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【求助】做一个基因的RNA干扰课题大概需要多少钱
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我也准备做这样的课题，问过生物公司说要5-6万，请做过的战友也来说一下，申请经费的时候心里比较有数。
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我以前在的公司就是专门做RNA干扰的，从设计SIRNA到包出该片段的病毒大概要30000左右，你自己要买一抗和该基因的克隆，做功能学实验，如果你要做动物实验还要考虑动物的费用。大概跟楼上的兄弟差不多
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构建载体4~5k病毒包装1.5~2w这是外面做的价格，如果自己做，便宜一些关键看你自己要做哪些方面
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呵呵据THERMO技术工程师说RNA干扰成功率不高的他们是这方面的老大:P你可以去他们网站看看的
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ecust小熊 edited on
补充：一般情况下你很难保证只抑制你所期望的基因一般都是抑制了好几个基因这使得你无法断定是哪个基因在起作用所以如果lz非要做的话可以考虑去大公司看看虽然收费高但是成功率会高一些当然在你准备做之前最好“货比三家”多和他们公司的工程师交流一下
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这个要看是不是常规方法转染啦，常规脂质体的话细胞6K~8K就可以拿下，如果包装慢病毒转染的话，要12K～20K不等吧！我们公司就做的，可以PM我
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DXY All Rights Reserved.利用RNA干扰抑制MCF-7细胞中CTCF基因的表达--《陕西师范大学》2010年硕士论文
利用RNA干扰抑制MCF-7细胞中CTCF基因的表达
【摘要】：
CCCTC-binding factor (CTCF)是一个广‘泛表达并具有11个锌指(ZF)结构的核蛋白,CTCF最初是作为接合于鸟类和哺乳类MYC基因启动子上的转录因子被发现的。CTCF作为真核生物中非常重要的转录因子参与多方面的基因调节,包括基因激活、抑制、沉默、绝缘。同样它还参与调节印迹基因的表达和X-染色体失活作用。近来研究发现CTCF在介导远距离染色质之间以及染色质内部相互作用中起到了非常重要的作用,这些研究还进一步说明CTCF是一个非常重要的染色质绝缘子蛋白,它可能在介导远距离染色质之间相互作用中起到一个中枢的作用。由于RNAi具有基因敲除的功能,借助RNAi机制,研究人员得以迅速简便地降低细胞中某个特定基因的表达,实现类似“基因敲除”的效果,从而分析目标基因的表达改变对细胞产生的影响,来进一步研究目标基因的未知功能。
本课题采用RNA干扰的方法对细胞中CTCF基因进行沉默,通过建立CTCF基因沉默的细胞系为以后比较CTCF在沉默之前和沉默之后对由CTCF介导的染色质之间的相互作用关系的研究奠定了一个坚实的基础。其技术路线为首先选择CTCF基因mRNA不同的4个靶位点设计不同的敲除载体(pSilencer1～4),然后通过转染、抗生素加压筛选的方法获得稳定转染敲除载体的4株细胞系,最后利用蛋白免疫印迹和荧光定量PCR的方法来检测稳定转染敲除载体的细胞和野生型细胞之间CTCF的蛋白表达水平和mRNA表达水平。从而分析RNA干扰对CTCF的敲除效率。同时本课题还成功构建了一个CTCF拯救载体这为以后的CTCF拯救实验打下了基础。
结果稳定转染敲除载体的细胞与野生型的细胞相比细胞内CTCF的蛋白水平和mRNA水平都在下调,但是发现CTCF并没有完全被沉默。还发现mRNA靶位点跨内含子的敲除效率明显高于靶位点位于外显子内部的敲除效率,其中靶位点在外显子内部越是靠近5'端敲除效率越明显。
【关键词】：
【学位授予单位】：陕西师范大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2010【分类号】：Q78【目录】：
Abstract4-8
第一部分 引言8-15
1.1 CTCF介绍8-11
1.2 RNAi介绍11-15
第二部分 siRNA转染载体的构建15-23
2.1 材料15
2.1.1 质粒、载体、序列15
2.1.2 工具酶与试剂15
2.1.3 LB培养基15
2.1.4 实验仪器15
2.2 方法15-20
2.2.1 几种敲除CTCF基因mRNA发夹(SiRNA)的设计思路16-17
2.2.2 几种发夹结构寡核苷酸模板引物的设计结果17-18
2.2.3 合成的寡核苷酸SiRNA模板进行退火18
2.2.4 退火后的寡核苷酸siRNA模板与_pSilencer载体连接18-19
2.2.5 转化大肠杆菌感受态细胞DH5a19
2.2.6 质粒提取、琼脂糖凝胶电泳与测序19-20
2.2.7 敲除质粒双酶切反应20
2.3 结果20-22
2.3.1 阳性克隆的鉴定20-22
2.4 结果讨论22-23
2.4.1 质粒提取时需要注意几点22
2.4.2 敲除质粒双酶切结果分析22
2.4.3 提取质粒送去测序结果分析22-23
第三部分 稳定转染干扰CTCF基因质粒的细胞系的建立23-31
3.1.材料23
3.1.1 细胞培养、转染及加压筛选试剂23
3.1.2 待转染质粒23
3.1.3 仪器及试剂23
3.2 方法23-25
