活力保持在84%左右。对所得稳定性数据非线性拟合,发现DAC与CCTS固定化AChE符合指数衰减方程,DAS固定化AChE符合单峰高斯方程。Tab.4　EquationfortheStabilityofImmobilizedAChEEnzymesystemDACCCTSDASEquationy=85.5exp-xxR0..9886y=-exp(x-2.2y=63.1846-223.×y:x:usingtimes2.3.5　米氏常数Km的测定:将米氏方程[8]两侧取双倒数,得到方程式(1)。用底物浓度Cs的倒数和反应速率vs的倒数作图,线性拟合结果如Fig.7所示。Kmvvmax[S]vmaxTab.5　EquationofLieweaver-BurkEnzymesystemAchECCTSDACDASEquationy=0.44xy=0.39xy=0.86xy=0.8xR0..Km1.181.171.361.34水热合成方法制备的氧化纤维素固定化乙酰胆碱酯酶与交联壳聚糖和双醛淀粉固定化的乙酰胆碱酯酶相比,稳定性能优越,重复使用率高,可在较宽温度和pH范围内保持较高的酶活力,是一种优良并具有广泛应用前景的载体材料。同时,本工作构建的固载酶性能的理论方程,可较好地表征固载酶的酶学性能。参考文献:[1]　NoriyukiI,LeeDS,KwonYJ,etal.Immobilizationofproteinoncellulosehydrogel[J].Cellulose,):.[2]　TavolaroA,RiccioLL,TavolaroP.Hydrothermalsynthesisofzeo-litecompositemembranesandcrystalsaspotentialvectorsfordrug-deliveringbiomaterials[J].MicroporousandMesoporousMaterials,):62-70.[3]　SirvioJ,LiimatainenH,NiinimakiJ,etal.Dialdehydecellulosemi-crofibersgeneratedfromwoodpulpbymilling-inducedperiodateoxi-dation[J].CarbohydratePolymers,):260-265.[4]　RosengartenB,PaulsenS,BurrO,etal.Neurovascularcouplinginalzheimerpatients:Effectofacetylcholineesteraseinhibitors[J].NeurobiologyofAging,):.[5]　GillR,BahshiL,FreemanR.OpticaldetectionofglucoseandacetylcholineesteraseinhibitorsbyH2O2-sensitiveCdSe/ZnSquan-tumdots[J].AngewandteChemie,):.[6]　InglesbyMK,ZeronianSH.Theaccessibilityofcelluloseasdeter-minedbydyeadsorption[J].Cellulose,):165-181.[7]　YangZP,SiSH,ZhangCJ.Studyontheactivityandstabilityofureaseimmobilizedontonanoporousaluminamembranes[J].Micro-porousandMesoporousMaterials,-3):359-366.[8]　GolicnikM.EvaluationofenzymekineticparametersusingexplicitanalyticapproximationstothesolutionoftheMichaelis-Mentenequa-tion[J].BiochemicalEngineeringJournal,):234-238.(下转第159页。tobecontinuedonP.159)(1)y:recix:reciprocalofconcentration　　由Tab.5可知,游离AChE和固定化AChE的表观米氏常数分别为1.18mmol/L、1.17mmol/L、1.36mmol/L与1.34mmol/L。米氏常数Km是反映酶与底物结合力的参数,Km越小则酶与底物亲和力越大。固定化酶的Km增大,表明固定化酶对底物的亲和能力较游离酶均有不同程度的减小。3　结论本研究将水热合成反应用于氧化纤维素的制备中,在一定温度和压力下,纤维素的氧化反应均匀进行,可较好地克服多相介质反应只发生在表面,反应不均匀的缺点,制备出的双醛纤维素较传统方法制备的产物具有醛基含量高,粒径小,比表面积大的明显优势。这为后续固定化过程中,乙酰胆碱酯酶的附着了提供较多的结合位点和空间。　