怎样根据平均亲水指数判断蛋白的亲水性类型
点击联系发帖人
时间：2017-08-22 01:39
[发明专利]含LAS的水性、液体洗衣用洗涤剂组合物的亲水指数无效
申请/专利权人：
公开/公告号：CN1332786A
发明/设计人：;;;
公开/公告日：
主分类号：
搜索关键词：
【说明书】：
C.在环区域以外位置的取代-此外，可以在环区域以外的位置，例如在74位进行野生型枯草溶菌素309一或多个取代。如果只在74位对该枯草杆菌蛋白酶附加取代，则该取代物优选为Asn、Asp、Glu、Gly、His、Lys、Phe或Pro，更优选为His或Asp。但是，可以在74位取代同时在一或多个环区域进行改变，例如在残基97、99、101、102、105和121位。在WO95/29979、WO95/30010和WO95/30011中进一步描述了枯草溶菌素BPN变体和枯草杆菌蛋白酶309变体，所有这些文献都于日公开，本文引用它们作为参考。iv)脂酶适于洗涤剂应用的脂酶包括由微生物假单胞菌属产生的脂酶，如GB1,372,034中所述的司徒茨氏假单孢菌(Pseudomonas stutzeri)ATCC19.154。还参见日公开的日本专利申请53,20487中的脂酶。其它适宜的脂酶包括表现出与脂酶抗体发生阳性免疫交叉反应，由微生物荧光假单孢菌(Pseudomonas fluorescens)IAM 1057产生的脂酶。该脂酶购自Amano Pharmaceutical Co.Ltd.，Nagoya，Japan，商品名为脂酶P“Amano”，本文称之为“Amano-P”。进一步的适宜的脂酶如M1 LipaseR和LipomaxR(Gist-Brocades)。其它适宜的商业脂酶包括Amano-CES；来源于粘稠色杆菌(Chromobacterviscosum)，如粘稠杆菌脂解属变种(Chromobacter viscosum var.lipolyticum)NRRLB3673的脂酶，购自Toyo Jozo Co.，Tagata，日本；购自U.S.Biochemical Corp.，美国和Disoynth Co.，荷兰的粘稠色杆菌(Chromobacter viscosum)脂酶以及来源于糖菖蒲件克霍尔德氏菌(Pseudomonas gladioli)的脂酶；来源于疏绵毛状腐质霉(Humicola lanuginosa)并可以从Novo商购得到的LIPOLASE?酶，也是本发明的一种优选脂酶，还可参见EP341,947。在Novo的WO9414951A描述了对过氧化物酶稳定的脂酶变体，还可参见WO9205249和RD。高度优选的脂酶为美国申请序列号08/341,826中所述的来源于疏绵毛状腐质霉(Humicola lanuginosa)的天然脂酶的D96L脂肪分解酶变体(还可参见专利申请WO92/05249，即其中来自疏绵毛状腐质霉(Humicola lanuginosa)的天然脂酶第96位的天冬氨酸(D)残基变为亮氨酸(L)。根据命名法，这种96位的天冬氨酸被亮氨酸取代表示为D96L.)。优选应用疏绵毛状腐质霉(Humicola lanuginosa)菌株DSM4106。尽管已大量公开过脂酶，但到目前为止只有疏绵毛状腐质霉(Humicola lanuginosa)和米曲霉(Aspergillus oryzae)作为宿主产生的脂酶广泛用作织物洗涤产品的添加剂。如以上所指出的，它可以从Novo Nordisk获得，其商品名为LioposaseTM。为了最优化脂酶的去污性能，Novo Nordisk已制备了大量的变体。如WO92/05249中所述，该天然疏绵毛状腐质霉(Humicola lanuginosa)脂酶的D96L变体改善了猪油去污效力，高出野生型脂酶(被比较的酶量为每升0.075-2.5mg蛋白质)的4.4倍。日Novo Nordisk在《研究发现》(Research Disclosure)No.35944上公开了脂酶变体(D96L)可以以每升洗涤液相应0.001-100mg(5-500,000LU/升)脂酶变体之量加入。加入到本发明组合物中的脂酶的量为每升洗液50LU-8500LU。优选变体D96L存在量为每升洗液100LU-7500LU，更优选量为每升洗液150LU-5000LU。一般在该洗涤剂组合物中加入的脂酶和/或角质酶的水平为占该洗涤剂组合物重量0.0001％-2％活性酶，。适宜的酶还可以为角质酶[EC3.1.1.50]，它被认为是一种特殊类型的脂酶，即不要求界面活化的脂酶。WO-A-88/09367(Genencor)中已描述过在该洗涤剂组合物中加入角质酶。v)纤维素酶本发明的洗衣用洗涤剂组合物可进一步包括至少0.001％重量，优选至少约0.01％重量的纤维素酶。但是，要以有效量的纤维素酶用于本发明所述的洗衣用洗涤剂组合物。术语“有效量”指任何能够在底物，如织物、餐具等上产生清洗、去污斑、去污垢、增白、除臭、清新度改善等效果的酶量。本发明的组合物一般将包括约0.05％-约2％，优选约0.1％-约1.5％重量的商业酶制品。本发明的纤维素酶在商业酶制品中的含量为每克组合物足以提供0.005-0.1Anson单位(AU)活性。优选含酶组合物的最优化pH约为7-9.5。日授权的Barbesgaard等人的美国专利4,435,307公开了由Humicola insolens产生的纤维素酶。其它适宜的纤维素酶包括由腐殖霉属菌株(如Humicola insolens、Humicola griseavar.thermoidea)产生的酶，和由杆菌属或气单胞菌属产生的酶。其它有用的纤维素酶为从海软体动物Dolabella Auricula Solander的肝胰腺提取到的纤维素酶。适宜的纤维素酶还在以下文献中公开过：GB2,075,028A(Novo Industri A/S)、GB 2,095,275 A(KaoSoapCo.，Ltd.)、和Horikoshi等人的美国专利号3,844,890(Rikagaku Kenkyusho)。此外，日公布的Novo Nordisk A/S的PCT国际申请号WO91/17243中也描述了适宜的纤维素酶及其制备方法。现有技术中已知的纤维素酶可以根据以下商品名从供应商处获得：Celluzyme?、Endolase?和Carezyme?。为工业化制备本发明的产品，优选应用重组DNA技术。但是可以应用其它技术，包括调节所用微生物的发酵或突变来确保过量产生理想的酶活性物。这些方法和技术在现有技术中众所周知，并可以由本领域技术人员容易地实施。vi)其它酶可以将过氧化物酶与氧气源如过碳酸盐、过硼酸盐、过氧化氢等结合使用，以进行“溶液漂白”或防止洗涤期间从底物上洗脱的染料或色素转移到洗涤溶液中的其它底物上。已知的过氧化物酶包括辣根过氧化物酶、木质素酶和卤过氧化物酶如氯-或溴-过氧化物酶。日Novo的WOA和Novo的WO8909813A中描述了含有过氧化物酶的洗涤剂组合物。酶稳定体系在含有(但并不只含)酶的液体组合物中，本发明含有约0.001％-约10％，优选约0.005％-约8％，最优选约0.01％-约6％酶稳定体系，以该酶稳定体系的重量计。例如，该酶稳定体统可以包括钙离子、硼酸、丙二醇、链羧酸、硼酸及其混合物，并且可以根据该洗涤剂组合物的类型和物理形态来设计处理不同的稳定化问题。参见Severson的US4,537,706对硼酸盐稳定剂的评价。适宜的氯清除剂阴离子已为广泛所知，并且可容易地得到，如果使用，可以是含有铵离子与亚硫酸盐、酸式亚硫酸盐、硫代亚硫酸盐、硫代硫酸盐、碘化物等的盐。还可以使用抗氧剂，如氨基甲酸酯、抗坏血酸盐等，有机胺，如乙二胺四乙酸(EDTA)或其碱金属盐、单乙醇胺(MEA)及其混合物。如果需要，还可以使用其它常规的清除剂，如硫酸氢盐、硝酸盐、氯化物、过氧化氢源，如过硼酸钠四水合物、过硼酸钠一水合物和过碳酸钠、以及磷酸盐、缩合磷酸盐、乙酸盐、安息香酸盐、柠檬酸盐、甲酸盐、乳酸盐、苹果酸盐、酒石酸盐、水杨酸盐等，及其混合物。芳香剂本发明的组合物和方法中所用的芳香剂或芳香成分包括很宽范围的天然或合成化学成分，包括(但不限于)醛、酮、酯等。还包括含有橙油、柠檬油、玫瑰提取物、薰衣草、麝香、广藿香、香脂香精、檀香油、松油、杉木等成分复杂混合物的多种天然提取物和香精。成品芳香剂可以包括这些成分的极复杂的混合物。成品芳香剂一般重量含量约为本发明洗涤剂组合物的0.01％-约4％，而单独的芳香成分重量含量约为成品芳香剂组合物的0.0001％-约90％。物料护理剂
友情链接：交换友情链接需要网站权重大于2，网站收录10W以上，如符合条件，请联系QQ：。
行业网站：相关推荐：
400-周一至周五 9:00-18:00
服务热线：400-投诉建议：022-
扫一扫，微信关注高智网
高智&让创新无法想象2000万件&专利数据[发明专利]含有抗PCSK9抗体的稳定制剂在审
申请/专利权人：
公开/公告号：CNA
发明/设计人：;
公开/公告日：
主分类号：
分类号：;;;
搜索关键词：
【说明书】：
本领域中了解亲水氨基酸指数在对蛋白质赋予相互作用性生物功能方面的重要性。Kyte等，J.Mol.Biol.,157:105-131(1982)。已知某些氨基酸可被取代成具有类似亲水指数或分值的其它氨基酸且仍然保留类似的生物活性。在某些实施方案中，在基于亲水指数作出变化时，包括亲水指数在±2内的氨基酸的取代。在某些实施方案中，包括亲水指数在±1内的氨基酸的取代，并且在某些实施方案中，包括亲水指数在±0.5内的氨基酸的取代。本领域中还应了解，类似氨基酸的取代可基于亲水性有效地进行，尤其在由此产生的生物功能性蛋白质或肽旨在用于免疫学实施方案中时，如在本发明的情况下。在某些实施方案中，蛋白质的如受其邻近氨基酸的亲水性管控的最大局部平均亲水性与其免疫原性及抗原性相关，即与蛋白质的生物性质相关。以下亲水性值已指定给这些氨基酸残基：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；蛋氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)以及色氨酸(-3.4)。在基于类似亲水性值作出变化时，在某些实施方案中，包括亲水性值在±2内的氨基酸的取代，在某些实施方案中，包括亲水性值在±1内的氨基酸的取代，并且在某些实施方案中，包括亲水性值在±0.5内的氨基酸的取代。还可基于亲水性从一级氨基酸序列鉴定表位。这些区域又被称为“表位核心区”。示例性氨基酸取代列举于表1中。表1氨基酸取代术语“衍生物”是指包括除氨基酸(或核酸)的插入、缺失或取代以外的化学修饰的分子。在某些实施方案中，衍生物包含共价修饰，包括(但不限于)与聚合物、脂质或其它有机或无机部分进行化学键结。在某些实施方案中，化学修饰的抗原结合蛋白的循环半衰期可长于未化学修饰的抗原结合蛋白。在某些实施方案中，化学修饰的抗原结合蛋白对所要细胞、组织和/或器官的靶向能力可得以改进。在一些实施方案中，衍生的抗原结合蛋白被共价修饰成包括一个或多个水溶性聚合物连接物，包括(但不限于)聚乙二醇、聚氧乙二醇或聚丙二醇。参见例如以下美国专利号：4,640,835、4,496,689、4,301,144、4,670,417、4,791,192及4,179,337。在某些实施方案中，衍生的抗原结合蛋白包含一种或多种聚合物，包括(但不限于)单甲氧基-聚乙二醇、葡聚糖、纤维素或其它碳水化合物基聚合物、聚-(N-乙烯基吡咯烷酮)-聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯多元醇(例如甘油)及聚乙烯醇、以及所述聚合物的混合物。在某些实施方案中，衍生物被聚乙二醇(PEG)亚单位共价修饰。在某些实施方案中，在衍生物的一个或多个特定位置处，例如在氨基端处键结一个或多个水溶性聚合物。在某些实施方案中，一种或多种水溶性聚合物随机连接至衍生物的一个或多个侧链。在某些实施方案中，PEG用于改进抗原结合蛋白的治疗能力。在某些实施方案中，PEG用于改进人源化抗体的治疗能力。某些此类方法例如论述于美国专利号6,133,426中，其据此出于任何目的以引用的方式并入本文。肽类似物通常作为性质类似于模板肽的非肽药物用于药物产业中。这些类型的非肽化合物称为“肽模拟物(peptide mimetic)”或“肽仿真物(peptidomimetic)”。Fauchere,J.,Adv.Drug Res.,15:29(1986)；Veber和Freidinger,TINS，第392页(1985)；及Evans等，J.Med.Chem.,30:)，其出于任何目的以引用的方式并入本文。所述化合物常借助于计算机化分子建模来开发。在结构上类似于治疗上适用的肽的肽模拟物可用于产生类似的治疗或防治效应。一般来说，肽仿真物在结构上类似于范式多肽(即具有生物化学性质或药理学活性的多肽)，如人类抗体，但一个或多个肽键任选地通过本领域中熟知的方法由选自以下的键置换：--CH2NH--、--CH2S--、--CH2-CH2--、--CH＝CH-(顺式和反式)、--COCH2--、--CH(OH)CH2--及--CH2SO--。用相同类型的D-氨基酸系统性取代共有序列的一个或多个氨基酸(例如D-赖氨酸替代L-赖氨酸)可用于某些实施方案中以生成更稳定的肽。此外，可通过本领域中已知的方法(Rizo和Gierasch,Ann.Rev.Biochem.,61:387(1992)，出于任何目的以引用的方式并入本文中)产生包含共有序列或大致上相同的共有序列变化的限制性肽；例如通过添加能够形成使肽环化的分子内二硫桥键的内部半胱氨酸残基。如说明书通篇中关于生物物质(如多肽、核酸、宿主细胞及其类似物)使用的术语“天然存在的”是指物质可见于自然界中或为物质的可见于自然界中的某一形式。如本文所用的“抗原结合蛋白”(“ABP”)意指结合指定的目标抗原的任何蛋白质。在本申请中，指定的目标抗原为PCSK9蛋白或其片段。“抗原结合蛋白”包括(但不限于)抗体及其结合部分，如免疫功能性片段。肽体为抗原结合蛋白的另一实例。如本文所用的术语抗体或免疫球蛋白链(重链或轻链)抗原结合蛋白的“免疫功能性片段”(或简称为“片段”)为一种抗原结合蛋白，其包含抗体的缺乏至少一些存在于全长链中的氨基酸但仍然能够特异性结合抗原的部分(不考虑那个部分如何获得或合成)。所述片段具有生物活性，因为其结合目标抗原并且可与其它抗原结合蛋白(包括完整抗体)竞争结合给定的表位。在一些实施方案中，片段为中和性片段。在一些实施方案中，片段可阻断或降低LDLR与PCSK9之间相互作用的可能性。在一方面，所述片段将保留至少一个CDR存在于全长轻链或重链中，并且在一些实施方案中，将包含单一重链和/或轻链或其部分。这些生物活性片段可通过重组DNA技术产生，或可通过酶促或化学裂解抗原结合蛋白(包括完整抗体)而产生。免疫功能性免疫球蛋白片段包括(但不限于)Fab、双抗体(位于同一条多肽上的重链可变域与轻链可变域经由短肽接头连接，所述肽接头过短以致于不允许同一条链上的两个结构域之间的配对)、Fab'、F(ab')2、Fv、结构域抗体及单链抗体，且可源于任何哺乳动物来源，包括(但不限于)人类、小鼠、大鼠、骆驼科或兔。进一步预期本文公开的抗原结合蛋白的功能性部分(例如一个或多个CDR)可共价结合于第二蛋白质或小分子以生成针对体内具体目标、具有双功能治疗性质或具有延长的血清半衰期的治疗剂。如本领域技术人员应了解，抗原结合蛋白可包括非蛋白质组分。在本公开的一些章节中，本文利用“数字/字母/数字”(例如25A7)描述ABP的实例。在这些情况下，确切名称表示具体抗体。即，名为25A7的ABP不一定与名为25A7.1的抗体相同(除非其在说明书中明确教导为相同的，例如25A7和25A7.3)。如本领域技术人员应了解，在一些实施方案中，LDLR不为抗原结合蛋白。在一些实施方案中，LDLR的结合子区段(subsection)不为抗原结合蛋白，例如EGFa。在一些实施方案中，PCSK9进行体内信号传导所经由的其它分子不为抗原结合蛋白。所述实施方案将如此被明确鉴定。本文所述的某些抗原结合蛋白为抗体或源于抗体。在某些实施方案中，抗原结合蛋白的多肽结构是基于抗体，包括(但不限于)单克隆抗体、双特异性抗体、微型抗体、域抗体、合成抗体(在本文中有时称为“抗体模拟物”)、嵌合抗体、人源化抗体、人类抗体、抗体融合物(在本文中有时称为“抗体缀合物”)及其各自的片段。在一些实施方案中，ABP包含高亲和性多聚体(avimer)(紧密结合肽)或由所述高亲和性多聚体组成。本文进一步描述这些不同的抗原结合蛋白。“Fc”区包含两个重链片段，其包含抗体的CH1及CH2域。这两个重链片段由两个或更多个二硫键及由CH3域的疏水性相互作用固持在一起。“Fab片段”包含一条轻链以及一条重链的CH1和可变区。Fab分子的重链不能与另一重链分子形成二硫键。“Fab'片段”包含一条轻链以及一条重链的含有VH域和CH1域及CH1域与CH2域之间的区域的部分，由此可在两个Fab'片段的两条重链之间形成链间二硫键以形成F(ab')2分子。“F(ab')2片段”含有两条轻链以及含有CH1域与CH2域之间的一部分恒定区的两条重链，由此在两条重链之间形成链间二硫键。因此，F(ab')2片段由经两条重链之间的二硫键固持在一起的两个Fab'片段构成。
友情链接：交换友情链接需要网站权重大于2，网站收录10W以上，如符合条件，请联系QQ：。
行业网站：相关推荐：
400-周一至周五 9:00-18:00
服务热线：400-投诉建议：022-
扫一扫，微信关注高智网
高智&让创新无法想象2000万件&专利数据您所在位置： &
 &  & 
蛋白质分类问题的特征提取算法研究论文.pdf145页
本文档一共被下载：
次 ,您可免费全文在线阅读后下载本文档
文档加载中...广告还剩秒
需要金币：200 &&
优秀硕士毕业论文，完美PDF格式，可在线免费浏览全文和下载,支持复制编辑,可为大学生本专业本院系本科专科大专和研究生学士硕士相关类学生提供毕业论文范文范例指导,也可为要代写发表职称论文提供参考！！！
你可能关注的文档：
··········
··········
国防科学技术大学
博士学位论文
蛋白质分类问题的特征提取算法研究
姓名：张振慧
申请学位级别：博士
专业：应用数学
指导教师：王正华
座机电话号码
国防科学技术大学研究生院博士学位论文
人类基因组计划的实施带来了蛋白质数据库中海量的序列信息，而对蛋白质
高级结构和功能的认识却远远落后于序列信息。面对浩瀚的蛋白质序列数据，探
索理论与计算的方法研究蛋白质结构和功能具有重要意义，也是后基因组时代生
物信息学的核心问题之一。
由于蛋白质结构和功能的复杂性，人们很难抓住其整体特征用简单的方法对
所有蛋白质进行分类。而在蛋白质研究中存在许多专业分类方法，每一种分类准
则在一定领域内都有很重要的实用价值。因此蛋白质分类问题作为蛋白质组学研
究的一个分支，近年来受到研究者们越来越多的关注。蛋白质分类研究是全面掌
握蛋白质结构与功能的前提和基础，在分子生物学、细胞生物学、药理学和医学
中扮演着非常重要的角色。
蛋白质序列的特征提取是基于计算的蛋白质分类研究中最为基本的问题，也
是决定分类质量的关键问题。本文对此进行了深入的分析和研究，针对蛋白质分
类研究中的四类基本问题，提出和实现了四种不同的特征提取算法，并在标准数
据集上进行了测试验证和比较分析。本文的主要工作和创新之处概括如下：
1 蛋白质的结构型可以为蛋白质空间结构预测提供重要的信息。对于一个
结构未知的蛋
正在加载中，请稍后...以下试题来自：
判断题矿粉与沥青粘附性的试验方法采用亲水系数法。沥青混合料选用矿粉主要采用亲水系数大于1的碱性石灰岩矿粉。( ) 错
为您推荐的考试题库
你可能感兴趣的试题
1.判断题 错2.判断题 错3.判断题 对4.判断题 错5.判断题 对
热门相关试卷
最新相关试卷aopB基因,蛋白,同系物,片段和它们的变体,以及它们在细胞表面展示方面的应用的制作方法
专利名称aopB基因,蛋白,同系物,片段和它们的变体,以及它们在细胞表面展示方面的应用的制作方法
技术领域该项发明是关于根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的AopB外膜蛋白、它的变体、同系物、片段和相应的DNA分子，它们可用于细菌细胞表面的蛋白展示。
背景技术 分子展示技术已发展用于构建和筛选多肽与抗体展示库，并用于开发重组疫苗、吸附剂、重组生物催化剂，以及用于诊断和分析的固相试剂。分子展示技术的概念在于它提供了基因型(如抗体的可变区基因)和表型(如抗原结合)之间的物质连接，达到同时筛选编码欲求功能(如结合)蛋白的基因的目的。
噬菌体展示已经用于探明多肽-配体之间的相互作用和广泛的应用于高亲和蛋白的分离，包括抗体(Winter G，Milstein C.1991.Man-madeantibodies.Nature ；Vaughan T.J.，Williams A.J.，Pritchard K.，Osbourn J.K.，Pope A.R.，Earnshaw J.C.，McCafferty J.，Hodits R.A.，Wilton J.，Johnson K.S.1996.Human antibodies with sub-nanomolar affinities isolatedfrom a large non-immunized phage display library.Nat Biotechnol ).噬菌体库的筛选过程通常是用固定后的配体进行重复的噬菌体捕获和洗脱，然后将噬菌体在细菌中加以扩增。最近提出一种展示技术是应用核糖体使多肽和其编码RNA在体外加以连接(Hanes J.，Pluckthun A.1997.Invitro selection and evolution of functional proteins by using ribosome display.Proc Natl Acad Sci USA )。然而，在这两种方法中使用的噬菌体和核糖体都不能够自我复制，而且太小以致于不能够利用强有力的细胞分选技术例如荧光激活细胞分选术(FACS)的协助。
FACS可有助于高效大量筛选在细菌表面展示的蛋白或抗体库，因为其使用的体积相对大的细菌细胞能让该系统挑选可与荧光标记后的配体高亲和、高特异性结合的克隆(Daugherty PS，Olsen MJ，Iverson BL，Georgiou G.1999.Development of an optimized expression system for the screening ofantibody libraries displayed on the Escherichia coli surface.Protein Eng.12613-21；Steidler L；Viaene J；Fiers W；Remaut E.1996.Functional display of aheterologous protein on the surface of Lactococcus lactis by means of the cellwall anchor of Staphylococcus aureus protein A.Immunotechnology.297-102；Andreoni C，Goetsch L，Libon C，Samuelson P，Nguyen TN，Robert A，Uhlen M，Binz H，Stahl S.1997.Flow cytometric quantification of surface-displayedrecombinant receptors on staphylococci.Biotechniques.，704)。使用当前的高速细胞分选仪，1小时可以分选出108个细胞，其筛选量类似于通过噬菌体库筛选可获得的结果。因而，细胞表面展示结合FACS为蛋白工程提供了非常重要可供选择的展示技术。噬菌体展示方法是为灵敏的亲和筛选而设计，它依赖于单个分子的结合或者通过gpIII融合的单价展示。相对而言，细胞表面方法通常每个细胞可以获得104-105个拷贝。从而，在稳定性或表达水平方面的随机变异不会影响到细胞表面库的筛选。
细菌表面展示系统的发展起始于小的肽融合到一些外膜蛋白，例如OmpA，LamB，和PhoE后可以定位到大肠埃希氏菌(Escherichia coli)的细胞表面(Charbit A，Boulain J.C，Ryter A，Hofnung M.1986.Probing the topologyof a bacterial membrane protein by genetic insertion of a foreign epitopeexpression at the cell surface.EMBO J.53029-37；Freudl R，MacIntyre S，Degen M，Henning U.1986.Cell surface exposure of the outer membraneprotein OmpA of Escherichia coli K-12.J Mol Biol.；Agterberg M，Adriaanse H，Tommassen J.1987.Use of outer membrane protein PhoE as acarrier for the transport of a foreign antigenic determinant to the cell surface ofEscherichia coli K-12.Gene.59145-50)。在细菌细胞表面表达蛋白的最吸引人的应用之一就是可以用来开发活的细菌疫苗。在细菌细胞表面展示抗原被认为是有利的，因为暴露在表面的抗原更有利于免疫系统的识别，而且，外膜上的脂多糖可以增强免疫反应，还可能作为锚定在细胞表面多肽的辅助因子发挥作用(Lee J.S.，Shin K.S.，Pan J.G.，and Kim C.J.2000.Surface-displayed viral antigens on Salmonella carrier vaccine.Nat.Biotechnol.)。另外，细菌还有容易操作、制造和流通成本低的优点。这种方法产生新的重组疫苗目前已经有成功的报道(Kim EJ；Yoo SK.1999.Cellsurface display of hepatitis B virus surface antigen by using Pseudomonassyringae ice nucleation protein.Lett Appl Microbiol ；Lee J.S.，ShinK.S.，Pan J.G.，and Kim C.J.2000.Nat.Biotechnol.)。细菌表面展示系统另外的应用包括生产用于生物除污的全细胞吸附剂和新的生物催化剂(Kim YS；Jung HC；Pan JG.2000.Bacterial cell surface display of an enzymelibrary for selective screening of improved cellulase variants.Appl EnvironMicrobiol.；Jung HC；Lebeault JM；Pan JG.1998.Surface displayof Zymomonas mobilis levansucrase by using the ice-nucleation protein ofPseudomonas syringae.Nat Biotechnol.16576-80)。
普遍应用的Lpp-OmpA表面展示系统包括三部分信号序列和成熟的大肠埃希氏菌脂蛋白N端开始的9个氨基酸(Lpp)，大肠埃希氏菌外膜蛋白OmpA的46-159位氨基酸，和过客(passenger)蛋白(Francisco JA，Earhart CF，Georgiou G.1992.Transport and anchoring of beta-lactamase to the extemalsurface of Escherichia coli.Proc Natl Acad Sci U S A.7)。这个系统已经成功的用于展示β-内酰氨酶(Francisco JA，Earhart CF，Georgiou G.1992.Proc Natl Acad Sci U S A.7)，绿色荧光蛋白(Shi，Huidong；Su，Wei Wen.2001.Display of green fluorescent protein on Escherichia coli cellsurface.Enzyme and Microbial Technology.2825-34)，单链Fv(scFv)库(Daugherty PS；Chen G；Olsen MJ；Iverson BL，Georgiou G.1998.Antibodyaffinity maturation using bacterial surface display.Protein Eng.11825-32；Daugherty PS，Olsen MJ，Iverson BL，Georgiou G.1999.Development of anoptimized expression system for the screening of antibody libraries displayed onthe Escherichia coli surface.Protein Eng.12613-21)，和最近的HIV反转录酶(Bumett MS，Wang N，Hofmann M，Kitto GB.2001.Potential live vaccines forHIV.Vaccine.)。然而，这个系统仍然有其局限性(1)当Lpp-OmpA处于一个组成性表达的条件下，细胞的存活力非常低；因而必须使用一个严谨的调控系统和一个合适的低拷贝质粒来优化展示系统，尤其是对于大的过客蛋白(Daugherty PS，Olsen MJ，Iverson BL，Georgiou G.1999.Development of an optimized expression system for the screening of antibodylibraries displayed on the Escherichia coli surface.Protein Eng.12613-21；Earhart C.F.2000.Use of an Lpp-OmpA fusion vehicle for bacterial surfacedisplay.Methods Enzymol.)。(2)这个系统不能展示象细菌的碱性磷酸酶(PhoA)一样的二聚蛋白(Stathopoulos C，Georgiou G，Earhart CF.1996.Characterization of Escherichia coli expressing an Lpp′OmpA(46-159)-PhoAfusion protein localized in the outer membrane.Appl Microbiol Biotechnol.)。PhoA的功能需要二硫键的形成，其形成不能自发而是需要至少在二硫键形成中的催化作用(Bardwell JC，McGovern K，Beckwith J.1991.Identification of a protein required for disulfide bond formation in vivo.Cell ；Kamitani S，Akiyama Y，Ito K.1992.Identification andcharacterization of an Escherichia coli gene required for the formation ofcorrectly folded alkaline phosphatase，a periplasmic enzyme.EMBO J 1157-62).