3.2.1 G418的最佳筛选浓度的确定24
3.2.2 稳定转染pEGFP质粒的细胞的筛选24-25
3.2.3 稳定转染敲除质粒的细胞筛选25
3.3 结果25-29
3.3.1 G418的最佳筛选浓度的选择26
3.3.2 稳定转染pEGFP质粒的细胞的获得26-27
3.3.3 4种敲除质粒转染时阳性对照质粒24小时后的转染效率27-29
3.3.4 敲除效率阳性对照组实验结果29
3.4 结果讨论29-31
3.4.1 筛选之前G418浓度的确定29-30
3.4.2 G418的最佳筛选浓度的确定结果分析30
3.4.3 转染效率分析30
3.4.4 敲除效率分析30-31
第四部分 CTCF干扰效率分析31-55
4.1 材料31-35
4.1.1 试剂31-34
4.1.2 仪器34-35
4.2 方法35-43
4.2.1 蛋白免疫印迹对CTCF在敲除和野生型MCF-7细胞中表达量差异性分析35-39
4.2.2 Real-Time PCR对CTCF在敲除和野生型MCF-7细胞中表达差异性分析39-43
4.3 结果43-52
4.3.1 BCA法测定蛋白标准曲线结果43-44
4.3.2 蛋白浓度测定结果44
4.3.3 蛋白免疫印迹对CTCF在敲除和野生型细胞中表达差异性分析结果44-46
4.3.4 细胞总RNA核酸电泳图46-47
4.3.5 几种c DNA定量结果47
4.3.6 Real-Time PCR对CTCF在敲除细胞(MCF-7/siCTCF3)和野生型细胞中表达量差异性分析结果47-49
4.3.7 Real-Time PCR对CTCF在敲除细胞(MCF-7/siCTCF4)和野生型MCF-7细胞中表达量差异性分析结果49-51
4.3.8 Real-Time PCR对CTCF在敲除细胞(MCF-7/siCTCFl、MCF-7/siCTCF2)和野生型MCF-7细胞中表达量差异性分析结果51-52
4.4 结果讨论52-55
4.4.1 提取细胞总RNA时注意几点52-53
4.4.2 蛋白含量的测定(BCA蛋白定量试剂盒)原理53
4.4.3 Real Time PCR结果分析53
4.4.4 Western Blot结果分析53
4.4.5 Western Blot和Real Time PCR二者之间结果分析53-54
4.4.6 CTCF敲除效率分析54-55
第五部分 CTCF基因拯救载体的构建55-63
5.1 材料55
5.1.1 工具酶及载体55
5.1.2 试剂盒55
5.2 方法55-61
5.2.1 突变掉敲除位点后的CTCF-cDNA扩增55-58
5.2.2 载体p~(IRESPURO3)和CTCF-cDNA分别进行单酶切纯化、连接58-61
5.3 结果61-62
5.3.1 上下游扩增产物及重构后的CTCF-cDNA琼脂糖凝胶电泳结果61-62
5.3.2 构建好的拯救载体测序验证62
5.4 结果讨论62-63
参考文献65-70
攻读硕士学位期间研究成果80-81
稿件录用函81-82
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京公网安备75号基因敲除和基因干扰有什么区别?
冰魄°6374
应该说基因敲除是基因干扰的一个手段,主要指将目标基因沉默的现象,但是基因干扰主要是医学领域的名词.
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基因敲除包括的面比较广，从DNA到RNA都有涉及，也就是说基因敲除包括DNA碱基对的替换和修饰，而基因干扰仅仅是在翻译水平上阻止RNA的翻译，降解特定的信使，对基因本身没有什么影响！
扫描下载二维码孟山都首席技术官谈基因编辑、RNA干扰与行业并购影响_网易新闻
孟山都首席技术官谈基因编辑、RNA干扰与行业并购影响
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（原标题：孟山都首席技术官谈基因编辑、RNA干扰与行业并购影响）
孟山都首席技术官谈基因编辑、RNA干扰与行业并购影响
11月2日，世界生命科学大会期间，大会特邀嘉宾2013世界粮食奖获得者、 孟山都首席技术官罗伯特&傅瑞磊博士(Robert Fraley)接受基因农业网采访称，拜耳收购孟山都将需要15个月来完成，期间需要得到世界各监管机构的批准。此外，两公司合并后，孟山都将保持育种优势，并且会得到更广泛的市场。
傅瑞磊对两公司的合并持乐观态度，并认为这是一次积极健康的合并。通过合并，两者可扩大规模，同时得到更多研发资金，继续保持育种优势。
基因农业网：关于基因编辑的问题。之前有报道说孟山都已经在谈基因编辑的专利问题，很多人猜测孟山都很可能已经有基因编辑的产品在研发，或者是将要推出来，能不能介绍一下基因编辑产品的研发情况。
傅瑞磊：关于基因编辑，我有几点要讲。第一点我觉得基因编辑是非常让人兴奋和激动的一项技术。基因编辑是对作物进行基因修饰的一种工具。
从历史的角度来看，实际上我们一直在对作物进行基因修饰。从最早的选种、育种到分子育种，到转基因育种皆是如此。现在有了基因编辑这个非常强大的工具，比如说CRISPR系统，还有锌指核酸酶(ZFN)等是很精准的技术，那么我们可以对基因组里的每一个基因进行改良，使得我们有机会进一步提高作物的产量和质量。所以这是一个非常令人激动的重要的工具。
每一项基因编辑工具都有其优劣势，因此使用多种不同的基因编辑工具会比较实际。
那对我们自己来讲，我们也在研发基因编辑的体系，比如说孟山都现在就获得了锌指核酸酶(ZFN)精准基因组修饰技术的使用许可，用于新作物解决方案的研发及商业开发。此外，孟山都公司还在近期获得了博德研究所CRISPR-Cas基因编辑技术在农业领域应用的全球非独家许可。
基因农业网：第二个问题是关于RNA干扰产品的问题，就是说孟山都在RNA干扰产品有什么新的进展?