第10期刘　欣等:动态硫化氢化丁腈橡胶/三元共聚尼龙热塑性弹性体的制备与性能):477-478.159thermoplasticelastomers[J].RubberChemistryandTechnology,PreparationandMechanicalPropertiesofDynamicallyVulcanizedHydrogenatedNitrileRubber/TernaryCopolymerizationNylonBlendsXinLiu,WeiZheng,LifenZhao,CaihuaZhou,HuJiang,LeiLiang(KeyLaboratoryofMarineAnti-WearandCorrosionMaterial,ShandongUniversityofScienceandTechnology,Qingdao266590,China)ABSTRACT:Athermoplasticvulcanizateofhydrogenatednitrilerubberandternarycopolymerizationnylonwithex-cellentmechanicalpropertieswaspreparedbydynamicvulcanization.Differentvulcanizationcharacteristiccurvesshowthatthecrosslinkingdegreeofsulfurvulcanizationsystemislowwhileofthedicumylperoxide(DCP)vulcan-izationsystemishigh.Theeffectofpolyamide(PA)contents,processingtemperatureandreprocessingtimesonthermoplasticvulcanizate(TPV)wasinvestigated.Theresultsshowthatthebestprocessingtemperatureis170℃andtensilestrengthdecreasesafterreprocessing,meanwhile,thetensilestrengthincreaseswithincreasingPAcon-tent.Themorphologyimagesobservedby(SEM)showtheformoftwo-phasestructure,andthedispersedphaseofhydrogenatednitrilerubber(HNBR)ismicronparticlesdispersedinthecontinuousphaseofPA.ThedistributionofHNBRparticlesbecomesmoreuniformwiththeincreaseofPAcontent,andtheparticlesizedecreasessignificantlywhichisbetween0.5μmand1μm.Keywords:hydroternarycmorphology(上接第154页。continuedfromp.154)SynthesisofCellulose-BasedEnzymeMatrixMaterialsandthePerformanceofImmobilizedAChEMingGuo1,BingyuYan1,ShanZhou1,ChunpengWang2,FuxiangChu2(1.DepartmentofChemistry,ZhejiangAgriculture&ForestryUniversity,Lin'an311300,C2.InstituteofChemicalIndustryofForestProducts,ChineseAcademyofForestry,Nanjing210042,China)ABSTRACT:Dialdehydecellulose(DAC)waspreparedbyhydrothermaloxidationsynthesismethod.Thestructure13wascharacterizedbyIR,crosspolarizationmagicanglespinning(CP/MAS)C-NMR,XRDandSEM.Theenzy-maticcharacteristicsofDACimmobilizedacetylcholinesterase(AChE)werecomparedwiththoseofchitosan-basedimmobilizedAChEanddialdehydestarch-basedimmobilizedAChE.Thetheoreticalequationsofenzymaticcharacter-isticswereestablished.TheexperimentalresultsshowthatthealdehydegroupcontentofDACishigh.Thedialde-hydecellulose-basedimmobilizedAChEhasbetterstability(10timesreusagerate)andcanmaintaintheenzymeac-tivityatthetemperatureof25℃～55℃andpHof4.0～8.0.Thetheoreticalequationscanbeabletocharacterizetheenzymaticcharacteristics.Keywords:himmobilizedAChE;strucenzymaticcharacteristics
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固定化酶的酶学性质研究
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　　酸性蛋白酶（acidprotease）是指具有较低最适pH值的蛋白酶，其最适pH值在2.5~5.0之间，在此酸性环境下将蛋白质进行水解，通过内外酶切作用将蛋白质水解为小肽和氨基酸[1].酸性蛋白酶广泛应用于酒类、食醋及酱油的酿造等方面[2-8].
　　游离态酶稳定性较差、易失活、不能反复使用，通过固定化酶（immobilizedenzyme）技术可以克服游离酶应用的局限性，把酶束缚在一定空间中或水不溶性载体上，既能限制酶分子的自由流动，又能使酶发挥催化作用[9].