很多活性蛋白和酶都是多亚基结构，并且很多都需要通过二硫键进行分子间和分子内的相互作用。二硫键的形成和在壁膜间隙的过客蛋白的折叠会阻碍这些蛋白的有效展示。因而，在培养基中加入还原剂有助于提高CtxB域和PhoA的转运效率(Klauser T，Pohlner J，Meyer TF.1990.Extracellular transport of cholera toxin B subunit using Neisseria IgA proteasebeta-domainconformation-dependent outer membrane translocation.EMBO J.；Stathopoulos et al.，1996；Suzuki T，Lett MC，Sasakawa C.1995.Extracellular transport
of VirG protein in Shigella.J Biol Chem.80)。然而，生长培养基中加入还原剂，还会打断分子间和分子内相互作用所需的二硫键。这会影响到一些酶或蛋白质的活性和/或展示，也可能还会改变细菌的生长和基因的表达，尤其是在大规模的应用中，还可能会提高操作的成本，细胞表面展示技术的相关参考文献包括美国专利5,348,867，美国专利5,516,637，美国专利5,866,344，美国专利6,274,345，美国专利6,300,065和美国专利6,190,662。
发明概要该项发明的一个方面是提供了包含编码以下任一种多肽的核酸序列的核酸分子(a)SEQ ID No2；(b)包含从SEQ ID No2的N端开始的至少39个连续氨基酸的片段；和(c)(a)或(b)的变体，其满足(i)与(a)或(b)相应的多肽的氨基酸序列至少65％相同；和(ii)当该变体在革兰氏阴性菌中制备时，它是一种外膜蛋白。
包含SEQ ID No2N端的至少39个连续氨基酸的片段可至少包括了SEQ ID No2的N端区域。该发明的实施方案包括了SEQ ID No2的N端区至少125，134，172，183，207个氨基酸的片段。
该项发明的另一个方面是提供了包含编码以下任一种多肽的核酸序列的核酸分子(a)SEQ ID No4；(b)包含从SEQ ID No4的N端开始的至少16个连续氨基酸的片段，和(c)a)或(b)的变体，其满足(i)与(a)或(b)相应的多肽的氨基酸序列至少65％相同；和(ii)当该变体满足如下条件时，它是一种外膜蛋白(1)在读框内与细菌的分泌信号和引导信号连接，(2)产生于革兰氏阴性菌。
包含SEQ ID No4的N端的至少16个连续氨基酸的片段可至少包括了SEQ ID No2的N端区域。该发明的实施方案包含了SEQ ID No2N端区的至少102，111，149，160，184个氨基酸的片段。
该项发明的另一个方面是其提供了一种编码一融合蛋白的核酸序列，上述的融合蛋白包括第一多肽和第二多肽，所述第一多肽由该项发明的核酸分子编码。在该发明的一个实施方案中，第二多肽被融合到第一多肽的C端。
该项发明的另一个方面是提供了一个包含SEQ ID No1中的6至309核苷酸的土壤杆菌属启动子。
本项发明的另一个方面是提供了一个分离出的5-100个核苷酸的探针或10-40个核苷酸的引物，其可与SEQ ID No1或3的核酸分子，或与该核酸分子的互补序列在严谨条件下杂交的。
该项发明的另一个方面是其提供了一个表达载体，其包括本项发明中的核酸分子，它与一个或多个表达调控序列可操作地连接。在该发明的一个实施方案中，表达调控序列含有aopB启动子；另一个实施方案中，载体是大肠杆菌中的表达载体，其表达调控序列适合于在大肠杆菌中表达核酸。另一个实施方案中，载体是土壤杆菌属中的表达载体，它适合在土壤杆菌属中表达核酸分子，尤其是在根癌土壤杆菌中。
该项发明的另一个方面提供了一个由本发明的核酸分子或表达载体转化了的重组微生物。在该发明的一个实施方案中，重组体微生物在其表面展示了本发明的多肽或融合蛋白。
该项发明的另一个方面是提供了包括以下任一种氨基酸序列的多肽，(a)SEQ ID No2；(b)包含从SEQ ID No2的N端开始的至少39个连续氨基酸的片段；和(c)(a)或(b)的变体，其满足(i)与(a)或(b)相应的多肽的氨基酸序列至少65％相同；和(ii)如果这个变体制备于革兰氏阴性细菌，那么它是一种外膜蛋白。
该项发明的另一个方面是提供了包括以下任一种氨基酸序列的多肽(a)SEQ ID No4；(b)包含从SEQ ID No4的N端开始的至少16个连续氨基酸的片段，和(c)a)或(b)的变体，其满足(i)与(a)或(b)相应的多肽的氨基酸序列至少65％相同；和(ii)当该变体满足如下条件时，它是一种外膜蛋白(1)与细菌的分泌信号和引导信号在读框内连接，并且(2)产生于革兰氏阴性菌。
该项发明的另一个方面是提供了生产本发明的多肽和融合蛋白的方法，该方法包括培养经表达载体转化了的微生物，所述表达载体含有编码本发明的多肽或融合蛋白的核酸分子，其中，该核酸分子与一个或多个表达调控序列可操作地连接。
本项发明的另一个方面是提供了能与本发明的多肽或融合蛋白中的载体蛋白特异性反应的抗体。在该发明的一个实施方案中，抗体为单克隆抗体。
本项发明的另一个方面提供了一个生产能够在其表面展示过客蛋白的微生物的方法，该方法包括以下步骤(1)将表达载体导入到微生物中；和(2)培养从步骤(1)中得到的微生物，以表达蛋白。
该展示方法中的表达载体包含(a)编码载体蛋白的核酸，载体蛋白可从本发明的多肽，特别是与AopB相关的蛋白以及AopB相关的外膜蛋白家族成员中选择；载体蛋白需要适合用于微生物的展示，并带有在微生物中有功能的细菌分泌信号。
(b)编码过客蛋白的核酸，该核酸要与编码载体蛋白的核酸在3′端框内连接。
(c)编码载体蛋白的核酸要与表达调控序列相连而起作用，该表达调控序列要适合在该微生物中表达编码该载体蛋白的核酸。
该发明的一个实施方案中，表达调控序列含有aopB启动子。在另一个实施方案中，在展示方法中所用的微生物在酸性条件下培养。
在另一实施方案中，载体蛋白和展示方法中所用的微生物是在以下的组中进行选择(a)载体蛋白是与AopB相关的多肽、片段或其变体，并且，可用于展示的微生物是土壤杆菌属，(b)载体蛋白包含RopB多肽序列N端的150-220个连续的氨基酸，并且可用于其展示的微生物是根瘤菌属(Rhizobium)，(c)载体蛋白包含布鲁氏菌属(Brucella)外膜蛋白序列N端的150-220个连续的氨基酸，并且可用于其展示的微生物是布鲁氏菌属。
(d)载体蛋白包含Pap31多肽序列N端的150-220个连续的氨基酸，并且可用于其展示的微生物是巴尔通氏体属(Bartonella)，(e)载体蛋白包含PomA多肽序列N端的150-220个连续的氨基酸，并且可用于其展示的微生物是巴斯德氏菌属(Pasteurella)(Mannheimia)，(f)载体蛋白包含PPE多肽序列N端的150-220个连续的氨基酸，并且可用于其展示的微生物是分枝杆菌属(Mycobacterium)，(g)载体蛋白包含主要外膜蛋白序列N端150-220个连续的氨基酸，可用于其展示的微生物是嗜血菌属(Haemophilus)，或(h)载体蛋白包含外膜孔多肽序列N端150-220个连续的氨基酸，可用于其展示的微生物是弧菌属(Vibrio)。
在该发明的优选实施方案中，分泌信号和载体蛋白一起发挥作用，展示了包含SEQ ID No2中1-23氨基酸的过客蛋白，在进一步的优选实施方案中，所述微生物为根癌土壤杆菌。
该发明的展示方法进一步包含检测所培养微生物表面是否带有过客蛋白和选择在表面带有过客蛋白的微生物。在一个实施方案中，该分析方法采用了荧光激活细胞分选术(FACS)。
本项发明的另一个方面提供了在土壤杆菌属表面表达融合蛋白的方法，具体步骤包括(1)将载体导入土壤杆菌属的细菌中；并且(2)培养由第一步得到的细菌，以表达融合蛋白；其所用载体包括(a)编码该发明的融合蛋白的核酸序列，其中的融合蛋白带有细菌的分泌信号；和(b)与编码融合蛋白的核酸可操作连接的表达调控序列，其中，该表达调控序列是适合在土壤杆菌属中表达所述编码融合蛋白的核酸。
本项发明的另一个方面是提供一个能够选择编码所需性质多肽的核酸的方法，该方法包含本发明的展示方法，其中的过客蛋白是多种的、已推断含有所需特性的多肽。这种方法进一步含有检测展示过客蛋白的微生物是否展示着过客蛋白的所需特性；选择和分离在其表面上展示着所需特性过客蛋白的微生物；以及从生物中分离表达载体的步骤。
在选择编码具有所需性质的多肽的核酸的方法的一个实施方案中，过客蛋白是来自于抗体表达库。欲求特性可以是与抗体特异的抗原的紧密结合、特异的抗原决定基的存在、或者是催化活性。
本发明的另一方面是提供一个从液体中去除污染物的方法，该方法包含该发明的展示方法，其中的过客蛋白能够与污染物结合，而且这种方法进一步包括用展示过客蛋白的微生物与含有污染物的液体在一定条件下接触一段时间，所述条件有利于过客蛋白与污染物结合；然后将微生物从液体中去除的步骤。在其中的一个实施方案中，污染物是重金属，而过客蛋白是金属硫蛋白。
本发明的另一方面是提供一个可激发哺乳动物免疫反应的方法，这种方法包括该发明的展示方法，其中的过客蛋白可以激发哺乳动物的免疫反应。这种方法进一步包含在有利于哺乳动物对过客蛋白产生免疫反应的时间和条件下给药展示着过客蛋白的微生物的步骤。在一个实施方案中，展示微生物是根癌土壤杆菌，它可用来当作活的疫苗。
本发明的另一个方面提供一个固相酶促反应的方法，这个方法包括该发明的展示方法，其中的过客蛋白可以用来催化反应，该方法进一步包括使欲催化的反应底物在有利于酶促反应的时间和条件下，与展示着过客蛋白的微生物接触一段时间的步骤。在一个实施方案中，所述过客蛋白是碱性磷酸酶。
本发明的另一个方面是提供一个提纯化合物的方法，该方法包含该发明的展示方法，其中的过客蛋白能够特异性地与该化合物结合，该方法进一步包括使含有该化合物的组合物与展示着过客蛋白的微生物接触，让接触时间和条件利于过客蛋白与化合物结合；在利于去除非特异性结合的污染物的条件下和时间内，洗所述微生物；以及在利于打断过客蛋白和化合物之间特异性结合的条件下和时间内，从所述微生物洗脱得到所要提纯的化合物。在一个实施方案中，所述化合物是抗体，所述过客蛋白是其特异性的抗原。
以下对附图的描述有利于更深入的理解这项发明。
图1指示的是aopB位点的序列和其相关的构建体。
A.1.4kb的NheI片段的DNA序列包含了aopB和所推导出的AopB氨基酸序列。垂直的箭头指示的是mini-Tn5转座子的插入位点。被下画线标记的氨基酸是推测的信号肽。粗体显示的是推测的核糖体结合部位SD序列(AGGAG)。水平箭头指示的重复序列，其功能可能是不依赖于ρ因的转录终止子。
B.不同构建体的遗传和物理图谱。垂直线上方的数字指示的是DNA序列的位置；圆括号中的数字指示的是在AopB中氨基酸的位置。套着方框的水平箭头指示的是aopB的开放读框；黑色区域指示的是推测的信号肽。◆指示的是mini-Tn5转座子的插入位点。垂直的箭头指示的是活性phoA-aopB融合体上TnphoA转座子的插入位点。带有垂直线的水平箭头指示的是引入了限制性位点的PCR引物。
图2示意的是aopB和ropB基因产物的氨基酸序列对比。这个对比是通过DNASIS程序完成的。阴影字母代表的是两个基因产物中相同的氨基酸。
图3示意的是aopB基因的Southern杂交分析。根癌土壤杆菌菌株全DNA的获得与实施例1中提到的方法一样，根癌土壤杆菌不同菌株的全DNA与泳道的对应分别是GMI9023(泳道1)，A136(泳道2)，A6(泳道3)，C58(泳道4)和CGI1(泳道5)，苜蓿中华根瘤菌(Rhizobium meliloti)RCR2011全DNA对应于泳道6。DNA用SphI消化，并用荧光素标记的aopB探针进行杂交。
图4指示的是AopB蛋白在根癌土壤杆菌中的亚细胞定位。诱导的根癌土壤杆菌菌株C58细胞(泳道1，3，5，7，9，11)和CGI1细胞(泳道2，4，6，8，10，12)按照实施例1中介绍的进行收集和分级分离为全细胞裂解物(CL)(泳道1和2)，周质(P)(泳道3和4)，胞质(C)(泳道5和6)，全膜(TM)(泳道7和8)，内膜(IM)(泳道9和10)和外膜(OM)(泳道11和12)级分。然后将来自同一制品的样品进行SDS/12％PAGE凝胶电泳分离，之后将蛋白转移到Immobilon-P膜上通过AopB抗体使其可见。
图5示意的是对细菌表面的AopB进行的检测。根癌土壤杆菌A6010菌株按照实施例1描述的培养。得到的细胞直接用于与以下不同抗体的相互作用兔多克隆AopB抗体，小鼠多克隆VirJ抗体或小鼠单克隆GFP抗体。全细胞的ELISA检测按照实施例1描述的进行，误差棒指示的是三次重复的标准差。
图6示意的是用全细胞ELISA检测AopB-GFP(A)和AopB-PhoA融合蛋白(B)在细胞表面展示的结果。按照实施例1中描述的方法对根癌土壤杆菌菌株C58(GFP-)，CG19(产生胞质GFP)，CGI1(染色体上含有aopB-gfp)，C58(pJYH21)(质粒上含有aopB-gfp)进行培养、固定；并且用全细胞ELISA检测AopB-GFP在细胞表面的展示(A)。质粒pJYH5039，pJYH5125，pJYH5134，pJYH5172和pJYH5207含有aopB-phoA融合体，其PhoA分别融合在AopB的39，125，134，172和207位氨基酸位点上。pJYH5包含野生型的aopB基因，而pJYH23含有由展示载体携带的phoA编码序列。这些质粒都被引入到C58菌株；含有这些质粒的C58细胞再被用来用PhoA抗体进行全细胞ELISA的方法检测AopB-PhoA的展示(B)。误差棒指示三次重复的标准差。
图7示意的是通过流式细胞仪分析评估AopB-PhoA在细胞表面展示的结果。含有pJYH5，pJYH5039，pJYH5125，pJYH5134，pJYH5172和pJYH5207的根癌土壤杆菌C58细胞按照实施例1中描述的在IB培养基上培养。小鼠抗-AP抗体按1∶1000加入，羊抗小鼠r-PE偶联物按照1∶100使用。总样本数为10,000。GMean代表几何平均值，几何平均值则是所记录细胞的平均荧光强度。
图8示意的是蛋白酶的可接近性(accessibility)分析的结果。包含pJYH5039，pJYH5125，pJYH5134，pJYH5172和pJYH5207的根癌土壤杆菌菌株C58，CGI1，和C58在IB培养基上培养。冲洗后，按照实施例1的方法在有和没有胰蛋白酶的情况下对细胞进行分别的处理。用抗-AopB抗体使AopB-GFP和AopB-PhoA融合蛋白可见，并且周质蛋白ChvE用抗-ChvE抗体使其可见。
图9示意的是展示载体pJYH20的物理图谱。这个质粒包含aopB启动子和编码AopB由1到172位氨基酸的aopB的1到516bp。多接头被引入到aopB的下游，以便于在aopB的开放读框内克隆和融合编码过客蛋白的外源基因。
图10示意的是AopB-PhoA在不同条件下表达情况的检测结果。根癌土壤杆菌菌株C58(pJYH23)，大肠埃希氏菌DH5α(pJYH23)和苜蓿中华根瘤菌RCR2011(pJYH23)在指定的培养基上培养。收集细菌细胞，并且通过抗-AP抗体使AopB172-PhoA可见。
图11示意的是生长培养基对细菌表面展示的影响。包含质粒pJYH5或pJYH23的根癌土壤杆菌菌株C58细胞置于MG/L培养基，在28℃过夜培养，然后在OD600＝0.3时可以转移到新鲜的AB或IB培养基，然后28℃培养18小时。展示效率通过全细胞ELISA确定。C58(pJYH5)作为阴性对照。实验重复三次。
图12示意的是流式细胞仪分析得到的AopB-PhoA展示结果。带有pJYH5或pJYH23的根癌土壤杆菌在MG/L，AB或IB培养基上培养。小鼠的抗-AP抗体按1∶1000加入，羊抗小鼠r-PE偶联物按1∶100使用。全样本为10,000，GMean代表几何平均值，几何平均值则是记录细胞的平均荧光强度。
发明详述A.AOPB基因和AOPB蛋白根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)染色体基因aopB已经被鉴定。这段基因与豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)中编码外膜蛋白的ropB基因有高度同源。通过转座子插入造成的aopB突变并不会影响细菌在不同培养基上的生长。
在pH 5.5的基本培养基上培养的CGI1突变细胞(包含aopB-gfp融合体)在紫外照射下显现强烈的荧光，而在中性的基本培养基上培养的细胞却没有荧光，这表明aopB基因可被酸性环境诱导。aopB编码一条长218个氨基酸的推测蛋白，其预计分子重量为22.8 kDa。TnphoA转座子插入突变，亚细胞分级分离和全细胞ELISA实验均表明AopB是一个暴露在细菌细胞表面的外膜蛋白，并且非常严谨，不会在其他部位出现。
以下是所举序列的描述SEQ ID No1包含aopB基因的核苷酸序列SEQ ID No2AopB的全长氨基酸序列SEQ ID No3编码AopB的aopB核苷酸序列，但缺少推定的信号序列SEQ ID No4 AopB的氨基酸序列，但缺少推定的信号肽序列SEQ ID No5引物p54SEQ ID No6引物p55SEQ ID No7引物p119SEQ ID No8引物p112SEQ ID No9引物p118SEQ ID No10GFPuvFh3SEQ ID No11GFPuvRp1SEQ ID No12PhoAfH3SEQ ID No13PhoAreP1AopB已经被确定为革兰氏阴性菌膜蛋白家族(此后称为AopB相关膜蛋白)中的一员。这个蛋白族中包括RopB(60％氨基酸序列相似性)，布鲁氏菌膜外的免疫原性蛋白(42-47％氨基酸序列相似性)，汉氏巴尔通氏体(Bartonella hensela)经噬菌体侵染产生的Pap31(46％氨基酸序列相似性)，溶血巴斯德氏菌(Pasteurella(Mannheimia)haemolytica)外膜蛋白PomA(47％氨基酸序列相似性)，结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的PPE(39％氨基酸序列相似性)，杜氏嗜血菌(Haemophilus ducreyi)的主要外膜蛋白(43％氨基酸序列相似性)，和霍乱弧菌(Vibrio cholerae)的外膜孔蛋白(40％氨基酸序列相似性)，还有假单胞菌(Pseudomonas)的孔蛋白F(OprF)的C端部分。