傅瑞磊：对于RNA技术产品的进展，我们感到非常兴奋。在我们而言，RNA技术主要是用在两个方面，第一种是控制虫害。比如说对玉米根虫(玉米根虫在美国非常普遍)，我们采用RNA干扰技术来进行干扰，使RNA有效进入根虫目标细胞，让指定的目标蛋白质进行有效以及可选择性的&沉默&或减少，从而达到控制虫害的效果。
第二个方面，就是保护蜜蜂健康。对蜜蜂来说，有一个很关键的问题，就是蜜蜂的蜂巢会受到蜂螨(一种寄生在蜜蜂体内的害虫)的侵害。利用RNA干扰(RNAi)控制蜜蜂体内蜂螨的扩散，保护蜜蜂种群免受害虫的困扰，同时对蜜蜂不会产生影响，那这样就可以提升蜜蜂的健康。
我正好有一张照片可以给你们看，就是蜜蜂和蜂螨的情况。我们利用RNAi技术可以把蜂螨杀掉，不会影响蜜蜂。这是一项非常令人激动的技术，而蜜蜂这个例子正好反映了先进生物技术能够给社会带来的巨大价值。孟山都利用RNA控制玉米的根虫的解决方案，预计两年后会商业化。
傅瑞磊博士为基因农业网记者展示蜜蜂与蜂螨图片。
基因农业网：对你个人来说，现在更看好哪类产品，是基因编辑产品，是转基因产品还是RNA干扰产品?
傅瑞磊：很多人认为有了基因编辑工具之后就不再需要传统育种、不再需要转基因技术了，实际上不是这样的。事实上，农业研发一直是多种技术协同发挥作用。即使有基因编辑技术，你仍然需要育种、需要引入外源基因、需要开发生物技术性状，这些技术相互补充，相互协作。
我觉得这就好像你在问我，哪一个孩子是我最喜欢的一样。实际上每一个技术都有自己的优势，我们需要应用所有开发出来的技术来进一步地改进作物。除了刚才所说的育种技术，再加上农业数据科学和对于微生物的研究，我们需要综合使用这些技术，来帮助世界各地的农民来更好地生产。
基因农业网：拜耳收购孟山都后，将对孟山都研发和产品规划会有哪些影响?
傅瑞磊：现在很难回答收购后对孟山都的影响。当然不同企业的收购和合并是出于不同的原因，那对于拜耳和孟山都之间的合并，我们主要是为了能够带来更多的创新，提供农民更丰富的产品和更多元的选择。我们预计将要花15个月的时间，这个合并案才能够获得世界上的各监管机构的批准。所以我们目前就是以这样的时间线来做工作。
就目前两家公司对合并的讨论情况看，拜耳公司清晰地认知到，孟山都公司在种子和性状方面具有优势，而拜耳主要的业务板块是在农化这一方面。所以这两个公司在业务上基本上没有多大的重合。所以当两个公司合并之后，孟山都原来的种子和性状的业务就将引入到新公司的种子和性状板块，基本上就保持原来孟山都的那一块。也就是说我们仍然继续保留在美国密苏里州圣路易斯的实验室和我们在全球各地的育种站。所以对我们的业务来讲，其实影响并不是太大。
两个公司合并，能够带来真正的变化，就是可以使我们节约成本。比如说我们不需要有两套IT系统，或者是财务系统，节约了成本之后，使得我们可以有更多的资金投入到研发，而在这方面，我认为是有很令人激动的。
除了能够有更强的研发能力之外，这个合并比较有吸引力的地方在于，孟山都的主要市场是在于美洲(北美和南美)，而拜耳的业务主要是在欧洲、非洲和亚洲，所以两个公司合并之后，有望成为一个更加强大的公司，能够为世界上更多的农民来提供服务。
(原标题：孟山都首席技术官谈基因编辑、RNA干扰与行业并购影响)
本文来源：黔讯网
责任编辑："王晓易_NE0011"
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