　　海藻酸钠（sodiumalginate,SA）因其温和的凝胶型和无毒性，使它成为最广泛的固定化材料之一[10-12].以SA作为固定化载体材料存在的缺点是其机械强度不够大，这可以通过选择适当的增硬剂来解决[13].阿拉伯胶、卡拉胶、黄原胶均具有良好的机械强度、高内聚力、高稳定性、成膜性等优点，广泛运用于食品加工、医药等领域，与SA复合使用可以增加固定化载体的硬度。
　　目前已有将无机载体或SA等单一天然胶体作为固定化载体材料进行固定化酸性蛋白酶研究的报道[14-17],而将复合天然高分子胶体作为固定化酸性蛋白酶载体的研究则鲜有报道。本实验使用SA分别与3 种天然高分子胶体复合制备固定化酶载体吸附酸性蛋白酶，研究复合凝胶浓度、凝胶比例、CaCl2浓度、固化时间、给酶量、吸附时间、酶液pH值等因素对复合胶体固定化酸性蛋白酶酶活回收率的影响。选择出最优载体进行固定化酸性蛋白酶的制备，对固定化酶的酶学性质进行研究，拟为固定化酸性蛋白酶的实际应用提供理论依据。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料与试剂
　　食品级酸性蛋白酶（酶活力100000U/g） 苏柯汉生物工程有限公司；食品级海藻酸钠 青岛迈潮海洋科技发展有限公司；食品级阿拉伯胶 艾纳提化工科技有限公司；食品级卡拉胶 福建省绿麒食品胶体有限公司；食品级黄原胶 淄博中轩生化有限公司；其他试剂均为分析纯。
　　1.2 方法
　　1.2.1 游离酸性蛋白酶活力的测定
　　酸性蛋白酶活力的测定采用Folin-酚法（GB/T《蛋白酶制剂》）。酸性蛋白酶活力定义为单位质量的酸性蛋白酶在40 ℃、pH 3.0的条件下，1 min内酶解酪蛋白产生1&g酪氨酸为1 个酶活力单位（U）。
　　1.2.2 固定化酸性蛋白酶活力的测定
　　取一定质量的固定化酶测定其酶活力，测定方法与游离酸性蛋白酶的测定方法相同。
　　1.2.3 相对酶活力及酶活回收率的计算
　　设定同组酶活力最高的相对酶活力为100%,以同组最高酶活力为参照，计算出的比值为相对酶活力。【1】
　　1.2.4 固定化酸性蛋白酶的制备方法
　　以载体溶液总体积30 mL计，设定复合凝胶质量浓度1.8g/100mL,SA与各胶体质量比为1∶1,称取适量的阿拉伯胶、卡拉胶、黄原胶，分别和SA于60 ℃以下热水中溶解，混合均匀，超声波快速消泡至复合凝胶中无气泡，使用10 mL注射器以约1 滴/s的速率，将复合凝胶滴到质量浓度为4.0g/100mL的CaCl2溶液中，在4 ℃冰箱中固化1.5 h,用纱布滤出载体颗粒，并用缓冲液冲洗3~5 次除去表面的CaCl2.用滤纸吸干表面水分，放入pH 3.0,给酶量1760U/g的酶液中进行吸附，吸附0.5 h后用纱布滤出载体颗粒，用缓冲液清洗，并用滤纸吸干表面的水分。制成的球状颗粒，即所得的固定化酶，在0~4 ℃条件下保存。
　　1.2.5 酸性蛋白酶固定化条件的优化设计
　　1.2.5.1 单因素试验复合凝胶质量浓度对固定化酶活力的影响测定：复合凝胶质量浓度设定在0.6~2.8g/100mL,每隔0.2g/100mL进行测定，其他因素按照1.2.4节方法制备固定化酶，测定其酶活力。
　　凝胶比例对固定化酶活力的影响测定：取复合凝胶质量浓度为各复合凝胶最适条件，海藻酸钠与各胶体质量比例设定为2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1,其他因素按照1.2.4节方法制备固定化酶，测定其酶活力。
　　CaCl2质量浓度对固定化酶活力的影响测定：取各已测指标的最适条件，CaCl2质量浓度设定为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0g/100mL,其他因素按照1.2.4节方法固定化制备酶，测定其酶活力。