转录和翻译的调控序列可以是DNA的调控序列，如启动子、增强子、多腺苷酸信号、终止子、和可以为编码序列在寄主细胞提供表达的序列。
“启动子序列”是DNA分子上的一段调控序列，能够和细胞中的RNA聚合酶结合沿下游(3′方向)启动转录编码序列。为了阐明该发明，启动子序列可以在转录起始位点的3′端结合，并向上游(5′方向)延伸使其包括能够起始转录的最少的碱基或者元件数目。在启动子序列内有一个转录起始位点(通常通过核酸酶S1作图而确定的)，还有可以用于结合RNA聚合酶的蛋白结合区域(共有序列)。原核生物启动子除了含有-10和-35共有序列外还包括SD序列。
表达调控序列是一段操纵和控制另一段DNA序列的转录和翻译的DNA序列。编码序列则“受控于”转录和翻译调控序列，它在细胞内可被RNA聚合酶转录成mRNA，然后mRNA被翻译成蛋白质。
“分离的多核苷酸”被定义为是从其发生的环境中被去除而得的多核苷酸。分离的多核苷酸是结构上不同于自然产生的多核苷酸。这个词因此包括例如(a)一段DNA，其序列包括自然产生的基因组分子的部分序列，但是不包含该序列两侧的编码序列；(b)一段被整合到载体或原核或真核基因组中的多核苷酸，但所产生的分子与所有自然条件下发生的载体或基因组DNA分子都不一样；(c)一个分离的分子，例如cDNA，基因组片段，PCR产物片段或限制性酶切的片段；和(d)杂合基因的一部分的重组核苷酸序列，也就是编码融合蛋白的基因。特别指出要排除在这个定义之外的是处于在含有以下的混合物中的多核苷酸(i)DNA分子、(ii)被转染的细胞、和(iii)细胞克隆，例如是出现在DNA文库，如cDNA或基因组DNA文库中的那些细胞克隆。
例如，一个DNA分子天然存在于细菌基因组或作为基因文库的一部分时并不是分离而得的，但是如果该分子分离于细菌基因组中剩下的部分是由于比如说发生了克隆事件(扩增)而得，那么它就是分离的分子了。通常，分离的DNA分子不受DNA区域(例如，编码区域)的限制，在自然发生的基因组中，它会紧邻5′或3′端。这样的分离的多核苷酸可以是载体或组合物或外源基因组的一部分，但仍然可以定义为分离的分子，因为它们并不是在自然情况下的一部分。
本项发明的多核苷酸可以是RNA或DNA(cDNA，基因组DNA，或合成的DNA)，或其修饰物，变体、同系物或片段。其DNA可以是单链或双链，并且，如果是单链可以是编码链，也可以是非编码链(反义链)。任何一个象SEQ ID NO1或3所编码的本发明的多肽序列可以是(a)编码序列，(b)由(a)所转录的核糖核苷酸序列，或(c)用冗余或简并的遗传密码子编码相同多肽的编码序列。
多肽或蛋白指的是不管长度或翻译后是否修饰(例如，糖基化或磷酸化)的任一氨基酸链，两个词在本申请中可以互换。
氨基酸序列可来源于SEQ ID NO2或4的同源的序列。象这里所用的“同源的氨基酸序列”是指在低于严格的熔解温度(Tm)25-35℃下，其编码序列可与SEQ ID NO1或3的任一部分核苷酸序列进行杂交。其中同源的氨基酸序列是指与SEQ ID NO2或4中的氨基酸序列不同的氨基酸序列有一个或多个氨基酸的取代，优选是保守取代。这样的序列也包含血清型变体(定义见下文)以及包含了缺失或插入，但仍保留所述多肽的原有遗传特性如免疫活性的序列。优选，这样的序列要与SEQ ID NO2或4至少61％相同(例如，65％，68％，70％，73％，75％，78％相同)，优选至少80％相同(例如，82％，85％，88％，90％，93％，95％，98％相同)。
同源的氨基酸序列包括与SEQ ID NO2或4序列相同或者实质相同的序列。所谓“实质相同的氨基酸序列”是指至少有90％(例如92％，94％，95％，96％，97％，98％)并优选有99％与参考序列相同的氨基酸序列。在一个实施方案中，同源序列可不同于参考序列，但这些变化多数是保守的氨基酸取代。
保守氨基酸的取代就是发生在同一类氨基酸中的取代。这些氨基酸类别包括，例如，极性不带电荷的氨基酸，如天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸；碱性氨基酸如赖氨酸、精氨酸和组氨酸；酸性氨基酸如天冬氨酸和谷氨酸；和非极性氨基酸如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸和半胱氨酸。
同源多聚核苷酸的定义与此类似。优选同源序列是与SEQ ID No1或3的编码序列至少有45％(例如50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，87％，90％，93％，96％)和优选有99％相同的序列。
同源性通常由如Sequence Analysis Software Package of the GeneticsComputer Group的序列分析软件(University of Wisconsin BiotechnologyCenter，1710 University Avenue，Madison，WI 53705)来测定。氨基酸序列按最大一致性排列。间隙可以人为地在序列中加以引入以达到合适的排列。一旦最佳的排列建立后，就可以通过比较两个序列在各个位置的氨基酸相对于所有位点的同一性来确定其同源性的水平。
这里所用的两个氨基酸或核苷酸序列间的“百分比同源性”、“百分比同一性”或“百分比相似性”都是通过按照最高匹配原则排列而确定的。“同一性”或“相似性”实质上是通过巧妙的衡量方式并且可以通过现有的技术计算出来。这里用来比对两个氨基酸或核苷酸序列同一性或相似性的计算机软件是DNAStar(DNAStar Inc.，Madison，Wis.)。然而，其他的一些软件如GCG程序包(Devereux，J.，et al.，Nucleic Acids Research()387)和BLASTP，BLASTN，FASTA(Atschul，S.F.et al.，J MolecBiol()也可以用。这里确定的同源性(同一性或相似性)则是按照大家都知道的BESTFIT程序(Wisconsin Sequence Analysis Package，Version 8 for Unix，Genetics Computer Group.University Research Park，575Science Drive，Madison，Wis.53711)而确定的。当使用BESTFIT或其他的序列排列软件来确定某一特定序列是否有例如与参考序列间大约90％的同源性时，根据当前的发明，参数应该设定保证同一性百分数是在参考核苷酸序列或氨基酸序列的全长的基础上计算的，而且允许同源区中的间隙可达到约参考序列总核苷酸数的10％。
两个多肽的百分相似性也可以通过使用包括BESTFIT在内的本领域已知的软件比对两个多肽链的氨基酸序列进行评测，通过使用鉴定相似性的默认参数设置。
Karlin和Altschul的运算法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8，1990)，经由Karlin和Altschul修饰后(Proc.Natl.Acad.Sci.USA7，1993)，已被吸收到Altschul等的NBLAST和XBLAST中(J.Mol.Biol.，1990)，而用于搜索与参考序列同源的序列。
BLAST核苷酸序列搜索使用的是NBLAST程序，score＝100，wordlength＝12，以得到与本发明同源的序列。BLAST蛋白搜索使用的是XBLAST程序，score＝50，wordlength＝3，以得到与参考多肽(例如SEQ IDNO2或4)有同源性的氨基酸序列。要得到用于比对的带有间隙的排列，需要按照Altschul等(Nucleic Acids Res.，1997)介绍的GappedBLAST进行。当使用BLAST和Gapped BLAST程序时，使用了各自程序(例如XBLAST和NBLAST)的默认参数设置。参考http//www.ncbi.nlm.nih.gov。
与SEQ ID NO2或4同源的多肽链包括自然发生的等位基因变体，以及保留了参考多肽遗传特性的突变体或非自然发生的变体。对AopB而言，这样的遗传特性包括了其作为革兰氏阴性菌暴露在表面的外膜蛋白的拓扑结构。
正如我们所知道的，等位基因的变体是一种多肽的替换形式，其特征可以是因为发生了取代、缺失、或者一或几个氨基酸的添加，但却并不改变多肽的生物学功能。生物学功能是指多肽在自然状态下的细胞中所发挥的作用，即使这个功能对细胞的生长和存活并不必要。例如，孔蛋白的生物学功能就是允许胞外介质中存在的化合物进入细胞内。
等位基因的变体在自然界非常普遍。例如，一个细菌种如M.catarrhalis，通常由多种不同的菌株来代表，它们之间有着微小的等位基因的变异。事实上，一个在不同菌株间行使相同生物学功能的多肽在每一菌株中可以有不同的氨基酸序列(和核苷酸序列)，这种等位基因的变异在多核苷酸水平也得到了很好的体现。
一个获得编码同源多肽或等位基因变体的多聚核苷酸的方法是通过聚合酶链式反应(PCR)扩增由常规的方法提取的细菌基因组DNA。这涉及到与编码序列5′和3′端的上、下游配对的合成的寡核苷酸引物的使用。适宜的引物是通过SEQ ID NO1或3提供的核苷酸序列信息设计的。步骤如下选择包含10到40个核苷酸(如13，16，19，22，24等等)，更优选包含15-25个核苷酸的引物。选择含有足以保证有效杂交的C G比例的引物是有利的；也就是说，C和G的量至少占总核苷酸含量的40％，优选占50％。一个标准的PCR反应通常每100μL包含0.5到5个单位的Taq DNA聚合酶，20到200μM的每种脱氧核苷酸，优选每种核苷酸具有相同的浓度，超过总脱氧核苷酸浓度0.5到2.5mM的镁，105到106靶标分子，和大约20pmol的每种引物。进行大约25到50个PCR循环，低于引物实际Tm 15℃到5℃的退火温度。更加严谨的退火温度将有助于消除不正确的退火引物和减少不正确的核苷酸结合到引物的3′端。尽管更高的温度适合于对G+C丰富的靶标变性，通常变性温度是95℃到97℃。循环的数量依赖于初始加入的靶标分子的浓度，尽管超过40个循环不加推荐，这是由于循环次数过多会造成非特异性背景产物的增加。
另一个可用来得到编码同源多肽或等位基因变体的多核苷酸的方法是通过分子杂交的方法筛选DNA或RNA文库。杂交的步骤广为人知并被详细描述如Sambrook等(Sambrook，J.E.F.et.al.(1989)Molecular Cloning aLaboratory Manual 2nded.Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor N.Y)。优化杂交条件的重要参数可通过用于获得临界(critical)熔解温度的公式反映，大于该熔解湿度时，两条互补的DNA链可互相分开。对于大于或约等于600个核苷酸的多核苷酸，公式是Tm＝81.5+0.41×(％G+C)+16.6log(阳离子浓度)-0.63×(％甲酰胺)-600/碱基数。在适当的严谨条件下，杂交温度(Th)大约是低于计算的Tm的20到40℃，20到25℃，或优选30到40℃。在这方面本领域技术人员可容易地确定出最佳的温度和盐浓度。
这里所提出的杂交核酸可以用来例如作为克隆探针、引物或者是诊断探针。分子杂交通常是要在严谨的条件下进行。核酸双链体或杂交体的稳定性由熔解温度或Tm值来表达，即杂交链分开的温度。这个熔解温度用来确定杂交所需的严谨条件。如果要鉴定的序列与探针序列有相关性并且基本一致而并非完全一致时，那么先确定最低的杂交温度是非常有用的，这样在特定的盐(例如SSC OR SSPE)浓度环境中，在该确定的最低温度时只有同源序列杂交。然后，假设每有1％的错配就会导致Tm值下降1℃，杂交反应最后冲洗的温度也相应降低(例如，如果序列与探针有超过95％的一致性，最后的冲洗温度就降低5％)。实际上，每1％的错配所带来的Tm的变幅可以介于0.5℃和1.5℃之间。严谨的杂交条件可以通过预杂交和杂交孵育来获得(i)在含有50％甲酰胺的6×SSC中在42℃杂交4-16小时，或(ii)在6×SSC(1M NaCl，0.1M枸椽酸钠(pH 7.0))水溶液中在65℃杂交4-16h小时。通常，杂交实验要在60℃-68℃温度下进行，例如65℃。在这种温度条件下，可以在6×SSC，更好的是2×SSC或1×SSC，最好是在0.5×SSC，0.3×SSC或0.1×SSC(不含甲酰胺)中获得严谨的杂交条件。1×SSC包含0.15M NaCl和0.015M枸椽酸钠。
有用的同系物和其中的非自然片段由已知的方法来设计，它们可用来鉴定抗原上可容许氨基酸序列变化和(或)缺失的区域。比如，比较来自不同种的同源多肽就可以鉴定出保守序列。越是差异多的序列就越能容许序列的变化。序列间的同源性可以通过上述的方法进行分析，比如Altschul等的BLAST同源搜索运算法则(Nucleic Acids Res.；2(1997))。另外，序列可以在体外修饰，然后按照下文介绍的方法筛选能展示过客蛋白的序列。
本领域技术人员将很容易了解到采用这项发明中的筛选步骤并不需要做不必要的实验就可确定SEQ ID NO2或4的特定同系物或片段是否保持了AopB外膜蛋白的拓扑结构，并且，是否可做为载体蛋白展示过客蛋白。一般的分析过程包括以下步骤(i)将实验同系物或片段在读框内连接上一个报告蛋白(过客蛋白)如GFP。通常，编码过客蛋白和编码实验同系物或片段的核酸分子在读框内连接后就可产生融合蛋白。编码这个融合蛋白的核酸分子于是被插入到一个表达载体上，然后在细菌中通过步骤(ii)表达这个融合蛋白；(ii)用编码该融合蛋白的核酸分子转化革兰氏阴性菌，优选根癌土壤杆菌；并且(iii)使用适合的全细胞分析手段如FACS来分析报告蛋白在转化细菌中的活性。在细胞表面的报告蛋白的活性将显示所述同系物或片段是外膜蛋白，而且可作为一个用于展示的载体蛋白。
由此衍生的多肽包括SEQ ID NO2或4的部分序列，与SEQ ID NO2或4有同源性的多肽序列的部分序列，由全长多肽内部缺失而得的多肽和融合蛋白。
在一个实施方案中，AopB的片段来自SEQ ID No2的N-端区域。另一些实施方案中，来自SEQ ID No2的N-端的至少39个连续氨基酸的AopB片段是优选的，例如来自SEQ ID No2的N-端的125，134，172，183和207个连续氨基酸。将过客蛋白与SEQ ID No2的125，134，172，183和207个氨基酸的片段融合已得以例证，而且显示了其用于细胞表面展示的有效性。
尤其优选的是SEQ ID No.2 N-端的134到183个连续氨基酸片段，例如140，150，155，160，165，166，168，170，172，174，176，178，180个氨基酸的片段。
载体蛋白与过客蛋白的融合可让载体片段与过客蛋白氨基酸序列直接邻近而形成。另外还可以通过连接子序列连接载体片段和过客蛋白，如来自免疫球蛋白的灵活的连接子序列(参见美国专利5,516,637)。连接子可以含有蛋白酶特异的切割位点，以便于将过客蛋白从载体蛋白上可控制地释放下来。这样的蛋白酶切位点的例子包括对凝血因子Xa、肠激酶、胶原酶、Igase(来自淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae))、凝血酶和TEV(烟草蚀纹病毒)蛋白酶的切割特异的位点。
来自SEQ ID NO1或3的30到600个核苷酸的多聚核苷酸或其互补体、同系物、变体至少可以用来作为得到其他同系物或变体的探针。得到部分序列的一个方法是通过PCR扩增，扩增应用的参数上文提到，应用的引物与要扩增的片段的5′和3′端上游和下游序列配对。其扩增的模板可以是SEQ ID NO1或3的全长或它们相关的同系物或变体，或包含在多聚核苷酸混合物如DNA或RNA文库中的特定多聚核苷酸。另一种得到部分序列的方法是在如上文介绍的条件下，使用推算Tm的公式进行筛选杂交。30到600个核苷酸片段的获得，其Tm值要通过减法(600/多核苷酸碱基对数目)进行校正，并且严谨的杂交条件其杂交温度要低于Tm 5到10℃。要获得低于20-30个碱基寡核苷酸时，Tm的计算公式为Tm＝4×(G+C)+2(A+T)。例如，50％G+C的18个核苷酸的片段Tm约为54℃。
SEQ ID NO2或4中短的氨基酸片段或它们相应的同源序列，可以通过化学合成的办法得到(E.Gross and H.J.Meinhofer，4 The PeptidesAnalysis，Synthesis，Biology；Modern Techniques of Peptide Synthesis，John Wiley &Sons(1981)，and M.Bodanzki，Principles of Peptide Synthesis，Springer-Verlag(1984))。
编码含有较大内部缺失的多肽片段的多核苷酸可以按照标准的方法构建(Sambrook，J.E.F.et.al.(1989)Molecular Cloning a Laboratory Manual 2nded.Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor N.Y.)。这个方法包括标准的PCR、反向PCR、和对DNA克隆分子的限制性内切酶处理。这些方法中所用的成分和使用的仪器可以从很多公司购买如Stratagene。
某些氨基酸可以取代蛋白上其他的氨基酸而不改变蛋白的活性区域比如结合位点。既然活性区域决定一个蛋白的生物学功能，那么就可以通过某些氨基酸的取代来获得相似生物学功能的蛋白。所以可以预期，可以改变AopB的多肽序列或其编码的DNA序列而不改变其生物学功能和活性。
在进行这种改变的时候，通常要考虑到氨基酸的亲水指数(hydropathicindex)。氨基酸的亲水指数对蛋白的生物学功能有非常重要的意义，这一点本领域已有共识(Kyte，J.，and Doolittle，R.F.(1982)Simple method fordisplaying the hydropathy character of a protein.J Mol Biol )。相关的亲水氨基酸构成蛋白的二级结构，因而决定了蛋白与其他分子的相互作用，例如与酶、底物、受体、DNA、抗体、抗原等等的相互作用。膜的拓扑结构可以通过Sipos和von Heijne(Sipos et al.，1993，Eur.J.Biochem0)描述的算法进行预测。
根据其亲水性和所带电荷对每一种氨基酸都进行了亲水指数的赋值(kyte和Dodittle，1982)。分别是异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5).
已经知道某些氨基酸可以被另外的具有与其相似亲水指数的氨基酸取代而不改变蛋白的生物学活性，也就是说，得到功能相同的蛋白。要进行这种改变，取代氨基酸的亲水指数应该在被取代氨基酸亲水指数的.+-.2范围内，当然如果能控制在.+-.1甚至.+-.0.5就更好了。
同时可以根据美国专利4,554,101提供的氨基酸的亲水性更有效的进行氨基酸的取代，其指出了与蛋白生物特性相关的由相邻氨基酸的亲水性决定的蛋白的局部最大平均亲水性。
根据美国专利4,554,101的详细介绍，指定的氨基酸亲水值分别是精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0.+-.1)；谷氨酸(+3.0.+-.1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5.+-.1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。
已经知道一个氨基酸可以被另外一个与之有相似亲水值的氨基酸取代，从而得到保持原有生物学特性，并且尤其是免疫学特性的蛋白。要做这样的改变，取代氨基酸的亲水值应该在被取代氨基酸亲水值的.+-.2范围内，当然如果能控制在.+-.1甚至.+-.0.5就更好了。
正如上文所述，氨基酸的取代通常要考虑到相关相似性的侧链取代，比如其疏水性、亲水性、电荷、大小等等，本领域技术人员一定知道考虑了前述各种情况的取代的实例包括精氨酸和赖氨酸；天冬氨酸和谷氨酸，丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸的取代。
如这里所使用的，融合蛋白是包含本发明中多肽或由本发明中多肽得到的多肽与任何其他多肽(这里后面称为过客蛋白或多肽)在N或C端的融合。得到这种融合多肽的一个最简单的方法是翻译读框内连接的多聚核苷酸，即杂合基因。编码融合蛋白的杂合基因被插入到一个表达载体上，用于转化或转染寄主细胞。另外，编码多肽或多肽衍生物的多核苷酸序列也可以插入到其中已存在编码过客蛋白多肽的多核苷酸的表达载体中。大的蛋白可以有效的用于表面表达，所述蛋白包括β-内酰胺酶，碱性磷酸酶，纤维素酶的纤维素结合域，或者单链Fv抗体。
融合蛋白的有利事例如其一可以将本发明的多肽或同系物或片段(‘载体蛋白′)融合到一个具有酶活性的蛋白上，如碱性磷酸酶，或一个可以进行二级修饰的酶上(例如糖基化酶或二硫化物异构酶)。另外还可以将载体蛋白融合到一个可以结合化合物的过客多肽上，所述化合物如污染物(例如溶液中的重金属或血液中的滤过型污染物)或者其他的蛋白(例如抗体)。如果过客蛋白本身就是一个抗体，那么融合蛋白可以用来纯化该抗体特异的抗原，或用来去除溶液中某种特定抗原。如果过客蛋白是一个抗原蛋白，融合蛋白可以用来作为一个疫苗来激发免疫反应来抵抗这个抗原。
为了有效的融合，过客多肽可以融合到本发明多肽的N-或者更好是C端。优选的氨基酸插入位点是SEQ ID No2第39，125，134，172，183和207位的氨基酸，最好是插入到172位氨基酸上游或下游10个氨基酸的位置。
本发明中的多聚核苷酸同时也可以编码杂合的多肽前体(precursorpolypeptides)，其包括来自异源的信号肽，成熟以后成为本发明中的多肽。“异源的信号肽”是指在自然发生的本发明的多肽前体中没有的信号肽。优选的异源信号肽是那些或来自于或衍生自革兰氏阴性菌的信号肽。在优选实施方案中，异源信号肽与载体蛋白成熟序列的N端相连。
革兰氏阴性菌拥有非常独特和复杂的细胞包被结构，其包括细胞的内细胞膜、周质和外细胞膜。要在利用本发明中的载体蛋白在细胞表面展示过客蛋白，表达的融合蛋白必须能够穿过内细胞膜和外细胞膜运输到细菌表面并保留在细菌表面。
为了使融合蛋白能够被定位在细胞的表面，载体蛋白必须含有有效的分泌信号序列以助载体蛋白穿过细胞内膜和用于将融合蛋白锚定在细胞表面的靶标序列。信号序列和靶标序列可以在自然发生的载体蛋白前体中获得，或者他们可以是异源序列，也就是说，可以从同一个细菌蛋白或相同或不同细菌的不同蛋白获得。
在革兰氏阴性菌中，细胞外膜是一个限制蛋白向外运输的障碍。通常只有菌毛蛋白、鞭毛蛋白、特异性的酶和少数毒素可以完全穿过外膜到达胞外。这些蛋白的大多数都是首先通过一般的分泌方式分泌到壁膜间隙，然后在一些其他的基因产物的辅助下穿过外膜。
对于一些外膜蛋白，如PhoE孔蛋白，对适当定位和聚集必要的信息分布在引物序列里。或者，靶标序列可能包含在一段短的连续片段内。例如，大肠埃希氏菌脂蛋白N端的头9个氨基酸对于其定位在外膜是必要的。将这段短序列与可溶性周质蛋白β-内酰胺酶融合将会使融合蛋白定位到胞外。同样，对OmpA进行研究发现154位和180位之间的氨基酸残基对于定位是关键的。对于OmpA，靶标定位和外膜聚合则显示截然不同的事件。
在一个实施方案中，一个杂合的多肽前体包含SEQ ID No4和与之N端连接的，决定向外膜分泌的氨基酸序列。膜靶向序列已经在很多种膜蛋白中得到鉴定，其中包括Lpp。通常对于Lpp，其作为定位信号的蛋白域是相当短的。Lpp靶向序列包含信号序列和成熟蛋白的前面9个氨基酸。这些氨基酸在Lpp N端发现。其它的可以作为分泌和膜定位信号源的蛋白包括大肠埃希氏菌外膜脂蛋白如TraT，OsmB，NlpB，BlaZ；铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)脂蛋白1；流感嗜血菌(Haemophilus influenza)PA1和PCN蛋白；立氏立克次氏体(Rickettsia rickettsii)17kDa脂蛋白；淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhea)H.8蛋白等等。
本发明的一个方面包含(i)一个表达盒包含本发明的多聚核苷酸，其表达受控于所需的调控元件，尤其是适合的启动子；(ii)一个表达载体包含本发明的表达盒；(iii)经本发明表达盒和/或载体转化或转染了的原核或真核细胞；还有(iv)一个由编码本发明的多肽或多肽衍生物的核苷酸序列产生多肽的方法，其包括在利于本发明DNA分子表达的条件下培养经本发明表达盒和/或载体转化或转染了的原核或真核细胞，然后从培养物中回收所编码的多肽或多肽衍生物。
豌豆根瘤菌细胞可以通过Garg B，Dogta RC，Sharma PK.1999介绍的方法进行转化。High-efficiency transformation of Rhizobium leguminosarum byelectroporation.Applied and Environmental Microbiology 4；和Giddings G，Mytton L，Taylor L，Thomas S，Allen D，Skot L.2000.A secondaryeffect of transformation in Rhizobium leguminosarum transgenic for Bacillusthuringiensis Subspecies tenebrionis delta-endotoxin(cryIIIA)genes.Theoreticaland Applied Genetics 。
苜蓿中华根瘤菌细胞可以通过Hayashi M，Maeda Y，Hashimoto Y，Murooka Y.2000介绍的方法进行转化。Efficient transformation ofMesorhizobium huakuii subsp rengei and Rhizobium species.Journal ofBioscience and Bioengineering 。
Mesorhizobium loti细胞可以通过Hayashi M，Maeda Y，Hashimoto Y，Murooka Y.2000介绍的方法进行转化。Journal of Bioscience andBioengineering 。
大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)细胞可以通过HattermannDR，Stacey G.1990描述的方法进行转化。Efficient DNA transformation ofBradyrhizobium japonicum by electroporation.Applied and EnvironmentalMicrobiology ；和Hayashi M，Maeda Y，Hashimoto Y，Murooka Y.2000.Journal of Bioscience and Bioengineering 。
马尔他布鲁氏菌(B.melitensis)细胞可以通过Ekaza E，Guilloteau L，Teyssier J，Liautard JP，Kohler S.2000描述的方法进行转化。Functionalanalysis of the ClpATPase ClpA of Brucella suis，and persistence of a knockoutmutant in BALB/c mice.Microbiology 6；和Jubier-Maurin V，Boigegrain RA，Cloeckaert A，Gross A，Alvarez-Martinez MT，Terraza A，Liautard J，Kohler S，Rouot B，Dornand J，Liautard JP.2001.Major outermembrane protein Omp25 of Brucella suis is involved in inhibition of tumornecrosis factor alpha production during infection of human macrophages.Infection and Immunity 0。
汉氏巴尔通氏体细胞可以通过Dehio M，Knorre A，Lanz C，Dehio C.1998描述的方法进行转化。Construction of versatile high-level expressionvectors for Bartonella henselae and the use of green fluorescent protein as a newexpression marker.Gene 。
五日热巴尔通氏体(Bartonella quintana)细胞可以通过Dehio M，KnorreA，Lanz C，Dehio C.1998描述的方法进行转化。Construction of versatilehigh-level expression vectors for Bartonella henselae and the use of greenfluorescent protein as a new expression marker.Gene 。
Mannheimia haemolytica细胞可以通过Marciel AM，Highlander SK.2001描述的方法进行转化。Use of operon fusions in Mannheimia haemolyticato identify environmental and cis-acting regulators of leukotoxin transcription.Infection and Immunity 9。
结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)细胞可以通过Hinds J，Mahenthiralingam E，Kempsell KE，Duncan K，Stokes RW，Parish T，Stoker NG.1999描述的方法进行转化。Enhanced gene replacement in mycobacteria.Microbiology ；和Bachrach G，Colston MJ，Bercovier H，Bar-NirD，Anderson C，Papavinasasundaram
KG. 2000.A new single-copymycobacterial plasmid，pMF1，from Mycobacterium fortuitum which iscompatible with the pAL5000 replicon.Microbiology .
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、伞菌假单胞菌(Pseudomonasagarici)和褐鞘假单胞菌(Pseudomonas fuscovaginae)细胞可以通过Enderle PJ，Farwell MA.1998描述的方法进行转化。Elctroporation of freshly platedEscherichia Coli and Pseudomonas aeruginosa cells.Biotechniques 25954；和Kim C，Wood TK.1998.Electroporation of pink-pigmented methylotrophicbacteria.Applied Biochemistry and Biotechnology 7381-88。
天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)细胞可以通过Oh SH，Chater KF.1997描述的方法进行转化。Denaturation of circular or linear DNA facilitatestargeted integrative transformation of Streptomyces coelicolor A3(2)Possiblerelevance to other organisms. Journal of Bacteriology ；和Gregorovic G，Vujaklija D.2001.High efficiency of direct plasmid transferbetween two Streptomyces spp.，and between Streptomyces spp.and E.coli.FoodTechnology and Biotechnology 3949-53.
霍乱弧菌(Vibrio cholerae)细胞可以通过Panda DK，Banerjee R，Das J.1995介绍的方法进行转化。Construction of shuttle vectors for cloning in vibriocholerae and Escherichia coli.Journal of Biosciences 。
杜氏嗜血菌(Haemophilus ducreyi)细胞可以通过Hansen EJ，Latimer JL，Thomas S E，Helminen M，Albritton WL，Radolf JD.1992介绍的方法进行转化。Use of electroporation to construct isogenic mutants ofHaemophilus ducreyi.Journal of Bacteriology 9；和Windsor HM，Gromkova RC，Koornhof HJ.1993.Transformation of v-factor independence from Haemophilusducreyi to haemophilus influenzae and haemophilus parainfluenzae.MedicalMicrobiology Letters 。
这项发明还包括(i)如上面所描述的表达盒或载体，用来表达编码多肽或多肽衍生物的核苷酸序列，其多肽是定位在外膜的，和(ii)用表达盒或载体转化了的原核细胞并且其在细胞的表面表达多肽。
具体的这个多肽是载体蛋白和过客蛋白的融合体，过客蛋白能够到达细胞表面，这可以通过蛋白酶可接近性分析(protease accessibility)或放射碘化作用(radio-iodination)的方法进行确定。
重组的表达系统是从原核或真核寄主中选择的，从原核中更适宜。真核寄主包括酵母细胞(例如，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris))，哺乳动物细胞(例如，COS1，NIH3T3，或JEG3细胞)，以及植物细胞。原核寄主包括革兰氏阴性菌，具体包括土壤杆菌属，更适宜的是根癌土壤杆菌，根瘤菌属(Rhizobium)，布鲁氏菌属(Brucella)，汉氏巴尔通氏体，溶血巴斯德氏菌，结核分枝杆菌，杜氏嗜血菌，单胞菌属(Pseudomonas)，大肠埃希氏菌，克雷伯氏菌属(Klebsiella)，欧文氏菌属(Erwinia)，志贺氏菌属(Shigella)，沙门氏菌属(Salmonella)，霍乱弧菌，乳杆菌属(Lactobacillus)，卡-介二氏菌(Bacille biliédeCalmette-Guérin)(BCG)，以及链球菌属(Steptococcurs)，优选不产毒素的霍乱弧菌突变菌株和减毒的鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella tyPhimurium)菌株。
细菌和真核细胞可以从多种渠道包括从商业渠道获得，例如可以从美国典型培养物保藏中心(ATCC；Rockville，Maryland)获得，用于重组蛋白表达的商购细胞在购买时还附带了其使用说明。
不产毒素的霍乱弧菌突变株据美国专利4,882,278描述的，其含有两个ctxA等位基因缺失以致于不产生功能性的霍乱毒素。WO 92/11354描述了一个菌株，其中的irgA位点被突变失活，这个突变可以和单链的ctxA突变组合。WO 94/01533描述了一个缺失突变体，其缺少功能型的ctxA和attRS1DNA序列。如WO 94/19482所描述的，这些突变株通过遗传工程使其表达异源蛋白。
WO 92/11361描述了减毒的鼠伤寒沙门氏菌菌株能否通过遗传工程表达重组的异源蛋白。
目前发明的其它的用于作为蛋白表达寄主的细菌菌株如；High等EMBO(和Sizemore等Science(中描述的弗氏志贺代菌(Shigella flexneri)；Medaglini等描述的格氏链球菌(Sreptococcusgordonii)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(；和Flynn J.L描述的卡-介二氏菌，Cell.Mol.Biol.(1994)40(suppl.I)31，WO 88/06626，WO 90/00594，WO 91/13157，WO 92/01796，和WO 92/21376。
本发明通常使用一种或多种通常可以得到的革兰氏阴性菌作为寄主细胞。但是，对于一些突变造成其膜成分有所改变的粗糙(rough)突变体，我们仍然希望其可用于本发明的实践。含有较高磷脂的膜，例如可能会给融合多肽在高温下的表达创造更好的条件。另一方面，可能由于脂质-蛋白间相互作用的增强，可使一些多肽更接近膜表面，从而可能会达到增强免疫原反应或改变吸附特性的目的。象这样的突变，自发的或非自发的，我们都希望其可以作为寄主细胞或作为膜定位序列或跨膜序列的来源。
在细菌中，我们发明的多肽可以插入到细菌基因组中或仍然作为质粒的一部分而保持自由状态。
表达系统的选择要依赖于我们所期望的表达多肽的特征决定。例如，将本发明多肽制备成一种特定的脂化形式可能是有利的。
本领域技术人员都知道，不是所有的载体和表达调控序列以及寄主都同样适合表达本发明的多核苷酸。然而，在以下所述的指导下，不用做不必要的试验，便可对载体，表达调控序列和寄主所出选择，同时不偏离本发明的保护范围。
在选择载体方面，寄主一定要选择适合载体在其中存在和复制，同时，还要考虑载体的拷贝数、控制拷贝数的能力以及其他蛋白如抗生素抗性蛋白的表达。在选择表达调控序列方面，需要考虑很多因素，其中重要的因素是考虑序列的相关强度(如在不同条件下控制表达的能力)，控制序列功能的能力，要表达的多核苷酸与调控序列间的适宜性(例如，要考虑避免出现会抑制有效转录的发夹二级结构)。在选择寄主方面，所选寄主要是与所选载体相适宜的单细胞寄主，对表达产物的可能毒性要有一定耐受力，如果需要其产物要能够分泌到外膜，要能够表达要求构象的蛋白，容易扩大规模以及容易纯化终产物。
对表达盒的选择依赖于所选择的寄主系统以及表达多肽的所需特征。通常，一个表达盒包括在寄主系统中有功能并且可以组成型或诱导型表达的启动子；核糖体结合位点；如果有必要还需要一个起始密码子(ATG)；编码信号肽例如脂质化(lipidation)信号肽的区域；本发明的DNA分子；终止密码子和任选3′终止区(翻译和/或转录终止子)。信号肽的编码序列与发明中的多聚核苷酸邻近并且放置在一个合适的读框内。信号肽的编码序列与编码成熟多肽的DNA分子同源或异源并且与用于表达的寄主的分泌装置相适宜。本发明中DNA分子的开放读框，单独或与信号肽一起，都放置在启动子之下以便于在寄主内转录和表达。启动子和信号肽编码区对本领域技术人员是已知的且可得到，这些包括例如，鼠伤寒沙门氏菌启动子(和由此得到的衍生物)可以在阿拉伯糖(启动子araB)的诱导下并且在革兰氏阴性菌如大肠埃希氏菌中有作用(如美国专利5,028,530和Cagnon等，(Cagnon et al.，Protein Engineering()843)所描述的)；噬菌体T7编码RNA聚合酶的基因启动子，该启动子在表达T7聚合酶的多种大肠埃希氏菌菌株中起作用(美国专利4,952,496)；OspA脂质化信号肽；以及RlpB脂质化信号肽(Takase et al.，J.Bact.()。
表达盒通常都是表达载体的一部分，根据在所选择的表达系统中的复制能力对其进行选择。表达载体(例如质粒)可以从例如Pouwels等描述的载体中进行选择(Cloning VectorsA Laboratory Manual 1985，Supp.1987)。合适的表达载体可以从不同的商业公司购买。
用表达载体转化/转染寄主细胞的方法已经广为人知，并且依赖于如Sambrook，J.E.F.等在Molecular Cloning a Laboratory Manual 2nded(1989)介绍的对寄主细胞的选择。Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor N.Y.