　　固化时间对固定化酶活力的影响测定：取各已测指标的最适条件，固化时间设定为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h,其他因素按照1.2.4节方法制备固定化酶，测定其酶活力。
　　吸附时间对固定化酶活力的影响测定：取复合凝胶质量浓度、复合凝胶质量比、CaCl2质量浓度、固化时间最适条件，吸附时间设定为1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h,其他因素按照1.2.4节方法制备固定化酶，测定其酶活力。
　　酶液pH值对固定化酶活力的影响：取复合凝胶质量浓度、复合凝胶质量比、CaCl2质量浓度、固化时间、吸附时间均为各复合凝胶最适条件，酶液pH值设定为2.5、3.0、3.5、4.0、4.5,其他因素按照1.2.4节方法制备固定化酶，测定其酶活力。
　　给酶量对固定化酶活力的影响测定：取复合凝胶质量浓度、复合凝胶质量比、CaCl2质量浓度、固化时间、吸附时间、酶液pH值最适条件，给酶量设定为1 100、1 320、1 540、1 760、1 980、2 200、2420U/g,按照1.2.4节方法制备固定化酶，测定其酶活力。
　　1.2.5.2 正交试验优化固定化工艺在单因素试验的基础上，选出对固定化过程影响较大的3 个因素，每个因素设定3 个水平，以酶活回收率作为评价指标，采用L9（33）正交表对固定化条件进行优化试验。
　　1.2.6 固定化酸性蛋白酶酶学性质的研究
　　1.2.6.1 固定化酶的最适反应pH值测定取一定量的固定化酶及游离酶，以质量分数为1%酪蛋白为底物，不同pH值缓冲液中，30 ℃保温振荡反应10 min,测定其酶活力。
　　1.2.6.2 固定化酶的最适作用温度测定取一定量的固定化酶及游离酶，以1%酪蛋白为底物，不同温度条件下，pH 3.0缓冲液中保温振荡反应10 min,测定其酶活力。
　　1.2.6.3 固定化酶的热稳定性测定取一定量的固定化酶及游离酶在无底物的条件下，pH 3.0的缓冲液中，在不同温度条件下加热处理30 min后，迅速冷却。45 ℃条件下，测定其酶活力。
　　1.2.6.4 固定化酶的动力学性质以米氏常数Km来表示。取一定量的固定化酶及游离酶，在不同底物质量浓度条件下，于45 ℃、pH 3.0缓冲液中保温振荡反应10 min,测定其酶活力，采用双倒数作图法计算米氏常数Km值。
　　1.2.7 固定化酶操作半衰期的计算
　　固定化酶的操作稳定性是最影响使用的关键因素。
　　固定化酶的操作稳定性通常用半衰期表示，即固定化酶活力下降为初始酶活力一半所经历的连续工作时间。设定酶活力损失同时间成指数关系，半衰期公式可表达为：【2】
　　2 结果与分析
　　2.1 载体选择及固定化条件单因素试验结果
　　2.1.1 复合凝胶质量浓度对固定化酶活力的影响【3】
　　由图1可知，3 种载体固定化酶活力随着复合凝胶质量浓度的增大均呈现先增大后降低的趋势，这是由于当质量浓度过大时载体表面孔隙紧密，不利于酶的吸附。
　　质量浓度为2.0g/100mL的SA-卡拉胶复合凝胶制成的固定化酶酶活力最高。
　　2.1.2 复合凝胶质量比对固定化酶活力的影响【4】
　　由图2可知，3 种载体固定化酶活力随着复合凝胶质量比的增大均呈现先增大后降低的趋势，质量比例为4∶1的SA-卡拉胶复合凝胶制成的固定化酶活力最高。
　　2.1.3 CaCl2质量浓度对固定化酶活力的影响【5】
　　由图3可知，3 种载体固定化酶活力随着CaCl2质量浓度的增大均呈现先增大后降低的趋势，这是因为SA与CaCl2的作用是由离子强度所决定，离子强度越强，与SA的作用越明显；但是当强度过大时，蛋白酶的活力会受到离子强度的影响而降低。质量浓度为4.0g/100mL的SA-黄原胶复合凝胶制成的固定化酶活力最高。
　　2.1.4 固化时间对固定化酶活力的影响【6】