在表达方面，发明中的重组多肽(或由此得到的多肽)产生并保持在细胞内，分泌到细胞外介质中或壁膜间隙或嵌入膜中。所述多肽可以从培养的细胞提取物或重组细胞培养物离心后得到的上清液中得到纯化。通常重组多肽是通过基于抗体的亲和进行纯化的或其他的可以被本领域技术人员采用的方法进行纯化，如编码多肽的多聚核苷酸或其衍生物与小的亲和结合域的融合体。利用抗体通过免疫亲和来纯化本发明多肽的方法将在以下介绍。
在这里提供的序列信息有助于设计用于诊断的特异的核苷酸探针和引物。因而，本发明的另一方面提供了在SEQ ID NO1或3或相关的同源序列中存在的或由于遗传密码子的简并性而从上述这些序列中衍生得到的核酸探针或引物。
这里所提的“探针”是指在严谨条件下与SEQ ID NO1或3中核酸分子、或其相关同源序列、互补或反义序列杂交的DNA(较好的是单链)或RNA分子(或其修饰物或其组合)。通常，探针要比全长序列明显短。这样的探针包含约5到约100(例如，10，12，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60...等等)，优选约从10到约80个核苷酸。具体地，探针至少要有75％(例如至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％)，优选至少要有95％与SEQ ID NO1或3的部分同源。探针也可以包含和这些序列和部分互补的序列。探针也可以包含一些修饰的碱基如肌苷，5甲基脱氧胞苷，脱氧尿苷，二甲氨基-5-脱氧尿苷或二氨基-2，6-嘌呤。糖和磷酸残基也可以修饰或取代。例如，一个脱氧核糖可以被聚酰胺取代(Nielsen et al.，Science()而且磷酸酯残基可以被酯基团如二磷酸酯，烷基酯，芳基膦酸酯和偶磷硫羰酸酯所代替。此外核糖核苷酸中2′-羟基基因可以被包括如烷基在内的基团修饰。
本发明的探针可以作为捕获或检测探针被用于诊断。这种捕获探针通常直接或间接通过共价的方式或被动的吸附被固定在一个固相支持上。一个检测探针是被检测标记物所标记，这种标记物包括放射性同位素、酶如过氧化物酶、碱性磷酸酶和能够水解发色、发出荧光或发光的底物的酶、可以产色、发出荧光或发光的化合物、核苷酸碱基类似物和生物素。
本发明的探针可以用于传统的各项杂交技术中，例如斑点杂交(dot blot)中(Maniatis et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual(1982)Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York)，Southern印迹，northern印迹，或夹心法技术中(Dunn et al.，Cell()。后项技术包括利用至少部分不同的核苷酸序列作为特异的捕获探针和/或检测探针的应用。
引物通常是大约10到约40个核苷酸(例如，11，12，13，14，15，17，20，25，30或35个核苷酸)用于在扩增过程(例如PCR)或延长过程或反转录方法中起始DNA的酶促聚合。标记涉及PCR的诊断方法中所用的引物的技术已广为人知。
如这里所描述的，本发明还包括(i)包括本发明探针在内应用于检测和/或鉴定土壤杆菌属存在于生物材料的试剂；(ii)检测和/或鉴定生物材料中土壤杆菌属存在的方法。在一个实施方案中，检测和鉴定的方法包括以下步骤(a)从生物材料中得到样本，(b)从所述材料中抽提DNA或RNA并变性，然后(c)在严谨的杂交条件下将本发明的探针例如可以是捕获探针、检测探针或两者共存的与核酸杂交，检测结果。在另一实施方案中，检测和鉴定方法包括以下步骤(a)从生物材料中得到样本，(b)从中抽提DNA，(c)至少一个，最好是二个本发明的引物用于对抽提DNA的聚合酶链式反应，(d)产生扩增的片段。
很显然，揭示SEQ ID NO1或3中多聚核苷酸或其同系物或部分的序列，可以得到相关的氨基酸序列。因此本发明还包括经充分纯化了的本发明多聚核苷酸编码的多肽或其多肽衍生物。
“充分纯化的多肽”是指将多肽与其自然发生环境完全分开和/或与其合成环境中的大多数多肽分开的多肽。例如，充分纯化的多肽与细胞质中的多肽分离。在SDS-PAGE凝胶上的一条带并不等同于一个充分纯化的多肽，这是因为凝胶样品含有很多种类的多肽。了解此项技术的人将会明白本发明中多肽可以从自然资源中纯化如从一个土壤杆菌菌株纯化，或通过重组的方式制备。
本发明包括的多肽、同系物或片段是经过修饰的，以保持或改进它们在细胞表面展示过客蛋白的能力。这些修饰包括前面介绍的氨基酸的取代、缺失和插入，但并不改变其固有的拓扑结构和靶定到外膜的能力。
多肽或多肽的衍生物可以通过已知的实验手段产生和纯化，并用于得到其抗体。如上所述，多肽或其衍生物可以作为一种融合蛋白产生，其融合蛋白上带有利于纯化的融合尾。融合蛋白用于刺激小的哺乳动物产生免疫反应得到抗所述多肽或多肽衍生物的抗体(单一特异性抗体(monospecificantibody)，因此，本发明还包括与本发明多肽或多肽衍生物结合的单一特异性抗体。
“单一特异性抗体”是指该抗体能和本发明中某一特异性蛋白发生反应，所述蛋白即}
申请/专利权人：
公开/公告号：CN1332786A
发明/设计人：;;;
公开/公告日：
主分类号：
搜索关键词：
【说明书】：
C.在环区域以外位置的取代-此外，可以在环区域以外的位置，例如在74位进行野生型枯草溶菌素309一或多个取代。如果只在74位对该枯草杆菌蛋白酶附加取代，则该取代物优选为Asn、Asp、Glu、Gly、His、Lys、Phe或Pro，更优选为His或Asp。但是，可以在74位取代同时在一或多个环区域进行改变，例如在残基97、99、101、102、105和121位。在WO95/29979、WO95/30010和WO95/30011中进一步描述了枯草溶菌素BPN变体和枯草杆菌蛋白酶309变体，所有这些文献都于日公开，本文引用它们作为参考。iv)脂酶适于洗涤剂应用的脂酶包括由微生物假单胞菌属产生的脂酶，如GB1,372,034中所述的司徒茨氏假单孢菌(Pseudomonas stutzeri)ATCC19.154。还参见日公开的日本专利申请53,20487中的脂酶。其它适宜的脂酶包括表现出与脂酶抗体发生阳性免疫交叉反应，由微生物荧光假单孢菌(Pseudomonas fluorescens)IAM 1057产生的脂酶。该脂酶购自Amano Pharmaceutical Co.Ltd.，Nagoya，Japan，商品名为脂酶P“Amano”，本文称之为“Amano-P”。进一步的适宜的脂酶如M1 LipaseR和LipomaxR(Gist-Brocades)。其它适宜的商业脂酶包括Amano-CES；来源于粘稠色杆菌(Chromobacterviscosum)，如粘稠杆菌脂解属变种(Chromobacter viscosum var.lipolyticum)NRRLB3673的脂酶，购自Toyo Jozo Co.，Tagata，日本；购自U.S.Biochemical Corp.，美国和Disoynth Co.，荷兰的粘稠色杆菌(Chromobacter viscosum)脂酶以及来源于糖菖蒲件克霍尔德氏菌(Pseudomonas gladioli)的脂酶；来源于疏绵毛状腐质霉(Humicola lanuginosa)并可以从Novo商购得到的LIPOLASE?酶，也是本发明的一种优选脂酶，还可参见EP341,947。在Novo的WO9414951A描述了对过氧化物酶稳定的脂酶变体，还可参见WO9205249和RD。高度优选的脂酶为美国申请序列号08/341,826中所述的来源于疏绵毛状腐质霉(Humicola lanuginosa)的天然脂酶的D96L脂肪分解酶变体(还可参见专利申请WO92/05249，即其中来自疏绵毛状腐质霉(Humicola lanuginosa)的天然脂酶第96位的天冬氨酸(D)残基变为亮氨酸(L)。根据命名法，这种96位的天冬氨酸被亮氨酸取代表示为D96L.)。优选应用疏绵毛状腐质霉(Humicola lanuginosa)菌株DSM4106。尽管已大量公开过脂酶，但到目前为止只有疏绵毛状腐质霉(Humicola lanuginosa)和米曲霉(Aspergillus oryzae)作为宿主产生的脂酶广泛用作织物洗涤产品的添加剂。如以上所指出的，它可以从Novo Nordisk获得，其商品名为LioposaseTM。为了最优化脂酶的去污性能，Novo Nordisk已制备了大量的变体。如WO92/05249中所述，该天然疏绵毛状腐质霉(Humicola lanuginosa)脂酶的D96L变体改善了猪油去污效力，高出野生型脂酶(被比较的酶量为每升0.075-2.5mg蛋白质)的4.4倍。日Novo Nordisk在《研究发现》(Research Disclosure)No.35944上公开了脂酶变体(D96L)可以以每升洗涤液相应0.001-100mg(5-500,000LU/升)脂酶变体之量加入。加入到本发明组合物中的脂酶的量为每升洗液50LU-8500LU。优选变体D96L存在量为每升洗液100LU-7500LU，更优选量为每升洗液150LU-5000LU。一般在该洗涤剂组合物中加入的脂酶和/或角质酶的水平为占该洗涤剂组合物重量0.0001％-2％活性酶，。适宜的酶还可以为角质酶[EC3.1.1.50]，它被认为是一种特殊类型的脂酶，即不要求界面活化的脂酶。WO-A-88/09367(Genencor)中已描述过在该洗涤剂组合物中加入角质酶。v)纤维素酶本发明的洗衣用洗涤剂组合物可进一步包括至少0.001％重量，优选至少约0.01％重量的纤维素酶。但是，要以有效量的纤维素酶用于本发明所述的洗衣用洗涤剂组合物。术语“有效量”指任何能够在底物，如织物、餐具等上产生清洗、去污斑、去污垢、增白、除臭、清新度改善等效果的酶量。本发明的组合物一般将包括约0.05％-约2％，优选约0.1％-约1.5％重量的商业酶制品。本发明的纤维素酶在商业酶制品中的含量为每克组合物足以提供0.005-0.1Anson单位(AU)活性。优选含酶组合物的最优化pH约为7-9.5。日授权的Barbesgaard等人的美国专利4,435,307公开了由Humicola insolens产生的纤维素酶。其它适宜的纤维素酶包括由腐殖霉属菌株(如Humicola insolens、Humicola griseavar.thermoidea)产生的酶，和由杆菌属或气单胞菌属产生的酶。其它有用的纤维素酶为从海软体动物Dolabella Auricula Solander的肝胰腺提取到的纤维素酶。适宜的纤维素酶还在以下文献中公开过：GB2,075,028A(Novo Industri A/S)、GB 2,095,275 A(KaoSoapCo.，Ltd.)、和Horikoshi等人的美国专利号3,844,890(Rikagaku Kenkyusho)。此外，日公布的Novo Nordisk A/S的PCT国际申请号WO91/17243中也描述了适宜的纤维素酶及其制备方法。现有技术中已知的纤维素酶可以根据以下商品名从供应商处获得：Celluzyme?、Endolase?和Carezyme?。为工业化制备本发明的产品，优选应用重组DNA技术。但是可以应用其它技术，包括调节所用微生物的发酵或突变来确保过量产生理想的酶活性物。这些方法和技术在现有技术中众所周知，并可以由本领域技术人员容易地实施。vi)其它酶可以将过氧化物酶与氧气源如过碳酸盐、过硼酸盐、过氧化氢等结合使用，以进行“溶液漂白”或防止洗涤期间从底物上洗脱的染料或色素转移到洗涤溶液中的其它底物上。已知的过氧化物酶包括辣根过氧化物酶、木质素酶和卤过氧化物酶如氯-或溴-过氧化物酶。日Novo的WOA和Novo的WO8909813A中描述了含有过氧化物酶的洗涤剂组合物。酶稳定体系在含有(但并不只含)酶的液体组合物中，本发明含有约0.001％-约10％，优选约0.005％-约8％，最优选约0.01％-约6％酶稳定体系，以该酶稳定体系的重量计。例如，该酶稳定体统可以包括钙离子、硼酸、丙二醇、链羧酸、硼酸及其混合物，并且可以根据该洗涤剂组合物的类型和物理形态来设计处理不同的稳定化问题。参见Severson的US4,537,706对硼酸盐稳定剂的评价。适宜的氯清除剂阴离子已为广泛所知，并且可容易地得到，如果使用，可以是含有铵离子与亚硫酸盐、酸式亚硫酸盐、硫代亚硫酸盐、硫代硫酸盐、碘化物等的盐。还可以使用抗氧剂，如氨基甲酸酯、抗坏血酸盐等，有机胺，如乙二胺四乙酸(EDTA)或其碱金属盐、单乙醇胺(MEA)及其混合物。如果需要，还可以使用其它常规的清除剂，如硫酸氢盐、硝酸盐、氯化物、过氧化氢源，如过硼酸钠四水合物、过硼酸钠一水合物和过碳酸钠、以及磷酸盐、缩合磷酸盐、乙酸盐、安息香酸盐、柠檬酸盐、甲酸盐、乳酸盐、苹果酸盐、酒石酸盐、水杨酸盐等，及其混合物。芳香剂本发明的组合物和方法中所用的芳香剂或芳香成分包括很宽范围的天然或合成化学成分，包括(但不限于)醛、酮、酯等。还包括含有橙油、柠檬油、玫瑰提取物、薰衣草、麝香、广藿香、香脂香精、檀香油、松油、杉木等成分复杂混合物的多种天然提取物和香精。成品芳香剂可以包括这些成分的极复杂的混合物。成品芳香剂一般重量含量约为本发明洗涤剂组合物的0.01％-约4％，而单独的芳香成分重量含量约为成品芳香剂组合物的0.0001％-约90％。物料护理剂
友情链接：交换友情链接需要网站权重大于2，网站收录10W以上，如符合条件，请联系QQ：。
行业网站：相关推荐：
400-周一至周五 9:00-18:00
服务热线：400-投诉建议：022-
扫一扫，微信关注高智网
高智&让创新无法想象2000万件&专利数据[发明专利]含有抗PCSK9抗体的稳定制剂在审
申请/专利权人：
公开/公告号：CNA
发明/设计人：;
公开/公告日：
主分类号：
分类号：;;;
搜索关键词：
【说明书】：
本领域中了解亲水氨基酸指数在对蛋白质赋予相互作用性生物功能方面的重要性。Kyte等，J.Mol.Biol.,157:105-131(1982)。已知某些氨基酸可被取代成具有类似亲水指数或分值的其它氨基酸且仍然保留类似的生物活性。在某些实施方案中，在基于亲水指数作出变化时，包括亲水指数在±2内的氨基酸的取代。在某些实施方案中，包括亲水指数在±1内的氨基酸的取代，并且在某些实施方案中，包括亲水指数在±0.5内的氨基酸的取代。本领域中还应了解，类似氨基酸的取代可基于亲水性有效地进行，尤其在由此产生的生物功能性蛋白质或肽旨在用于免疫学实施方案中时，如在本发明的情况下。在某些实施方案中，蛋白质的如受其邻近氨基酸的亲水性管控的最大局部平均亲水性与其免疫原性及抗原性相关，即与蛋白质的生物性质相关。以下亲水性值已指定给这些氨基酸残基：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；蛋氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)以及色氨酸(-3.4)。在基于类似亲水性值作出变化时，在某些实施方案中，包括亲水性值在±2内的氨基酸的取代，在某些实施方案中，包括亲水性值在±1内的氨基酸的取代，并且在某些实施方案中，包括亲水性值在±0.5内的氨基酸的取代。还可基于亲水性从一级氨基酸序列鉴定表位。这些区域又被称为“表位核心区”。示例性氨基酸取代列举于表1中。表1氨基酸取代术语“衍生物”是指包括除氨基酸(或核酸)的插入、缺失或取代以外的化学修饰的分子。在某些实施方案中，衍生物包含共价修饰，包括(但不限于)与聚合物、脂质或其它有机或无机部分进行化学键结。在某些实施方案中，化学修饰的抗原结合蛋白的循环半衰期可长于未化学修饰的抗原结合蛋白。在某些实施方案中，化学修饰的抗原结合蛋白对所要细胞、组织和/或器官的靶向能力可得以改进。在一些实施方案中，衍生的抗原结合蛋白被共价修饰成包括一个或多个水溶性聚合物连接物，包括(但不限于)聚乙二醇、聚氧乙二醇或聚丙二醇。参见例如以下美国专利号：4,640,835、4,496,689、4,301,144、4,670,417、4,791,192及4,179,337。在某些实施方案中，衍生的抗原结合蛋白包含一种或多种聚合物，包括(但不限于)单甲氧基-聚乙二醇、葡聚糖、纤维素或其它碳水化合物基聚合物、聚-(N-乙烯基吡咯烷酮)-聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯多元醇(例如甘油)及聚乙烯醇、以及所述聚合物的混合物。在某些实施方案中，衍生物被聚乙二醇(PEG)亚单位共价修饰。在某些实施方案中，在衍生物的一个或多个特定位置处，例如在氨基端处键结一个或多个水溶性聚合物。在某些实施方案中，一种或多种水溶性聚合物随机连接至衍生物的一个或多个侧链。在某些实施方案中，PEG用于改进抗原结合蛋白的治疗能力。在某些实施方案中，PEG用于改进人源化抗体的治疗能力。某些此类方法例如论述于美国专利号6,133,426中，其据此出于任何目的以引用的方式并入本文。肽类似物通常作为性质类似于模板肽的非肽药物用于药物产业中。这些类型的非肽化合物称为“肽模拟物(peptide mimetic)”或“肽仿真物(peptidomimetic)”。Fauchere,J.,Adv.Drug Res.,15:29(1986)；Veber和Freidinger,TINS，第392页(1985)；及Evans等，J.Med.Chem.,30:)，其出于任何目的以引用的方式并入本文。所述化合物常借助于计算机化分子建模来开发。在结构上类似于治疗上适用的肽的肽模拟物可用于产生类似的治疗或防治效应。一般来说，肽仿真物在结构上类似于范式多肽(即具有生物化学性质或药理学活性的多肽)，如人类抗体，但一个或多个肽键任选地通过本领域中熟知的方法由选自以下的键置换：--CH2NH--、--CH2S--、--CH2-CH2--、--CH＝CH-(顺式和反式)、--COCH2--、--CH(OH)CH2--及--CH2SO--。用相同类型的D-氨基酸系统性取代共有序列的一个或多个氨基酸(例如D-赖氨酸替代L-赖氨酸)可用于某些实施方案中以生成更稳定的肽。此外，可通过本领域中已知的方法(Rizo和Gierasch,Ann.Rev.Biochem.,61:387(1992)，出于任何目的以引用的方式并入本文中)产生包含共有序列或大致上相同的共有序列变化的限制性肽；例如通过添加能够形成使肽环化的分子内二硫桥键的内部半胱氨酸残基。如说明书通篇中关于生物物质(如多肽、核酸、宿主细胞及其类似物)使用的术语“天然存在的”是指物质可见于自然界中或为物质的可见于自然界中的某一形式。如本文所用的“抗原结合蛋白”(“ABP”)意指结合指定的目标抗原的任何蛋白质。在本申请中，指定的目标抗原为PCSK9蛋白或其片段。“抗原结合蛋白”包括(但不限于)抗体及其结合部分，如免疫功能性片段。肽体为抗原结合蛋白的另一实例。如本文所用的术语抗体或免疫球蛋白链(重链或轻链)抗原结合蛋白的“免疫功能性片段”(或简称为“片段”)为一种抗原结合蛋白，其包含抗体的缺乏至少一些存在于全长链中的氨基酸但仍然能够特异性结合抗原的部分(不考虑那个部分如何获得或合成)。所述片段具有生物活性，因为其结合目标抗原并且可与其它抗原结合蛋白(包括完整抗体)竞争结合给定的表位。在一些实施方案中，片段为中和性片段。在一些实施方案中，片段可阻断或降低LDLR与PCSK9之间相互作用的可能性。在一方面，所述片段将保留至少一个CDR存在于全长轻链或重链中，并且在一些实施方案中，将包含单一重链和/或轻链或其部分。这些生物活性片段可通过重组DNA技术产生，或可通过酶促或化学裂解抗原结合蛋白(包括完整抗体)而产生。免疫功能性免疫球蛋白片段包括(但不限于)Fab、双抗体(位于同一条多肽上的重链可变域与轻链可变域经由短肽接头连接，所述肽接头过短以致于不允许同一条链上的两个结构域之间的配对)、Fab'、F(ab')2、Fv、结构域抗体及单链抗体，且可源于任何哺乳动物来源，包括(但不限于)人类、小鼠、大鼠、骆驼科或兔。进一步预期本文公开的抗原结合蛋白的功能性部分(例如一个或多个CDR)可共价结合于第二蛋白质或小分子以生成针对体内具体目标、具有双功能治疗性质或具有延长的血清半衰期的治疗剂。如本领域技术人员应了解，抗原结合蛋白可包括非蛋白质组分。在本公开的一些章节中，本文利用“数字/字母/数字”(例如25A7)描述ABP的实例。在这些情况下，确切名称表示具体抗体。即，名为25A7的ABP不一定与名为25A7.1的抗体相同(除非其在说明书中明确教导为相同的，例如25A7和25A7.3)。如本领域技术人员应了解，在一些实施方案中，LDLR不为抗原结合蛋白。在一些实施方案中，LDLR的结合子区段(subsection)不为抗原结合蛋白，例如EGFa。在一些实施方案中，PCSK9进行体内信号传导所经由的其它分子不为抗原结合蛋白。所述实施方案将如此被明确鉴定。本文所述的某些抗原结合蛋白为抗体或源于抗体。在某些实施方案中，抗原结合蛋白的多肽结构是基于抗体，包括(但不限于)单克隆抗体、双特异性抗体、微型抗体、域抗体、合成抗体(在本文中有时称为“抗体模拟物”)、嵌合抗体、人源化抗体、人类抗体、抗体融合物(在本文中有时称为“抗体缀合物”)及其各自的片段。在一些实施方案中，ABP包含高亲和性多聚体(avimer)(紧密结合肽)或由所述高亲和性多聚体组成。本文进一步描述这些不同的抗原结合蛋白。“Fc”区包含两个重链片段，其包含抗体的CH1及CH2域。这两个重链片段由两个或更多个二硫键及由CH3域的疏水性相互作用固持在一起。“Fab片段”包含一条轻链以及一条重链的CH1和可变区。Fab分子的重链不能与另一重链分子形成二硫键。“Fab'片段”包含一条轻链以及一条重链的含有VH域和CH1域及CH1域与CH2域之间的区域的部分，由此可在两个Fab'片段的两条重链之间形成链间二硫键以形成F(ab')2分子。“F(ab')2片段”含有两条轻链以及含有CH1域与CH2域之间的一部分恒定区的两条重链，由此在两条重链之间形成链间二硫键。因此，F(ab')2片段由经两条重链之间的二硫键固持在一起的两个Fab'片段构成。
友情链接：交换友情链接需要网站权重大于2，网站收录10W以上，如符合条件，请联系QQ：。
行业网站：相关推荐：
400-周一至周五 9:00-18:00
服务热线：400-投诉建议：022-
扫一扫，微信关注高智网
高智&让创新无法想象2000万件&专利数据您所在位置： &
 &  & 
蛋白质分类问题的特征提取算法研究论文.pdf145页
本文档一共被下载：
次 ,您可免费全文在线阅读后下载本文档
文档加载中...广告还剩秒
需要金币：200 &&
优秀硕士毕业论文，完美PDF格式，可在线免费浏览全文和下载,支持复制编辑,可为大学生本专业本院系本科专科大专和研究生学士硕士相关类学生提供毕业论文范文范例指导,也可为要代写发表职称论文提供参考！！！
你可能关注的文档：
··········
··········
国防科学技术大学
博士学位论文
蛋白质分类问题的特征提取算法研究
姓名：张振慧
申请学位级别：博士
专业：应用数学
指导教师：王正华
座机电话号码
国防科学技术大学研究生院博士学位论文
人类基因组计划的实施带来了蛋白质数据库中海量的序列信息，而对蛋白质
高级结构和功能的认识却远远落后于序列信息。面对浩瀚的蛋白质序列数据，探
索理论与计算的方法研究蛋白质结构和功能具有重要意义，也是后基因组时代生
物信息学的核心问题之一。
由于蛋白质结构和功能的复杂性，人们很难抓住其整体特征用简单的方法对
所有蛋白质进行分类。而在蛋白质研究中存在许多专业分类方法，每一种分类准
则在一定领域内都有很重要的实用价值。因此蛋白质分类问题作为蛋白质组学研
究的一个分支，近年来受到研究者们越来越多的关注。蛋白质分类研究是全面掌
握蛋白质结构与功能的前提和基础，在分子生物学、细胞生物学、药理学和医学
中扮演着非常重要的角色。
蛋白质序列的特征提取是基于计算的蛋白质分类研究中最为基本的问题，也
是决定分类质量的关键问题。本文对此进行了深入的分析和研究，针对蛋白质分
类研究中的四类基本问题，提出和实现了四种不同的特征提取算法，并在标准数
据集上进行了测试验证和比较分析。本文的主要工作和创新之处概括如下：
1 蛋白质的结构型可以为蛋白质空间结构预测提供重要的信息。对于一个
结构未知的蛋
正在加载中，请稍后...以下试题来自：
判断题矿粉与沥青粘附性的试验方法采用亲水系数法。沥青混合料选用矿粉主要采用亲水系数大于1的碱性石灰岩矿粉。( ) 错
为您推荐的考试题库
你可能感兴趣的试题
1.判断题 错2.判断题 错3.判断题 对4.判断题 错5.判断题 对
热门相关试卷
最新相关试卷aopB基因,蛋白,同系物,片段和它们的变体,以及它们在细胞表面展示方面的应用的制作方法
专利名称aopB基因,蛋白,同系物,片段和它们的变体,以及它们在细胞表面展示方面的应用的制作方法
技术领域该项发明是关于根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的AopB外膜蛋白、它的变体、同系物、片段和相应的DNA分子，它们可用于细菌细胞表面的蛋白展示。
背景技术 分子展示技术已发展用于构建和筛选多肽与抗体展示库，并用于开发重组疫苗、吸附剂、重组生物催化剂，以及用于诊断和分析的固相试剂。分子展示技术的概念在于它提供了基因型(如抗体的可变区基因)和表型(如抗原结合)之间的物质连接，达到同时筛选编码欲求功能(如结合)蛋白的基因的目的。
噬菌体展示已经用于探明多肽-配体之间的相互作用和广泛的应用于高亲和蛋白的分离，包括抗体(Winter G，Milstein C.1991.Man-madeantibodies.Nature ；Vaughan T.J.，Williams A.J.，Pritchard K.，Osbourn J.K.，Pope A.R.，Earnshaw J.C.，McCafferty J.，Hodits R.A.，Wilton J.，Johnson K.S.1996.Human antibodies with sub-nanomolar affinities isolatedfrom a large non-immunized phage display library.Nat Biotechnol ).噬菌体库的筛选过程通常是用固定后的配体进行重复的噬菌体捕获和洗脱，然后将噬菌体在细菌中加以扩增。最近提出一种展示技术是应用核糖体使多肽和其编码RNA在体外加以连接(Hanes J.，Pluckthun A.1997.Invitro selection and evolution of functional proteins by using ribosome display.Proc Natl Acad Sci USA )。然而，在这两种方法中使用的噬菌体和核糖体都不能够自我复制，而且太小以致于不能够利用强有力的细胞分选技术例如荧光激活细胞分选术(FACS)的协助。
FACS可有助于高效大量筛选在细菌表面展示的蛋白或抗体库，因为其使用的体积相对大的细菌细胞能让该系统挑选可与荧光标记后的配体高亲和、高特异性结合的克隆(Daugherty PS，Olsen MJ，Iverson BL，Georgiou G.1999.Development of an optimized expression system for the screening ofantibody libraries displayed on the Escherichia coli surface.Protein Eng.12613-21；Steidler L；Viaene J；Fiers W；Remaut E.1996.Functional display of aheterologous protein on the surface of Lactococcus lactis by means of the cellwall anchor of Staphylococcus aureus protein A.Immunotechnology.297-102；Andreoni C，Goetsch L，Libon C，Samuelson P，Nguyen TN，Robert A，Uhlen M，Binz H，Stahl S.1997.Flow cytometric quantification of surface-displayedrecombinant receptors on staphylococci.Biotechniques.，704)。使用当前的高速细胞分选仪，1小时可以分选出108个细胞，其筛选量类似于通过噬菌体库筛选可获得的结果。因而，细胞表面展示结合FACS为蛋白工程提供了非常重要可供选择的展示技术。噬菌体展示方法是为灵敏的亲和筛选而设计，它依赖于单个分子的结合或者通过gpIII融合的单价展示。相对而言，细胞表面方法通常每个细胞可以获得104-105个拷贝。从而，在稳定性或表达水平方面的随机变异不会影响到细胞表面库的筛选。
细菌表面展示系统的发展起始于小的肽融合到一些外膜蛋白，例如OmpA，LamB，和PhoE后可以定位到大肠埃希氏菌(Escherichia coli)的细胞表面(Charbit A，Boulain J.C，Ryter A，Hofnung M.1986.Probing the topologyof a bacterial membrane protein by genetic insertion of a foreign epitopeexpression at the cell surface.EMBO J.53029-37；Freudl R，MacIntyre S，Degen M，Henning U.1986.Cell surface exposure of the outer membraneprotein OmpA of Escherichia coli K-12.J Mol Biol.；Agterberg M，Adriaanse H，Tommassen J.1987.Use of outer membrane protein PhoE as acarrier for the transport of a foreign antigenic determinant to the cell surface ofEscherichia coli K-12.Gene.59145-50)。在细菌细胞表面表达蛋白的最吸引人的应用之一就是可以用来开发活的细菌疫苗。在细菌细胞表面展示抗原被认为是有利的，因为暴露在表面的抗原更有利于免疫系统的识别，而且，外膜上的脂多糖可以增强免疫反应，还可能作为锚定在细胞表面多肽的辅助因子发挥作用(Lee J.S.，Shin K.S.，Pan J.G.，and Kim C.J.2000.Surface-displayed viral antigens on Salmonella carrier vaccine.Nat.Biotechnol.)。另外，细菌还有容易操作、制造和流通成本低的优点。这种方法产生新的重组疫苗目前已经有成功的报道(Kim EJ；Yoo SK.1999.Cellsurface display of hepatitis B virus surface antigen by using Pseudomonassyringae ice nucleation protein.Lett Appl Microbiol ；Lee J.S.，ShinK.S.，Pan J.G.，and Kim C.J.2000.Nat.Biotechnol.)。细菌表面展示系统另外的应用包括生产用于生物除污的全细胞吸附剂和新的生物催化剂(Kim YS；Jung HC；Pan JG.2000.Bacterial cell surface display of an enzymelibrary for selective screening of improved cellulase variants.Appl EnvironMicrobiol.；Jung HC；Lebeault JM；Pan JG.1998.Surface displayof Zymomonas mobilis levansucrase by using the ice-nucleation protein ofPseudomonas syringae.Nat Biotechnol.16576-80)。
普遍应用的Lpp-OmpA表面展示系统包括三部分信号序列和成熟的大肠埃希氏菌脂蛋白N端开始的9个氨基酸(Lpp)，大肠埃希氏菌外膜蛋白OmpA的46-159位氨基酸，和过客(passenger)蛋白(Francisco JA，Earhart CF，Georgiou G.1992.Transport and anchoring of beta-lactamase to the extemalsurface of Escherichia coli.Proc Natl Acad Sci U S A.7)。这个系统已经成功的用于展示β-内酰氨酶(Francisco JA，Earhart CF，Georgiou G.1992.Proc Natl Acad Sci U S A.7)，绿色荧光蛋白(Shi，Huidong；Su，Wei Wen.2001.Display of green fluorescent protein on Escherichia coli cellsurface.Enzyme and Microbial Technology.2825-34)，单链Fv(scFv)库(Daugherty PS；Chen G；Olsen MJ；Iverson BL，Georgiou G.1998.Antibodyaffinity maturation using bacterial surface display.Protein Eng.11825-32；Daugherty PS，Olsen MJ，Iverson BL，Georgiou G.1999.Development of anoptimized expression system for the screening of antibody libraries displayed onthe Escherichia coli surface.Protein Eng.12613-21)，和最近的HIV反转录酶(Bumett MS，Wang N，Hofmann M，Kitto GB.2001.Potential live vaccines forHIV.Vaccine.)。然而，这个系统仍然有其局限性(1)当Lpp-OmpA处于一个组成性表达的条件下，细胞的存活力非常低；因而必须使用一个严谨的调控系统和一个合适的低拷贝质粒来优化展示系统，尤其是对于大的过客蛋白(Daugherty PS，Olsen MJ，Iverson BL，Georgiou G.1999.Development of an optimized expression system for the screening of antibodylibraries displayed on the Escherichia coli surface.Protein Eng.12613-21；Earhart C.F.2000.Use of an Lpp-OmpA fusion vehicle for bacterial surfacedisplay.Methods Enzymol.)。(2)这个系统不能展示象细菌的碱性磷酸酶(PhoA)一样的二聚蛋白(Stathopoulos C，Georgiou G，Earhart CF.1996.Characterization of Escherichia coli expressing an Lpp′OmpA(46-159)-PhoAfusion protein localized in the outer membrane.Appl Microbiol Biotechnol.)。PhoA的功能需要二硫键的形成，其形成不能自发而是需要至少在二硫键形成中的催化作用(Bardwell JC，McGovern K，Beckwith J.1991.Identification of a protein required for disulfide bond formation in vivo.Cell ；Kamitani S，Akiyama Y，Ito K.1992.Identification andcharacterization of an Escherichia coli gene required for the formation ofcorrectly folded alkaline phosphatase，a periplasmic enzyme.EMBO J 1157-62).
很多活性蛋白和酶都是多亚基结构，并且很多都需要通过二硫键进行分子间和分子内的相互作用。二硫键的形成和在壁膜间隙的过客蛋白的折叠会阻碍这些蛋白的有效展示。因而，在培养基中加入还原剂有助于提高CtxB域和PhoA的转运效率(Klauser T，Pohlner J，Meyer TF.1990.Extracellular transport of cholera toxin B subunit using Neisseria IgA proteasebeta-domainconformation-dependent outer membrane translocation.EMBO J.；Stathopoulos et al.，1996；Suzuki T，Lett MC，Sasakawa C.1995.Extracellular transport
of VirG protein in Shigella.J Biol Chem.80)。然而，生长培养基中加入还原剂，还会打断分子间和分子内相互作用所需的二硫键。这会影响到一些酶或蛋白质的活性和/或展示，也可能还会改变细菌的生长和基因的表达，尤其是在大规模的应用中，还可能会提高操作的成本，细胞表面展示技术的相关参考文献包括美国专利5,348,867，美国专利5,516,637，美国专利5,866,344，美国专利6,274,345，美国专利6,300,065和美国专利6,190,662。
发明概要该项发明的一个方面是提供了包含编码以下任一种多肽的核酸序列的核酸分子(a)SEQ ID No2；(b)包含从SEQ ID No2的N端开始的至少39个连续氨基酸的片段；和(c)(a)或(b)的变体，其满足(i)与(a)或(b)相应的多肽的氨基酸序列至少65％相同；和(ii)当该变体在革兰氏阴性菌中制备时，它是一种外膜蛋白。
包含SEQ ID No2N端的至少39个连续氨基酸的片段可至少包括了SEQ ID No2的N端区域。该发明的实施方案包括了SEQ ID No2的N端区至少125，134，172，183，207个氨基酸的片段。
该项发明的另一个方面是提供了包含编码以下任一种多肽的核酸序列的核酸分子(a)SEQ ID No4；(b)包含从SEQ ID No4的N端开始的至少16个连续氨基酸的片段，和(c)a)或(b)的变体，其满足(i)与(a)或(b)相应的多肽的氨基酸序列至少65％相同；和(ii)当该变体满足如下条件时，它是一种外膜蛋白(1)在读框内与细菌的分泌信号和引导信号连接，(2)产生于革兰氏阴性菌。
包含SEQ ID No4的N端的至少16个连续氨基酸的片段可至少包括了SEQ ID No2的N端区域。该发明的实施方案包含了SEQ ID No2N端区的至少102，111，149，160，184个氨基酸的片段。
该项发明的另一个方面是其提供了一种编码一融合蛋白的核酸序列，上述的融合蛋白包括第一多肽和第二多肽，所述第一多肽由该项发明的核酸分子编码。在该发明的一个实施方案中，第二多肽被融合到第一多肽的C端。
该项发明的另一个方面是提供了一个包含SEQ ID No1中的6至309核苷酸的土壤杆菌属启动子。
本项发明的另一个方面是提供了一个分离出的5-100个核苷酸的探针或10-40个核苷酸的引物，其可与SEQ ID No1或3的核酸分子，或与该核酸分子的互补序列在严谨条件下杂交的。
该项发明的另一个方面是其提供了一个表达载体，其包括本项发明中的核酸分子，它与一个或多个表达调控序列可操作地连接。在该发明的一个实施方案中，表达调控序列含有aopB启动子；另一个实施方案中，载体是大肠杆菌中的表达载体，其表达调控序列适合于在大肠杆菌中表达核酸。另一个实施方案中，载体是土壤杆菌属中的表达载体，它适合在土壤杆菌属中表达核酸分子，尤其是在根癌土壤杆菌中。
该项发明的另一个方面提供了一个由本发明的核酸分子或表达载体转化了的重组微生物。在该发明的一个实施方案中，重组体微生物在其表面展示了本发明的多肽或融合蛋白。
该项发明的另一个方面是提供了包括以下任一种氨基酸序列的多肽，(a)SEQ ID No2；(b)包含从SEQ ID No2的N端开始的至少39个连续氨基酸的片段；和(c)(a)或(b)的变体，其满足(i)与(a)或(b)相应的多肽的氨基酸序列至少65％相同；和(ii)如果这个变体制备于革兰氏阴性细菌，那么它是一种外膜蛋白。
该项发明的另一个方面是提供了包括以下任一种氨基酸序列的多肽(a)SEQ ID No4；(b)包含从SEQ ID No4的N端开始的至少16个连续氨基酸的片段，和(c)a)或(b)的变体，其满足(i)与(a)或(b)相应的多肽的氨基酸序列至少65％相同；和(ii)当该变体满足如下条件时，它是一种外膜蛋白(1)与细菌的分泌信号和引导信号在读框内连接，并且(2)产生于革兰氏阴性菌。
该项发明的另一个方面是提供了生产本发明的多肽和融合蛋白的方法，该方法包括培养经表达载体转化了的微生物，所述表达载体含有编码本发明的多肽或融合蛋白的核酸分子，其中，该核酸分子与一个或多个表达调控序列可操作地连接。
本项发明的另一个方面是提供了能与本发明的多肽或融合蛋白中的载体蛋白特异性反应的抗体。在该发明的一个实施方案中，抗体为单克隆抗体。
本项发明的另一个方面提供了一个生产能够在其表面展示过客蛋白的微生物的方法，该方法包括以下步骤(1)将表达载体导入到微生物中；和(2)培养从步骤(1)中得到的微生物，以表达蛋白。
该展示方法中的表达载体包含(a)编码载体蛋白的核酸，载体蛋白可从本发明的多肽，特别是与AopB相关的蛋白以及AopB相关的外膜蛋白家族成员中选择；载体蛋白需要适合用于微生物的展示，并带有在微生物中有功能的细菌分泌信号。
(b)编码过客蛋白的核酸，该核酸要与编码载体蛋白的核酸在3′端框内连接。
(c)编码载体蛋白的核酸要与表达调控序列相连而起作用，该表达调控序列要适合在该微生物中表达编码该载体蛋白的核酸。
该发明的一个实施方案中，表达调控序列含有aopB启动子。在另一个实施方案中，在展示方法中所用的微生物在酸性条件下培养。
在另一实施方案中，载体蛋白和展示方法中所用的微生物是在以下的组中进行选择(a)载体蛋白是与AopB相关的多肽、片段或其变体，并且，可用于展示的微生物是土壤杆菌属，(b)载体蛋白包含RopB多肽序列N端的150-220个连续的氨基酸，并且可用于其展示的微生物是根瘤菌属(Rhizobium)，(c)载体蛋白包含布鲁氏菌属(Brucella)外膜蛋白序列N端的150-220个连续的氨基酸，并且可用于其展示的微生物是布鲁氏菌属。
(d)载体蛋白包含Pap31多肽序列N端的150-220个连续的氨基酸，并且可用于其展示的微生物是巴尔通氏体属(Bartonella)，(e)载体蛋白包含PomA多肽序列N端的150-220个连续的氨基酸，并且可用于其展示的微生物是巴斯德氏菌属(Pasteurella)(Mannheimia)，(f)载体蛋白包含PPE多肽序列N端的150-220个连续的氨基酸，并且可用于其展示的微生物是分枝杆菌属(Mycobacterium)，(g)载体蛋白包含主要外膜蛋白序列N端150-220个连续的氨基酸，可用于其展示的微生物是嗜血菌属(Haemophilus)，或(h)载体蛋白包含外膜孔多肽序列N端150-220个连续的氨基酸，可用于其展示的微生物是弧菌属(Vibrio)。
在该发明的优选实施方案中，分泌信号和载体蛋白一起发挥作用，展示了包含SEQ ID No2中1-23氨基酸的过客蛋白，在进一步的优选实施方案中，所述微生物为根癌土壤杆菌。
该发明的展示方法进一步包含检测所培养微生物表面是否带有过客蛋白和选择在表面带有过客蛋白的微生物。在一个实施方案中，该分析方法采用了荧光激活细胞分选术(FACS)。
本项发明的另一个方面提供了在土壤杆菌属表面表达融合蛋白的方法，具体步骤包括(1)将载体导入土壤杆菌属的细菌中；并且(2)培养由第一步得到的细菌，以表达融合蛋白；其所用载体包括(a)编码该发明的融合蛋白的核酸序列，其中的融合蛋白带有细菌的分泌信号；和(b)与编码融合蛋白的核酸可操作连接的表达调控序列，其中，该表达调控序列是适合在土壤杆菌属中表达所述编码融合蛋白的核酸。
本项发明的另一个方面是提供一个能够选择编码所需性质多肽的核酸的方法，该方法包含本发明的展示方法，其中的过客蛋白是多种的、已推断含有所需特性的多肽。这种方法进一步含有检测展示过客蛋白的微生物是否展示着过客蛋白的所需特性；选择和分离在其表面上展示着所需特性过客蛋白的微生物；以及从生物中分离表达载体的步骤。
在选择编码具有所需性质的多肽的核酸的方法的一个实施方案中，过客蛋白是来自于抗体表达库。欲求特性可以是与抗体特异的抗原的紧密结合、特异的抗原决定基的存在、或者是催化活性。
本发明的另一方面是提供一个从液体中去除污染物的方法，该方法包含该发明的展示方法，其中的过客蛋白能够与污染物结合，而且这种方法进一步包括用展示过客蛋白的微生物与含有污染物的液体在一定条件下接触一段时间，所述条件有利于过客蛋白与污染物结合；然后将微生物从液体中去除的步骤。在其中的一个实施方案中，污染物是重金属，而过客蛋白是金属硫蛋白。
本发明的另一方面是提供一个可激发哺乳动物免疫反应的方法，这种方法包括该发明的展示方法，其中的过客蛋白可以激发哺乳动物的免疫反应。这种方法进一步包含在有利于哺乳动物对过客蛋白产生免疫反应的时间和条件下给药展示着过客蛋白的微生物的步骤。在一个实施方案中，展示微生物是根癌土壤杆菌，它可用来当作活的疫苗。
本发明的另一个方面提供一个固相酶促反应的方法，这个方法包括该发明的展示方法，其中的过客蛋白可以用来催化反应，该方法进一步包括使欲催化的反应底物在有利于酶促反应的时间和条件下，与展示着过客蛋白的微生物接触一段时间的步骤。在一个实施方案中，所述过客蛋白是碱性磷酸酶。
本发明的另一个方面是提供一个提纯化合物的方法，该方法包含该发明的展示方法，其中的过客蛋白能够特异性地与该化合物结合，该方法进一步包括使含有该化合物的组合物与展示着过客蛋白的微生物接触，让接触时间和条件利于过客蛋白与化合物结合；在利于去除非特异性结合的污染物的条件下和时间内，洗所述微生物；以及在利于打断过客蛋白和化合物之间特异性结合的条件下和时间内，从所述微生物洗脱得到所要提纯的化合物。在一个实施方案中，所述化合物是抗体，所述过客蛋白是其特异性的抗原。
以下对附图的描述有利于更深入的理解这项发明。
图1指示的是aopB位点的序列和其相关的构建体。
A.1.4kb的NheI片段的DNA序列包含了aopB和所推导出的AopB氨基酸序列。垂直的箭头指示的是mini-Tn5转座子的插入位点。被下画线标记的氨基酸是推测的信号肽。粗体显示的是推测的核糖体结合部位SD序列(AGGAG)。水平箭头指示的重复序列，其功能可能是不依赖于ρ因的转录终止子。
B.不同构建体的遗传和物理图谱。垂直线上方的数字指示的是DNA序列的位置；圆括号中的数字指示的是在AopB中氨基酸的位置。套着方框的水平箭头指示的是aopB的开放读框；黑色区域指示的是推测的信号肽。◆指示的是mini-Tn5转座子的插入位点。垂直的箭头指示的是活性phoA-aopB融合体上TnphoA转座子的插入位点。带有垂直线的水平箭头指示的是引入了限制性位点的PCR引物。
图2示意的是aopB和ropB基因产物的氨基酸序列对比。这个对比是通过DNASIS程序完成的。阴影字母代表的是两个基因产物中相同的氨基酸。
图3示意的是aopB基因的Southern杂交分析。根癌土壤杆菌菌株全DNA的获得与实施例1中提到的方法一样，根癌土壤杆菌不同菌株的全DNA与泳道的对应分别是GMI9023(泳道1)，A136(泳道2)，A6(泳道3)，C58(泳道4)和CGI1(泳道5)，苜蓿中华根瘤菌(Rhizobium meliloti)RCR2011全DNA对应于泳道6。DNA用SphI消化，并用荧光素标记的aopB探针进行杂交。
图4指示的是AopB蛋白在根癌土壤杆菌中的亚细胞定位。诱导的根癌土壤杆菌菌株C58细胞(泳道1，3，5，7，9，11)和CGI1细胞(泳道2，4，6，8，10，12)按照实施例1中介绍的进行收集和分级分离为全细胞裂解物(CL)(泳道1和2)，周质(P)(泳道3和4)，胞质(C)(泳道5和6)，全膜(TM)(泳道7和8)，内膜(IM)(泳道9和10)和外膜(OM)(泳道11和12)级分。然后将来自同一制品的样品进行SDS/12％PAGE凝胶电泳分离，之后将蛋白转移到Immobilon-P膜上通过AopB抗体使其可见。
图5示意的是对细菌表面的AopB进行的检测。根癌土壤杆菌A6010菌株按照实施例1描述的培养。得到的细胞直接用于与以下不同抗体的相互作用兔多克隆AopB抗体，小鼠多克隆VirJ抗体或小鼠单克隆GFP抗体。全细胞的ELISA检测按照实施例1描述的进行，误差棒指示的是三次重复的标准差。
图6示意的是用全细胞ELISA检测AopB-GFP(A)和AopB-PhoA融合蛋白(B)在细胞表面展示的结果。按照实施例1中描述的方法对根癌土壤杆菌菌株C58(GFP-)，CG19(产生胞质GFP)，CGI1(染色体上含有aopB-gfp)，C58(pJYH21)(质粒上含有aopB-gfp)进行培养、固定；并且用全细胞ELISA检测AopB-GFP在细胞表面的展示(A)。质粒pJYH5039，pJYH5125，pJYH5134，pJYH5172和pJYH5207含有aopB-phoA融合体，其PhoA分别融合在AopB的39，125，134，172和207位氨基酸位点上。pJYH5包含野生型的aopB基因，而pJYH23含有由展示载体携带的phoA编码序列。这些质粒都被引入到C58菌株；含有这些质粒的C58细胞再被用来用PhoA抗体进行全细胞ELISA的方法检测AopB-PhoA的展示(B)。误差棒指示三次重复的标准差。
图7示意的是通过流式细胞仪分析评估AopB-PhoA在细胞表面展示的结果。含有pJYH5，pJYH5039，pJYH5125，pJYH5134，pJYH5172和pJYH5207的根癌土壤杆菌C58细胞按照实施例1中描述的在IB培养基上培养。小鼠抗-AP抗体按1∶1000加入，羊抗小鼠r-PE偶联物按照1∶100使用。总样本数为10,000。GMean代表几何平均值，几何平均值则是所记录细胞的平均荧光强度。
图8示意的是蛋白酶的可接近性(accessibility)分析的结果。包含pJYH5039，pJYH5125，pJYH5134，pJYH5172和pJYH5207的根癌土壤杆菌菌株C58，CGI1，和C58在IB培养基上培养。冲洗后，按照实施例1的方法在有和没有胰蛋白酶的情况下对细胞进行分别的处理。用抗-AopB抗体使AopB-GFP和AopB-PhoA融合蛋白可见，并且周质蛋白ChvE用抗-ChvE抗体使其可见。
图9示意的是展示载体pJYH20的物理图谱。这个质粒包含aopB启动子和编码AopB由1到172位氨基酸的aopB的1到516bp。多接头被引入到aopB的下游，以便于在aopB的开放读框内克隆和融合编码过客蛋白的外源基因。
图10示意的是AopB-PhoA在不同条件下表达情况的检测结果。根癌土壤杆菌菌株C58(pJYH23)，大肠埃希氏菌DH5α(pJYH23)和苜蓿中华根瘤菌RCR2011(pJYH23)在指定的培养基上培养。收集细菌细胞，并且通过抗-AP抗体使AopB172-PhoA可见。
图11示意的是生长培养基对细菌表面展示的影响。包含质粒pJYH5或pJYH23的根癌土壤杆菌菌株C58细胞置于MG/L培养基，在28℃过夜培养，然后在OD600＝0.3时可以转移到新鲜的AB或IB培养基，然后28℃培养18小时。展示效率通过全细胞ELISA确定。C58(pJYH5)作为阴性对照。实验重复三次。
图12示意的是流式细胞仪分析得到的AopB-PhoA展示结果。带有pJYH5或pJYH23的根癌土壤杆菌在MG/L，AB或IB培养基上培养。小鼠的抗-AP抗体按1∶1000加入，羊抗小鼠r-PE偶联物按1∶100使用。全样本为10,000，GMean代表几何平均值，几何平均值则是记录细胞的平均荧光强度。
发明详述A.AOPB基因和AOPB蛋白根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)染色体基因aopB已经被鉴定。这段基因与豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)中编码外膜蛋白的ropB基因有高度同源。通过转座子插入造成的aopB突变并不会影响细菌在不同培养基上的生长。
在pH 5.5的基本培养基上培养的CGI1突变细胞(包含aopB-gfp融合体)在紫外照射下显现强烈的荧光，而在中性的基本培养基上培养的细胞却没有荧光，这表明aopB基因可被酸性环境诱导。aopB编码一条长218个氨基酸的推测蛋白，其预计分子重量为22.8 kDa。TnphoA转座子插入突变，亚细胞分级分离和全细胞ELISA实验均表明AopB是一个暴露在细菌细胞表面的外膜蛋白，并且非常严谨，不会在其他部位出现。
以下是所举序列的描述SEQ ID No1包含aopB基因的核苷酸序列SEQ ID No2AopB的全长氨基酸序列SEQ ID No3编码AopB的aopB核苷酸序列，但缺少推定的信号序列SEQ ID No4 AopB的氨基酸序列，但缺少推定的信号肽序列SEQ ID No5引物p54SEQ ID No6引物p55SEQ ID No7引物p119SEQ ID No8引物p112SEQ ID No9引物p118SEQ ID No10GFPuvFh3SEQ ID No11GFPuvRp1SEQ ID No12PhoAfH3SEQ ID No13PhoAreP1AopB已经被确定为革兰氏阴性菌膜蛋白家族(此后称为AopB相关膜蛋白)中的一员。这个蛋白族中包括RopB(60％氨基酸序列相似性)，布鲁氏菌膜外的免疫原性蛋白(42-47％氨基酸序列相似性)，汉氏巴尔通氏体(Bartonella hensela)经噬菌体侵染产生的Pap31(46％氨基酸序列相似性)，溶血巴斯德氏菌(Pasteurella(Mannheimia)haemolytica)外膜蛋白PomA(47％氨基酸序列相似性)，结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的PPE(39％氨基酸序列相似性)，杜氏嗜血菌(Haemophilus ducreyi)的主要外膜蛋白(43％氨基酸序列相似性)，和霍乱弧菌(Vibrio cholerae)的外膜孔蛋白(40％氨基酸序列相似性)，还有假单胞菌(Pseudomonas)的孔蛋白F(OprF)的C端部分。