　　由图4可知，固化时间对SA-阿拉伯胶、SA-黄原胶为载体的固定化酶活力影响较大，固化时间为2.5 h的SA-黄原胶复合凝胶制成的固定化酶活力最高。
　　2.1.5 吸附时间对固定化酶活力的影响【7】
　　由图5可知，吸附时间对SA-卡拉胶、SA-黄原胶为载体的2 种固定化酶活力影响较小，吸附时间为2.5 h的SA-黄原胶复合凝胶制成的固定化酶活力最高。
　　2.1.6 酶液pH值对固定化酶活力的影响【8】
　　由图6可知，3 种载体固定化酶活力随着酶液pH值的增大均呈现先增大后降低的趋势，酶液pH值为3.5的SA-黄原胶复合凝胶制成的固定化酶活力最高。
　　2.1.7 给酶量对固定化酶活力的影响【9】
　　由图7可知，3 种载体固定化酶活力随着给酶量的增大均呈现先增大后降低的趋势，这是由于一定质量的载体可吸附的酶量有限，当载体的吸附酶量达到饱和后继续增加给酶量反而会影响酶的继续吸附效果。
　　给酶量为2200U/g的SA-黄原胶复合凝胶制成的固定化酶活力最高。
　　2.1.8 正交试验优化固定化工艺条件
　　在单因素试验的基础上，选出对固定化过程影响较大的3 个因素，每个因素设定3 个水平，以酶活回收率作为评价指标，采用L9（33）正交表对固定化条件进行优化试验。SA-阿拉伯胶正交试验选择因素为复合凝胶质量比、CaCl21择因素为复合凝胶质量浓度、复合凝胶质量比、CaCl2质量浓度，SA-黄原胶正交试验选择因素为复合凝胶质量比、CaCl2质量浓度、固化时间。由表1~3可知，在以酶活回收率为评价指标时，3 种复合载体的固定化酶活回收率理论最优水平分别为A1B2C2、D2A1B3、A3B3C2,影响因素的主次顺序分别为B&A&C、D&B&A、C&A&B.3 种载体固定化酶的实际酶活回收率最优水平分别为A1B2C2、D2A1B3、A3B2C3,以SA-阿拉伯胶、SA-卡拉胶为载体的固定化酶的理论优水平与实际优水平一致，其酶活回收率分别为65.34%、48.23%;以SA-黄原胶为载体的固定化酶的理论优水平与实际优水平不一致，因此，通过验证实验验证理论最优组合和实际最优组合中最好的组合以确定最佳固定化条件，验证实验结果为理论最优组合A3B3C2酶活回收率为74.12%,实际最优组合A3B2C3酶活回收率为73.07%,确定SA-黄原胶的最佳固化条件为A3B3C2,其酶活回收率为74.12%.综上，SA-黄原胶的复合凝胶为3 种复合凝胶中固定化酸性蛋白酶的最佳载体，其酶活回收率最高。所以选择SA-黄原胶复合凝胶为载体材料进行酸性蛋白酶固定化的研究。
　　2.2 SA-黄原胶为载体的固定化酸性蛋白酶的酶学性质
　　2.2.1 固定化酸性蛋白酶的最适反应pH值由图8可知，pH值对固定化酸性蛋白酶及游离酶活性均有较大影响，两者的活力均随着pH值的升高呈现先增加后减小的趋势，在pH 3.0时达到最大值。
　　2.2.2 固定化酸性蛋白酶的最适作用温度由图9可知，温度对酸性蛋白酶的活力有着显着影响。随着温度的升高，酸性蛋白酶活力随之增加，但是温度的不断升高亦会使酶蛋白逐渐变性，导致酶活力下降。在温度为45 ℃时，游离酶与固定化酶活力均达到最高，且固定化酶相对活力略高于游离酶。2.2.3 固定化酸性蛋白酶的热稳定性由图10可知，在低于40 ℃时，两种酶的相对活力下降低为缓慢，高于40 ℃后两种酶活力降低较为明显，而固定化酶活力降低较游离酶缓慢，表明固定化酸性蛋白酶的热稳定性明显高于游离酶。
　　2.2.4 固定化酸性蛋白酶的动力学性质由图11可知，固定化酶Km值为18.93mg/mL,大于游离酶Km值（9.98mg/mL），表明固定化酶的底物亲和力小于游离酶。
　　2.2.5 固定化酶的操作半衰期操作半衰期是评价固定化酶是否具有实用性的重要指标，称取适量固定化酶测其初始酶活力，同时称取相同质量的固定化酶，以1%酪蛋白为底物进行反应，做2 组重复，每隔2d进行一次测定，根据1.2.7节计算该固定化酶的操作半衰期为17.28d.
　　固定化酶在经过使用后，酶活力有所下降，这是因为酶经过几次使用后，某些酶与载体连接不够紧密，固定在载体表面的酶有部分脱落，但相对游离酶只能使用一次而言，固定化酶的使用效率明显提高。
　　3 结论与讨论
　　目前，将固定化技术应用于酸性蛋白酶的研究报道并不多见。Ganesh Kumar等[14]用无机载体活性炭进行酸性蛋白酶的固定化实验。赵赣[15]、贾莉[16]等使用包埋法将酸性蛋白酶进行固定，苗敬芝等[17]使用包埋-交联法将酸性蛋白酶与木瓜蛋白酶进行共固定。蛋白质属于大分子物质，而使用包埋法制备的固定化酶载体会影响酶与大分子底物的接触效果，所以经包埋法所制成的固定化蛋白酶很难对底物蛋白质起到较好作用[18-19].本实验选用吸附法进行酸性蛋白酶的固定化实验，所制得的固定化酸性蛋白酶酶活回收率高于包埋法。
　　本实验采用的是物理吸附法，而任琦[20]研究磁性微球吸附牛血清蛋白时得出化学法吸附的PMMA-co-PGMA-CHO微球相较物理方法吸附的PSt-co-PAMPS微球吸附量更大且对蛋白质的影响更小的结论，因此，可以选择化学吸附法对酸性蛋白酶进行进一步固定化研究。此外，对传统吸附法进行部分改进或者将吸附法与其他传统方法进行联合使用也是固定化蛋白酶方法的发展趋势[21].
　　本实验的载体选择了3 种天然胶体即阿拉伯胶、卡拉胶、黄原胶与SA混合进行复合凝胶的制备，而每种胶体的物理特性都会有很大差异，因此3 种胶体可能具有一定局限性，在以后的酸性蛋白酶固定化实验研究中可以选择更多更广的食品级天然胶体与SA进行复合凝胶的制备来选择最佳固定化酸性蛋白酶的载体。
　　酶的本质是蛋白质，其性质取决于酶蛋白本身特有的高级结构和活性中心基团。固定化过程中所涉及的物理、化学、生物因素以及载体本身都可能引起酶活性中心基团的改变。同时载体的存在也会产生一定的空间位阻和屏蔽作用，这些都有利于酶分子抵御外界环境的变化，因此经固定化处理的酶稳定性通常会较游离酶有所提高[22-23].
　　本实验结果表明，以SA-黄原胶为复合载体所制备的固定化酸性蛋白酶相对酶活力最大，为最佳固定化载体材料。其最佳工艺条件为：复合凝胶质量浓度为2.0g/100mL、SA与黄原胶质量比例为6∶1、CaCl2质量浓度5.0g/100mL、固定化时间为2.5 h、吸附时间为2.5 h、酶液pH值为3.5、给酶量2200U/g.固定化酸性蛋白酶酶学性质的研究结果表明：固定化酶的最适pH值为3.0,最适温度为45 ℃，其热稳定性明显优于游离酶，操作半衰期为17.28d.通过扩大实验可以把固定化酸性蛋白酶应用于酒类、食醋及酱油的酿造等方面。
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