转录和翻译的调控序列可以是DNA的调控序列，如启动子、增强子、多腺苷酸信号、终止子、和可以为编码序列在寄主细胞提供表达的序列。
“启动子序列”是DNA分子上的一段调控序列，能够和细胞中的RNA聚合酶结合沿下游(3′方向)启动转录编码序列。为了阐明该发明，启动子序列可以在转录起始位点的3′端结合，并向上游(5′方向)延伸使其包括能够起始转录的最少的碱基或者元件数目。在启动子序列内有一个转录起始位点(通常通过核酸酶S1作图而确定的)，还有可以用于结合RNA聚合酶的蛋白结合区域(共有序列)。原核生物启动子除了含有-10和-35共有序列外还包括SD序列。
表达调控序列是一段操纵和控制另一段DNA序列的转录和翻译的DNA序列。编码序列则“受控于”转录和翻译调控序列，它在细胞内可被RNA聚合酶转录成mRNA，然后mRNA被翻译成蛋白质。
“分离的多核苷酸”被定义为是从其发生的环境中被去除而得的多核苷酸。分离的多核苷酸是结构上不同于自然产生的多核苷酸。这个词因此包括例如(a)一段DNA，其序列包括自然产生的基因组分子的部分序列，但是不包含该序列两侧的编码序列；(b)一段被整合到载体或原核或真核基因组中的多核苷酸，但所产生的分子与所有自然条件下发生的载体或基因组DNA分子都不一样；(c)一个分离的分子，例如cDNA，基因组片段，PCR产物片段或限制性酶切的片段；和(d)杂合基因的一部分的重组核苷酸序列，也就是编码融合蛋白的基因。特别指出要排除在这个定义之外的是处于在含有以下的混合物中的多核苷酸(i)DNA分子、(ii)被转染的细胞、和(iii)细胞克隆，例如是出现在DNA文库，如cDNA或基因组DNA文库中的那些细胞克隆。
例如，一个DNA分子天然存在于细菌基因组或作为基因文库的一部分时并不是分离而得的，但是如果该分子分离于细菌基因组中剩下的部分是由于比如说发生了克隆事件(扩增)而得，那么它就是分离的分子了。通常，分离的DNA分子不受DNA区域(例如，编码区域)的限制，在自然发生的基因组中，它会紧邻5′或3′端。这样的分离的多核苷酸可以是载体或组合物或外源基因组的一部分，但仍然可以定义为分离的分子，因为它们并不是在自然情况下的一部分。
本项发明的多核苷酸可以是RNA或DNA(cDNA，基因组DNA，或合成的DNA)，或其修饰物，变体、同系物或片段。其DNA可以是单链或双链，并且，如果是单链可以是编码链，也可以是非编码链(反义链)。任何一个象SEQ ID NO1或3所编码的本发明的多肽序列可以是(a)编码序列，(b)由(a)所转录的核糖核苷酸序列，或(c)用冗余或简并的遗传密码子编码相同多肽的编码序列。
多肽或蛋白指的是不管长度或翻译后是否修饰(例如，糖基化或磷酸化)的任一氨基酸链，两个词在本申请中可以互换。
氨基酸序列可来源于SEQ ID NO2或4的同源的序列。象这里所用的“同源的氨基酸序列”是指在低于严格的熔解温度(Tm)25-35℃下，其编码序列可与SEQ ID NO1或3的任一部分核苷酸序列进行杂交。其中同源的氨基酸序列是指与SEQ ID NO2或4中的氨基酸序列不同的氨基酸序列有一个或多个氨基酸的取代，优选是保守取代。这样的序列也包含血清型变体(定义见下文)以及包含了缺失或插入，但仍保留所述多肽的原有遗传特性如免疫活性的序列。优选，这样的序列要与SEQ ID NO2或4至少61％相同(例如，65％，68％，70％，73％，75％，78％相同)，优选至少80％相同(例如，82％，85％，88％，90％，93％，95％，98％相同)。
同源的氨基酸序列包括与SEQ ID NO2或4序列相同或者实质相同的序列。所谓“实质相同的氨基酸序列”是指至少有90％(例如92％，94％，95％，96％，97％，98％)并优选有99％与参考序列相同的氨基酸序列。在一个实施方案中，同源序列可不同于参考序列，但这些变化多数是保守的氨基酸取代。
保守氨基酸的取代就是发生在同一类氨基酸中的取代。这些氨基酸类别包括，例如，极性不带电荷的氨基酸，如天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸；碱性氨基酸如赖氨酸、精氨酸和组氨酸；酸性氨基酸如天冬氨酸和谷氨酸；和非极性氨基酸如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸和半胱氨酸。
同源多聚核苷酸的定义与此类似。优选同源序列是与SEQ ID No1或3的编码序列至少有45％(例如50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，87％，90％，93％，96％)和优选有99％相同的序列。
同源性通常由如Sequence Analysis Software Package of the GeneticsComputer Group的序列分析软件(University of Wisconsin BiotechnologyCenter，1710 University Avenue，Madison，WI 53705)来测定。氨基酸序列按最大一致性排列。间隙可以人为地在序列中加以引入以达到合适的排列。一旦最佳的排列建立后，就可以通过比较两个序列在各个位置的氨基酸相对于所有位点的同一性来确定其同源性的水平。
这里所用的两个氨基酸或核苷酸序列间的“百分比同源性”、“百分比同一性”或“百分比相似性”都是通过按照最高匹配原则排列而确定的。“同一性”或“相似性”实质上是通过巧妙的衡量方式并且可以通过现有的技术计算出来。这里用来比对两个氨基酸或核苷酸序列同一性或相似性的计算机软件是DNAStar(DNAStar Inc.，Madison，Wis.)。然而，其他的一些软件如GCG程序包(Devereux，J.，et al.，Nucleic Acids Research()387)和BLASTP，BLASTN，FASTA(Atschul，S.F.et al.，J MolecBiol()也可以用。这里确定的同源性(同一性或相似性)则是按照大家都知道的BESTFIT程序(Wisconsin Sequence Analysis Package，Version 8 for Unix，Genetics Computer Group.University Research Park，575Science Drive，Madison，Wis.53711)而确定的。当使用BESTFIT或其他的序列排列软件来确定某一特定序列是否有例如与参考序列间大约90％的同源性时，根据当前的发明，参数应该设定保证同一性百分数是在参考核苷酸序列或氨基酸序列的全长的基础上计算的，而且允许同源区中的间隙可达到约参考序列总核苷酸数的10％。
两个多肽的百分相似性也可以通过使用包括BESTFIT在内的本领域已知的软件比对两个多肽链的氨基酸序列进行评测，通过使用鉴定相似性的默认参数设置。
Karlin和Altschul的运算法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8，1990)，经由Karlin和Altschul修饰后(Proc.Natl.Acad.Sci.USA7，1993)，已被吸收到Altschul等的NBLAST和XBLAST中(J.Mol.Biol.，1990)，而用于搜索与参考序列同源的序列。
BLAST核苷酸序列搜索使用的是NBLAST程序，score＝100，wordlength＝12，以得到与本发明同源的序列。BLAST蛋白搜索使用的是XBLAST程序，score＝50，wordlength＝3，以得到与参考多肽(例如SEQ IDNO2或4)有同源性的氨基酸序列。要得到用于比对的带有间隙的排列，需要按照Altschul等(Nucleic Acids Res.，1997)介绍的GappedBLAST进行。当使用BLAST和Gapped BLAST程序时，使用了各自程序(例如XBLAST和NBLAST)的默认参数设置。参考http//www.ncbi.nlm.nih.gov。
与SEQ ID NO2或4同源的多肽链包括自然发生的等位基因变体，以及保留了参考多肽遗传特性的突变体或非自然发生的变体。对AopB而言，这样的遗传特性包括了其作为革兰氏阴性菌暴露在表面的外膜蛋白的拓扑结构。
正如我们所知道的，等位基因的变体是一种多肽的替换形式，其特征可以是因为发生了取代、缺失、或者一或几个氨基酸的添加，但却并不改变多肽的生物学功能。生物学功能是指多肽在自然状态下的细胞中所发挥的作用，即使这个功能对细胞的生长和存活并不必要。例如，孔蛋白的生物学功能就是允许胞外介质中存在的化合物进入细胞内。
等位基因的变体在自然界非常普遍。例如，一个细菌种如M.catarrhalis，通常由多种不同的菌株来代表，它们之间有着微小的等位基因的变异。事实上，一个在不同菌株间行使相同生物学功能的多肽在每一菌株中可以有不同的氨基酸序列(和核苷酸序列)，这种等位基因的变异在多核苷酸水平也得到了很好的体现。
一个获得编码同源多肽或等位基因变体的多聚核苷酸的方法是通过聚合酶链式反应(PCR)扩增由常规的方法提取的细菌基因组DNA。这涉及到与编码序列5′和3′端的上、下游配对的合成的寡核苷酸引物的使用。适宜的引物是通过SEQ ID NO1或3提供的核苷酸序列信息设计的。步骤如下选择包含10到40个核苷酸(如13，16，19，22，24等等)，更优选包含15-25个核苷酸的引物。选择含有足以保证有效杂交的C G比例的引物是有利的；也就是说，C和G的量至少占总核苷酸含量的40％，优选占50％。一个标准的PCR反应通常每100μL包含0.5到5个单位的Taq DNA聚合酶，20到200μM的每种脱氧核苷酸，优选每种核苷酸具有相同的浓度，超过总脱氧核苷酸浓度0.5到2.5mM的镁，105到106靶标分子，和大约20pmol的每种引物。进行大约25到50个PCR循环，低于引物实际Tm 15℃到5℃的退火温度。更加严谨的退火温度将有助于消除不正确的退火引物和减少不正确的核苷酸结合到引物的3′端。尽管更高的温度适合于对G+C丰富的靶标变性，通常变性温度是95℃到97℃。循环的数量依赖于初始加入的靶标分子的浓度，尽管超过40个循环不加推荐，这是由于循环次数过多会造成非特异性背景产物的增加。
另一个可用来得到编码同源多肽或等位基因变体的多核苷酸的方法是通过分子杂交的方法筛选DNA或RNA文库。杂交的步骤广为人知并被详细描述如Sambrook等(Sambrook，J.E.F.et.al.(1989)Molecular Cloning aLaboratory Manual 2nded.Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor N.Y)。优化杂交条件的重要参数可通过用于获得临界(critical)熔解温度的公式反映，大于该熔解湿度时，两条互补的DNA链可互相分开。对于大于或约等于600个核苷酸的多核苷酸，公式是Tm＝81.5+0.41×(％G+C)+16.6log(阳离子浓度)-0.63×(％甲酰胺)-600/碱基数。在适当的严谨条件下，杂交温度(Th)大约是低于计算的Tm的20到40℃，20到25℃，或优选30到40℃。在这方面本领域技术人员可容易地确定出最佳的温度和盐浓度。
这里所提出的杂交核酸可以用来例如作为克隆探针、引物或者是诊断探针。分子杂交通常是要在严谨的条件下进行。核酸双链体或杂交体的稳定性由熔解温度或Tm值来表达，即杂交链分开的温度。这个熔解温度用来确定杂交所需的严谨条件。如果要鉴定的序列与探针序列有相关性并且基本一致而并非完全一致时，那么先确定最低的杂交温度是非常有用的，这样在特定的盐(例如SSC OR SSPE)浓度环境中，在该确定的最低温度时只有同源序列杂交。然后，假设每有1％的错配就会导致Tm值下降1℃，杂交反应最后冲洗的温度也相应降低(例如，如果序列与探针有超过95％的一致性，最后的冲洗温度就降低5％)。实际上，每1％的错配所带来的Tm的变幅可以介于0.5℃和1.5℃之间。严谨的杂交条件可以通过预杂交和杂交孵育来获得(i)在含有50％甲酰胺的6×SSC中在42℃杂交4-16小时，或(ii)在6×SSC(1M NaCl，0.1M枸椽酸钠(pH 7.0))水溶液中在65℃杂交4-16h小时。通常，杂交实验要在60℃-68℃温度下进行，例如65℃。在这种温度条件下，可以在6×SSC，更好的是2×SSC或1×SSC，最好是在0.5×SSC，0.3×SSC或0.1×SSC(不含甲酰胺)中获得严谨的杂交条件。1×SSC包含0.15M NaCl和0.015M枸椽酸钠。
有用的同系物和其中的非自然片段由已知的方法来设计，它们可用来鉴定抗原上可容许氨基酸序列变化和(或)缺失的区域。比如，比较来自不同种的同源多肽就可以鉴定出保守序列。越是差异多的序列就越能容许序列的变化。序列间的同源性可以通过上述的方法进行分析，比如Altschul等的BLAST同源搜索运算法则(Nucleic Acids Res.；2(1997))。另外，序列可以在体外修饰，然后按照下文介绍的方法筛选能展示过客蛋白的序列。
本领域技术人员将很容易了解到采用这项发明中的筛选步骤并不需要做不必要的实验就可确定SEQ ID NO2或4的特定同系物或片段是否保持了AopB外膜蛋白的拓扑结构，并且，是否可做为载体蛋白展示过客蛋白。一般的分析过程包括以下步骤(i)将实验同系物或片段在读框内连接上一个报告蛋白(过客蛋白)如GFP。通常，编码过客蛋白和编码实验同系物或片段的核酸分子在读框内连接后就可产生融合蛋白。编码这个融合蛋白的核酸分子于是被插入到一个表达载体上，然后在细菌中通过步骤(ii)表达这个融合蛋白；(ii)用编码该融合蛋白的核酸分子转化革兰氏阴性菌，优选根癌土壤杆菌；并且(iii)使用适合的全细胞分析手段如FACS来分析报告蛋白在转化细菌中的活性。在细胞表面的报告蛋白的活性将显示所述同系物或片段是外膜蛋白，而且可作为一个用于展示的载体蛋白。
由此衍生的多肽包括SEQ ID NO2或4的部分序列，与SEQ ID NO2或4有同源性的多肽序列的部分序列，由全长多肽内部缺失而得的多肽和融合蛋白。
在一个实施方案中，AopB的片段来自SEQ ID No2的N-端区域。另一些实施方案中，来自SEQ ID No2的N-端的至少39个连续氨基酸的AopB片段是优选的，例如来自SEQ ID No2的N-端的125，134，172，183和207个连续氨基酸。将过客蛋白与SEQ ID No2的125，134，172，183和207个氨基酸的片段融合已得以例证，而且显示了其用于细胞表面展示的有效性。
尤其优选的是SEQ ID No.2 N-端的134到183个连续氨基酸片段，例如140，150，155，160，165，166，168，170，172，174，176，178，180个氨基酸的片段。
载体蛋白与过客蛋白的融合可让载体片段与过客蛋白氨基酸序列直接邻近而形成。另外还可以通过连接子序列连接载体片段和过客蛋白，如来自免疫球蛋白的灵活的连接子序列(参见美国专利5,516,637)。连接子可以含有蛋白酶特异的切割位点，以便于将过客蛋白从载体蛋白上可控制地释放下来。这样的蛋白酶切位点的例子包括对凝血因子Xa、肠激酶、胶原酶、Igase(来自淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae))、凝血酶和TEV(烟草蚀纹病毒)蛋白酶的切割特异的位点。
来自SEQ ID NO1或3的30到600个核苷酸的多聚核苷酸或其互补体、同系物、变体至少可以用来作为得到其他同系物或变体的探针。得到部分序列的一个方法是通过PCR扩增，扩增应用的参数上文提到，应用的引物与要扩增的片段的5′和3′端上游和下游序列配对。其扩增的模板可以是SEQ ID NO1或3的全长或它们相关的同系物或变体，或包含在多聚核苷酸混合物如DNA或RNA文库中的特定多聚核苷酸。另一种得到部分序列的方法是在如上文介绍的条件下，使用推算Tm的公式进行筛选杂交。30到600个核苷酸片段的获得，其Tm值要通过减法(600/多核苷酸碱基对数目)进行校正，并且严谨的杂交条件其杂交温度要低于Tm 5到10℃。要获得低于20-30个碱基寡核苷酸时，Tm的计算公式为Tm＝4×(G+C)+2(A+T)。例如，50％G+C的18个核苷酸的片段Tm约为54℃。
SEQ ID NO2或4中短的氨基酸片段或它们相应的同源序列，可以通过化学合成的办法得到(E.Gross and H.J.Meinhofer，4 The PeptidesAnalysis，Synthesis，Biology；Modern Techniques of Peptide Synthesis，John Wiley &Sons(1981)，and M.Bodanzki，Principles of Peptide Synthesis，Springer-Verlag(1984))。
编码含有较大内部缺失的多肽片段的多核苷酸可以按照标准的方法构建(Sambrook，J.E.F.et.al.(1989)Molecular Cloning a Laboratory Manual 2nded.Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor N.Y.)。这个方法包括标准的PCR、反向PCR、和对DNA克隆分子的限制性内切酶处理。这些方法中所用的成分和使用的仪器可以从很多公司购买如Stratagene。
某些氨基酸可以取代蛋白上其他的氨基酸而不改变蛋白的活性区域比如结合位点。既然活性区域决定一个蛋白的生物学功能，那么就可以通过某些氨基酸的取代来获得相似生物学功能的蛋白。所以可以预期，可以改变AopB的多肽序列或其编码的DNA序列而不改变其生物学功能和活性。
在进行这种改变的时候，通常要考虑到氨基酸的亲水指数(hydropathicindex)。氨基酸的亲水指数对蛋白的生物学功能有非常重要的意义，这一点本领域已有共识(Kyte，J.，and Doolittle，R.F.(1982)Simple method fordisplaying the hydropathy character of a protein.J Mol Biol )。相关的亲水氨基酸构成蛋白的二级结构，因而决定了蛋白与其他分子的相互作用，例如与酶、底物、受体、DNA、抗体、抗原等等的相互作用。膜的拓扑结构可以通过Sipos和von Heijne(Sipos et al.，1993，Eur.J.Biochem0)描述的算法进行预测。
根据其亲水性和所带电荷对每一种氨基酸都进行了亲水指数的赋值(kyte和Dodittle，1982)。分别是异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5).
已经知道某些氨基酸可以被另外的具有与其相似亲水指数的氨基酸取代而不改变蛋白的生物学活性，也就是说，得到功能相同的蛋白。要进行这种改变，取代氨基酸的亲水指数应该在被取代氨基酸亲水指数的.+-.2范围内，当然如果能控制在.+-.1甚至.+-.0.5就更好了。
同时可以根据美国专利4,554,101提供的氨基酸的亲水性更有效的进行氨基酸的取代，其指出了与蛋白生物特性相关的由相邻氨基酸的亲水性决定的蛋白的局部最大平均亲水性。
根据美国专利4,554,101的详细介绍，指定的氨基酸亲水值分别是精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0.+-.1)；谷氨酸(+3.0.+-.1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5.+-.1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。
已经知道一个氨基酸可以被另外一个与之有相似亲水值的氨基酸取代，从而得到保持原有生物学特性，并且尤其是免疫学特性的蛋白。要做这样的改变，取代氨基酸的亲水值应该在被取代氨基酸亲水值的.+-.2范围内，当然如果能控制在.+-.1甚至.+-.0.5就更好了。
正如上文所述，氨基酸的取代通常要考虑到相关相似性的侧链取代，比如其疏水性、亲水性、电荷、大小等等，本领域技术人员一定知道考虑了前述各种情况的取代的实例包括精氨酸和赖氨酸；天冬氨酸和谷氨酸，丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸的取代。
如这里所使用的，融合蛋白是包含本发明中多肽或由本发明中多肽得到的多肽与任何其他多肽(这里后面称为过客蛋白或多肽)在N或C端的融合。得到这种融合多肽的一个最简单的方法是翻译读框内连接的多聚核苷酸，即杂合基因。编码融合蛋白的杂合基因被插入到一个表达载体上，用于转化或转染寄主细胞。另外，编码多肽或多肽衍生物的多核苷酸序列也可以插入到其中已存在编码过客蛋白多肽的多核苷酸的表达载体中。大的蛋白可以有效的用于表面表达，所述蛋白包括β-内酰胺酶，碱性磷酸酶，纤维素酶的纤维素结合域，或者单链Fv抗体。
融合蛋白的有利事例如其一可以将本发明的多肽或同系物或片段(‘载体蛋白′)融合到一个具有酶活性的蛋白上，如碱性磷酸酶，或一个可以进行二级修饰的酶上(例如糖基化酶或二硫化物异构酶)。另外还可以将载体蛋白融合到一个可以结合化合物的过客多肽上，所述化合物如污染物(例如溶液中的重金属或血液中的滤过型污染物)或者其他的蛋白(例如抗体)。如果过客蛋白本身就是一个抗体，那么融合蛋白可以用来纯化该抗体特异的抗原，或用来去除溶液中某种特定抗原。如果过客蛋白是一个抗原蛋白，融合蛋白可以用来作为一个疫苗来激发免疫反应来抵抗这个抗原。
为了有效的融合，过客多肽可以融合到本发明多肽的N-或者更好是C端。优选的氨基酸插入位点是SEQ ID No2第39，125，134，172，183和207位的氨基酸，最好是插入到172位氨基酸上游或下游10个氨基酸的位置。
本发明中的多聚核苷酸同时也可以编码杂合的多肽前体(precursorpolypeptides)，其包括来自异源的信号肽，成熟以后成为本发明中的多肽。“异源的信号肽”是指在自然发生的本发明的多肽前体中没有的信号肽。优选的异源信号肽是那些或来自于或衍生自革兰氏阴性菌的信号肽。在优选实施方案中，异源信号肽与载体蛋白成熟序列的N端相连。
革兰氏阴性菌拥有非常独特和复杂的细胞包被结构，其包括细胞的内细胞膜、周质和外细胞膜。要在利用本发明中的载体蛋白在细胞表面展示过客蛋白，表达的融合蛋白必须能够穿过内细胞膜和外细胞膜运输到细菌表面并保留在细菌表面。
为了使融合蛋白能够被定位在细胞的表面，载体蛋白必须含有有效的分泌信号序列以助载体蛋白穿过细胞内膜和用于将融合蛋白锚定在细胞表面的靶标序列。信号序列和靶标序列可以在自然发生的载体蛋白前体中获得，或者他们可以是异源序列，也就是说，可以从同一个细菌蛋白或相同或不同细菌的不同蛋白获得。
在革兰氏阴性菌中，细胞外膜是一个限制蛋白向外运输的障碍。通常只有菌毛蛋白、鞭毛蛋白、特异性的酶和少数毒素可以完全穿过外膜到达胞外。这些蛋白的大多数都是首先通过一般的分泌方式分泌到壁膜间隙，然后在一些其他的基因产物的辅助下穿过外膜。
对于一些外膜蛋白，如PhoE孔蛋白，对适当定位和聚集必要的信息分布在引物序列里。或者，靶标序列可能包含在一段短的连续片段内。例如，大肠埃希氏菌脂蛋白N端的头9个氨基酸对于其定位在外膜是必要的。将这段短序列与可溶性周质蛋白β-内酰胺酶融合将会使融合蛋白定位到胞外。同样，对OmpA进行研究发现154位和180位之间的氨基酸残基对于定位是关键的。对于OmpA，靶标定位和外膜聚合则显示截然不同的事件。
在一个实施方案中，一个杂合的多肽前体包含SEQ ID No4和与之N端连接的，决定向外膜分泌的氨基酸序列。膜靶向序列已经在很多种膜蛋白中得到鉴定，其中包括Lpp。通常对于Lpp，其作为定位信号的蛋白域是相当短的。Lpp靶向序列包含信号序列和成熟蛋白的前面9个氨基酸。这些氨基酸在Lpp N端发现。其它的可以作为分泌和膜定位信号源的蛋白包括大肠埃希氏菌外膜脂蛋白如TraT，OsmB，NlpB，BlaZ；铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)脂蛋白1；流感嗜血菌(Haemophilus influenza)PA1和PCN蛋白；立氏立克次氏体(Rickettsia rickettsii)17kDa脂蛋白；淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhea)H.8蛋白等等。
本发明的一个方面包含(i)一个表达盒包含本发明的多聚核苷酸，其表达受控于所需的调控元件，尤其是适合的启动子；(ii)一个表达载体包含本发明的表达盒；(iii)经本发明表达盒和/或载体转化或转染了的原核或真核细胞；还有(iv)一个由编码本发明的多肽或多肽衍生物的核苷酸序列产生多肽的方法，其包括在利于本发明DNA分子表达的条件下培养经本发明表达盒和/或载体转化或转染了的原核或真核细胞，然后从培养物中回收所编码的多肽或多肽衍生物。
豌豆根瘤菌细胞可以通过Garg B，Dogta RC，Sharma PK.1999介绍的方法进行转化。High-efficiency transformation of Rhizobium leguminosarum byelectroporation.Applied and Environmental Microbiology 4；和Giddings G，Mytton L，Taylor L，Thomas S，Allen D，Skot L.2000.A secondaryeffect of transformation in Rhizobium leguminosarum transgenic for Bacillusthuringiensis Subspecies tenebrionis delta-endotoxin(cryIIIA)genes.Theoreticaland Applied Genetics 。
苜蓿中华根瘤菌细胞可以通过Hayashi M，Maeda Y，Hashimoto Y，Murooka Y.2000介绍的方法进行转化。Efficient transformation ofMesorhizobium huakuii subsp rengei and Rhizobium species.Journal ofBioscience and Bioengineering 。
Mesorhizobium loti细胞可以通过Hayashi M，Maeda Y，Hashimoto Y，Murooka Y.2000介绍的方法进行转化。Journal of Bioscience andBioengineering 。
大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)细胞可以通过HattermannDR，Stacey G.1990描述的方法进行转化。Efficient DNA transformation ofBradyrhizobium japonicum by electroporation.Applied and EnvironmentalMicrobiology ；和Hayashi M，Maeda Y，Hashimoto Y，Murooka Y.2000.Journal of Bioscience and Bioengineering 。
马尔他布鲁氏菌(B.melitensis)细胞可以通过Ekaza E，Guilloteau L，Teyssier J，Liautard JP，Kohler S.2000描述的方法进行转化。Functionalanalysis of the ClpATPase ClpA of Brucella suis，and persistence of a knockoutmutant in BALB/c mice.Microbiology 6；和Jubier-Maurin V，Boigegrain RA，Cloeckaert A，Gross A，Alvarez-Martinez MT，Terraza A，Liautard J，Kohler S，Rouot B，Dornand J，Liautard JP.2001.Major outermembrane protein Omp25 of Brucella suis is involved in inhibition of tumornecrosis factor alpha production during infection of human macrophages.Infection and Immunity 0。
汉氏巴尔通氏体细胞可以通过Dehio M，Knorre A，Lanz C，Dehio C.1998描述的方法进行转化。Construction of versatile high-level expressionvectors for Bartonella henselae and the use of green fluorescent protein as a newexpression marker.Gene 。
五日热巴尔通氏体(Bartonella quintana)细胞可以通过Dehio M，KnorreA，Lanz C，Dehio C.1998描述的方法进行转化。Construction of versatilehigh-level expression vectors for Bartonella henselae and the use of greenfluorescent protein as a new expression marker.Gene 。
Mannheimia haemolytica细胞可以通过Marciel AM，Highlander SK.2001描述的方法进行转化。Use of operon fusions in Mannheimia haemolyticato identify environmental and cis-acting regulators of leukotoxin transcription.Infection and Immunity 9。
结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)细胞可以通过Hinds J，Mahenthiralingam E，Kempsell KE，Duncan K，Stokes RW，Parish T，Stoker NG.1999描述的方法进行转化。Enhanced gene replacement in mycobacteria.Microbiology ；和Bachrach G，Colston MJ，Bercovier H，Bar-NirD，Anderson C，Papavinasasundaram
KG. 2000.A new single-copymycobacterial plasmid，pMF1，from Mycobacterium fortuitum which iscompatible with the pAL5000 replicon.Microbiology .
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、伞菌假单胞菌(Pseudomonasagarici)和褐鞘假单胞菌(Pseudomonas fuscovaginae)细胞可以通过Enderle PJ，Farwell MA.1998描述的方法进行转化。Elctroporation of freshly platedEscherichia Coli and Pseudomonas aeruginosa cells.Biotechniques 25954；和Kim C，Wood TK.1998.Electroporation of pink-pigmented methylotrophicbacteria.Applied Biochemistry and Biotechnology 7381-88。
天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)细胞可以通过Oh SH，Chater KF.1997描述的方法进行转化。Denaturation of circular or linear DNA facilitatestargeted integrative transformation of Streptomyces coelicolor A3(2)Possiblerelevance to other organisms. Journal of Bacteriology ；和Gregorovic G，Vujaklija D.2001.High efficiency of direct plasmid transferbetween two Streptomyces spp.，and between Streptomyces spp.and E.coli.FoodTechnology and Biotechnology 3949-53.
霍乱弧菌(Vibrio cholerae)细胞可以通过Panda DK，Banerjee R，Das J.1995介绍的方法进行转化。Construction of shuttle vectors for cloning in vibriocholerae and Escherichia coli.Journal of Biosciences 。
杜氏嗜血菌(Haemophilus ducreyi)细胞可以通过Hansen EJ，Latimer JL，Thomas S E，Helminen M，Albritton WL，Radolf JD.1992介绍的方法进行转化。Use of electroporation to construct isogenic mutants ofHaemophilus ducreyi.Journal of Bacteriology 9；和Windsor HM，Gromkova RC，Koornhof HJ.1993.Transformation of v-factor independence from Haemophilusducreyi to haemophilus influenzae and haemophilus parainfluenzae.MedicalMicrobiology Letters 。
这项发明还包括(i)如上面所描述的表达盒或载体，用来表达编码多肽或多肽衍生物的核苷酸序列，其多肽是定位在外膜的，和(ii)用表达盒或载体转化了的原核细胞并且其在细胞的表面表达多肽。
具体的这个多肽是载体蛋白和过客蛋白的融合体，过客蛋白能够到达细胞表面，这可以通过蛋白酶可接近性分析(protease accessibility)或放射碘化作用(radio-iodination)的方法进行确定。
重组的表达系统是从原核或真核寄主中选择的，从原核中更适宜。真核寄主包括酵母细胞(例如，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris))，哺乳动物细胞(例如，COS1，NIH3T3，或JEG3细胞)，以及植物细胞。原核寄主包括革兰氏阴性菌，具体包括土壤杆菌属，更适宜的是根癌土壤杆菌，根瘤菌属(Rhizobium)，布鲁氏菌属(Brucella)，汉氏巴尔通氏体，溶血巴斯德氏菌，结核分枝杆菌，杜氏嗜血菌，单胞菌属(Pseudomonas)，大肠埃希氏菌，克雷伯氏菌属(Klebsiella)，欧文氏菌属(Erwinia)，志贺氏菌属(Shigella)，沙门氏菌属(Salmonella)，霍乱弧菌，乳杆菌属(Lactobacillus)，卡-介二氏菌(Bacille biliédeCalmette-Guérin)(BCG)，以及链球菌属(Steptococcurs)，优选不产毒素的霍乱弧菌突变菌株和减毒的鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella tyPhimurium)菌株。
细菌和真核细胞可以从多种渠道包括从商业渠道获得，例如可以从美国典型培养物保藏中心(ATCC；Rockville，Maryland)获得，用于重组蛋白表达的商购细胞在购买时还附带了其使用说明。
不产毒素的霍乱弧菌突变株据美国专利4,882,278描述的，其含有两个ctxA等位基因缺失以致于不产生功能性的霍乱毒素。WO 92/11354描述了一个菌株，其中的irgA位点被突变失活，这个突变可以和单链的ctxA突变组合。WO 94/01533描述了一个缺失突变体，其缺少功能型的ctxA和attRS1DNA序列。如WO 94/19482所描述的，这些突变株通过遗传工程使其表达异源蛋白。
WO 92/11361描述了减毒的鼠伤寒沙门氏菌菌株能否通过遗传工程表达重组的异源蛋白。
目前发明的其它的用于作为蛋白表达寄主的细菌菌株如；High等EMBO(和Sizemore等Science(中描述的弗氏志贺代菌(Shigella flexneri)；Medaglini等描述的格氏链球菌(Sreptococcusgordonii)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(；和Flynn J.L描述的卡-介二氏菌，Cell.Mol.Biol.(1994)40(suppl.I)31，WO 88/06626，WO 90/00594，WO 91/13157，WO 92/01796，和WO 92/21376。
本发明通常使用一种或多种通常可以得到的革兰氏阴性菌作为寄主细胞。但是，对于一些突变造成其膜成分有所改变的粗糙(rough)突变体，我们仍然希望其可用于本发明的实践。含有较高磷脂的膜，例如可能会给融合多肽在高温下的表达创造更好的条件。另一方面，可能由于脂质-蛋白间相互作用的增强，可使一些多肽更接近膜表面，从而可能会达到增强免疫原反应或改变吸附特性的目的。象这样的突变，自发的或非自发的，我们都希望其可以作为寄主细胞或作为膜定位序列或跨膜序列的来源。
在细菌中，我们发明的多肽可以插入到细菌基因组中或仍然作为质粒的一部分而保持自由状态。
表达系统的选择要依赖于我们所期望的表达多肽的特征决定。例如，将本发明多肽制备成一种特定的脂化形式可能是有利的。
本领域技术人员都知道，不是所有的载体和表达调控序列以及寄主都同样适合表达本发明的多核苷酸。然而，在以下所述的指导下，不用做不必要的试验，便可对载体，表达调控序列和寄主所出选择，同时不偏离本发明的保护范围。
在选择载体方面，寄主一定要选择适合载体在其中存在和复制，同时，还要考虑载体的拷贝数、控制拷贝数的能力以及其他蛋白如抗生素抗性蛋白的表达。在选择表达调控序列方面，需要考虑很多因素，其中重要的因素是考虑序列的相关强度(如在不同条件下控制表达的能力)，控制序列功能的能力，要表达的多核苷酸与调控序列间的适宜性(例如，要考虑避免出现会抑制有效转录的发夹二级结构)。在选择寄主方面，所选寄主要是与所选载体相适宜的单细胞寄主，对表达产物的可能毒性要有一定耐受力，如果需要其产物要能够分泌到外膜，要能够表达要求构象的蛋白，容易扩大规模以及容易纯化终产物。
对表达盒的选择依赖于所选择的寄主系统以及表达多肽的所需特征。通常，一个表达盒包括在寄主系统中有功能并且可以组成型或诱导型表达的启动子；核糖体结合位点；如果有必要还需要一个起始密码子(ATG)；编码信号肽例如脂质化(lipidation)信号肽的区域；本发明的DNA分子；终止密码子和任选3′终止区(翻译和/或转录终止子)。信号肽的编码序列与发明中的多聚核苷酸邻近并且放置在一个合适的读框内。信号肽的编码序列与编码成熟多肽的DNA分子同源或异源并且与用于表达的寄主的分泌装置相适宜。本发明中DNA分子的开放读框，单独或与信号肽一起，都放置在启动子之下以便于在寄主内转录和表达。启动子和信号肽编码区对本领域技术人员是已知的且可得到，这些包括例如，鼠伤寒沙门氏菌启动子(和由此得到的衍生物)可以在阿拉伯糖(启动子araB)的诱导下并且在革兰氏阴性菌如大肠埃希氏菌中有作用(如美国专利5,028,530和Cagnon等，(Cagnon et al.，Protein Engineering()843)所描述的)；噬菌体T7编码RNA聚合酶的基因启动子，该启动子在表达T7聚合酶的多种大肠埃希氏菌菌株中起作用(美国专利4,952,496)；OspA脂质化信号肽；以及RlpB脂质化信号肽(Takase et al.，J.Bact.()。
表达盒通常都是表达载体的一部分，根据在所选择的表达系统中的复制能力对其进行选择。表达载体(例如质粒)可以从例如Pouwels等描述的载体中进行选择(Cloning VectorsA Laboratory Manual 1985，Supp.1987)。合适的表达载体可以从不同的商业公司购买。
用表达载体转化/转染寄主细胞的方法已经广为人知，并且依赖于如Sambrook，J.E.F.等在Molecular Cloning a Laboratory Manual 2nded(1989)介绍的对寄主细胞的选择。Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor N.Y.
在表达方面，发明中的重组多肽(或由此得到的多肽)产生并保持在细胞内，分泌到细胞外介质中或壁膜间隙或嵌入膜中。所述多肽可以从培养的细胞提取物或重组细胞培养物离心后得到的上清液中得到纯化。通常重组多肽是通过基于抗体的亲和进行纯化的或其他的可以被本领域技术人员采用的方法进行纯化，如编码多肽的多聚核苷酸或其衍生物与小的亲和结合域的融合体。利用抗体通过免疫亲和来纯化本发明多肽的方法将在以下介绍。
在这里提供的序列信息有助于设计用于诊断的特异的核苷酸探针和引物。因而，本发明的另一方面提供了在SEQ ID NO1或3或相关的同源序列中存在的或由于遗传密码子的简并性而从上述这些序列中衍生得到的核酸探针或引物。
这里所提的“探针”是指在严谨条件下与SEQ ID NO1或3中核酸分子、或其相关同源序列、互补或反义序列杂交的DNA(较好的是单链)或RNA分子(或其修饰物或其组合)。通常，探针要比全长序列明显短。这样的探针包含约5到约100(例如，10，12，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60...等等)，优选约从10到约80个核苷酸。具体地，探针至少要有75％(例如至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％)，优选至少要有95％与SEQ ID NO1或3的部分同源。探针也可以包含和这些序列和部分互补的序列。探针也可以包含一些修饰的碱基如肌苷，5甲基脱氧胞苷，脱氧尿苷，二甲氨基-5-脱氧尿苷或二氨基-2，6-嘌呤。糖和磷酸残基也可以修饰或取代。例如，一个脱氧核糖可以被聚酰胺取代(Nielsen et al.，Science()而且磷酸酯残基可以被酯基团如二磷酸酯，烷基酯，芳基膦酸酯和偶磷硫羰酸酯所代替。此外核糖核苷酸中2′-羟基基因可以被包括如烷基在内的基团修饰。
本发明的探针可以作为捕获或检测探针被用于诊断。这种捕获探针通常直接或间接通过共价的方式或被动的吸附被固定在一个固相支持上。一个检测探针是被检测标记物所标记，这种标记物包括放射性同位素、酶如过氧化物酶、碱性磷酸酶和能够水解发色、发出荧光或发光的底物的酶、可以产色、发出荧光或发光的化合物、核苷酸碱基类似物和生物素。
本发明的探针可以用于传统的各项杂交技术中，例如斑点杂交(dot blot)中(Maniatis et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual(1982)Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York)，Southern印迹，northern印迹，或夹心法技术中(Dunn et al.，Cell()。后项技术包括利用至少部分不同的核苷酸序列作为特异的捕获探针和/或检测探针的应用。
引物通常是大约10到约40个核苷酸(例如，11，12，13，14，15，17，20，25，30或35个核苷酸)用于在扩增过程(例如PCR)或延长过程或反转录方法中起始DNA的酶促聚合。标记涉及PCR的诊断方法中所用的引物的技术已广为人知。
如这里所描述的，本发明还包括(i)包括本发明探针在内应用于检测和/或鉴定土壤杆菌属存在于生物材料的试剂；(ii)检测和/或鉴定生物材料中土壤杆菌属存在的方法。在一个实施方案中，检测和鉴定的方法包括以下步骤(a)从生物材料中得到样本，(b)从所述材料中抽提DNA或RNA并变性，然后(c)在严谨的杂交条件下将本发明的探针例如可以是捕获探针、检测探针或两者共存的与核酸杂交，检测结果。在另一实施方案中，检测和鉴定方法包括以下步骤(a)从生物材料中得到样本，(b)从中抽提DNA，(c)至少一个，最好是二个本发明的引物用于对抽提DNA的聚合酶链式反应，(d)产生扩增的片段。
很显然，揭示SEQ ID NO1或3中多聚核苷酸或其同系物或部分的序列，可以得到相关的氨基酸序列。因此本发明还包括经充分纯化了的本发明多聚核苷酸编码的多肽或其多肽衍生物。
“充分纯化的多肽”是指将多肽与其自然发生环境完全分开和/或与其合成环境中的大多数多肽分开的多肽。例如，充分纯化的多肽与细胞质中的多肽分离。在SDS-PAGE凝胶上的一条带并不等同于一个充分纯化的多肽，这是因为凝胶样品含有很多种类的多肽。了解此项技术的人将会明白本发明中多肽可以从自然资源中纯化如从一个土壤杆菌菌株纯化，或通过重组的方式制备。
本发明包括的多肽、同系物或片段是经过修饰的，以保持或改进它们在细胞表面展示过客蛋白的能力。这些修饰包括前面介绍的氨基酸的取代、缺失和插入，但并不改变其固有的拓扑结构和靶定到外膜的能力。
多肽或多肽的衍生物可以通过已知的实验手段产生和纯化，并用于得到其抗体。如上所述，多肽或其衍生物可以作为一种融合蛋白产生，其融合蛋白上带有利于纯化的融合尾。融合蛋白用于刺激小的哺乳动物产生免疫反应得到抗所述多肽或多肽衍生物的抗体(单一特异性抗体(monospecificantibody)，因此，本发明还包括与本发明多肽或多肽衍生物结合的单一特异性抗体。
“单一特异性抗体”是指该抗体能和本发明中某一特异性蛋白发生反应，所述蛋白即}
我要回帖
更多关于 血红蛋白指数 的文章
更多推荐
- ·b站如何看已结束的直播在b站上观看直播？
- ·求一首阿伊呀伊呀一直重复的英文歌歌 我找了7年了 跪求大神帮我
- ·求日本的地狱叫什么2000年恐怖片（生地狱）
- ·开创了凡尔纳的作品成为现代什么小说先河现代科幻小说的先河？
- ·急求dirk的互以后我就不打扰了歌词的这首歌歌词唱完紧接着的大声的怼的没有唱的几声原曲名？
- ·教育和呵护管取消隐藏不管用用，98难忘hn
- ·4岁小孩换蝶窦炎的最好治疗方法治好了会复发吗
- ·碳14c13呼气试验阴性实验为阴性，是什么意思
- ·在国子监太学生里管理学生的品行学规的官员叫什么
- ·我17.8.17查出来有多囊卵巢综合征表现，还有血糖高，可能患有糖尿病，男方
- ·什么原因导致什么叫帕金森综合症症反复发作
- ·拳头上的手指关节痛握不了拳头的骨缝凹下去了，能恢复吗
- ·复读生能参加竞赛吗下年还可以参加分类考试么
- ·英勇无畏的意思是什么内涵是什么
- ·液基薄层液基细胞学轻度炎症症反应，是什么意思，需要治
- ·如何看待25岁广东医科大学博士猝死雷霄骅猝死
- ·什么人才能上北大青鸟陈璇个人资料呢？
- ·网申悠然白金卡AE白的时候为什么不能添加交行白金卡
- ·深圳中南传媒股票是做什么的？
- ·易县北京万佛华侨陵园园的园林区介绍？
- ·怎样根据平均亲水指数判断蛋白的亲水性类型
- ·sunshadebase 写成sun shadebase得分吗
- ·宝应实验初中常玉兰重点初中录取分数线
- ·谁能用科学依据辟谣下尼比鲁行星最新消息
- ·拆柜 拆除日语怎么说说比较好
- ·VMware 12版怎么安装深度linux系统U盘安装教程
- ·有限元求解过程程要清楚
- ·有中国科学管理学院城市上海发展战略研究所所这个部门吗
- ·用GLFore动平衡机做增压器上海电机转子动平衡机校正效果好不好？
- ·小儿肺炎肝与心肌受损严重吗多长时间恢复
- ·如果现在陨石撞地球的视频，人类有可能生存么
- ·在哪里可以学到早餐卖鸡蛋灌饼挣钱吗早餐技术，早餐早餐卖鸡蛋灌饼挣钱吗培训
- ·1里面有多少个八分之一等于多少
- ·美国的哒哒搭磁性积木怎么拼tegu会掉色吗？
- ·这算单跨梁弯矩计算吗?
