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胶体金层析竞争法
胶体金层析，竞争法抗原抗体反应时间太长，直接爬水上去阳性不消线，如果控制流速在40S左右的话就能消线很干净。但是我做的是双联的测试条另外一个爬水速度很快，如何能加快朗园抗体反应速度。求大神不吝赐教。谢谢了
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免疫胶体金技术的基本知识
核心提示：一、免疫胶体金技术的基本知识1、胶体金的概念氯金酸(HAuCl4)在还原剂作用下，可聚合成一定大小的金颗粒，形成带负电的疏水胶溶液
一、免疫胶体金技术的基本知识
1、胶体金的概念
氯金酸(HAuCl4)在还原剂作用下，可聚合成一定大小的金颗粒，形成带负电的疏水胶溶液。由于静电作用而成为稳定的胶体状态，故称胶体金。
2、免疫金标记技术
胶体金颗粒表面负电荷与蛋白质的正电荷基团因静电吸附而形成牢固结合。胶体金对蛋白质有很强的吸附功能，蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面，无共价键形成，标记后大分子物质活性不发生改变。
3、胶体金的示踪原理
金颗粒具有高电子密度的特性。金标蛋白在相应的配体处大量聚集时，在显微镜下可见黑褐色颗粒或肉眼可见红色或粉红色斑点。
免疫金银染色：利用金颗粒可催化银离子还原成金属银这一原理，通过银颗粒的沉积，在光镜下可见抗原抗体反应的阳性部位呈现银的黑褐色。
二、胶体金的制备
1、胶体金制备的注意事项
（1）玻璃容器的清洁：玻璃容器应绝对清洁，用前酸洗、硅化。
（2）试剂、水质：实验用水一般用双蒸水。缓冲液有足够大的缓冲容量，浓度不应过高以免金溶胶自凝。
2、常用方法
一般采用还原法，常用的还原剂有柠檬酸钠、鞣酸、白磷。
（1）柠檬酸三钠还原法：
取0.01％氯金酸水溶液100 ml加热至沸，搅动下准确加入１％柠檬酸三钠水溶液0.7 ml，金黄色的氯金酸水溶液在2分钟内变为紫红色，继续煮沸15分钟，冷却后以蒸馏水恢复到原体积，如此制备的金溶胶其可见光区最高吸收峰在535 nm，Ａ1 cm/535 nm=1.12。
100 ml氯金酸中柠檬酸三钠的加入量对金溶胶粒径的影响：
１％柠檬酸三钠（ml ）0.30 0.45 0.70 1.00 1.50 2.00
金溶胶颜色&&&&&&&&&&&&&&&&&& 蓝灰 紫灰& 紫红 红&& 橙红& 橙
吸收峰(nm)&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 220&& 240&&& 535&& 525&& 522&& 518
径粒(nm)&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 147&& 97.5&& 71.5&& 41&& 24.5&& 15
（2）柠檬酸三钠－鞣酸混合还原剂：改变鞣酸的加入量，制得不同大小的胶体颗粒。
（3）白磷还原法：制备的胶体金直径约6 nm，并有很好的均匀度，但白磷和乙醚均易燃易爆，一般实验室不宜采用。
三、免疫胶体金的制备
1、制备胶体金标记蛋白质应注意的问题
（1）蛋白质的预处理。蛋白质应先对低离子强度的水透析，去除盐类成分。用微孔滤膜或超速离心除去蛋白质溶液中的细小微粒。
（2）低盐浓度的缓冲液。过量盐可使金颗粒发生凝集。
（3）PH接近于蛋白质等电点或略偏碱性。蛋白质所处溶解状态最适合偶联，蛋白质分子在金颗粒表面的吸附量最大。
（4）蛋白质最适用量的选择：能使胶体金稳定的最适蛋白量再加10％即为最佳标记蛋白量。
（5）胶体金与蛋白质偶联后，加入稳定剂，以避免产生凝集。一般选用PEG（分子量为20000）和牛血清白蛋白作稳定剂。
2、常见方法
（1）用0.1 mol/L K2CO3或0.1 mol/L HCl调节金溶胶至所需pH。
（2）加入最佳标记量的蛋白质溶液，搅拌2～3分钟。
（3）加入5 ml 1％PEG20000 溶液。
（4）于1 g离心，小心吸去上清液。
（5）将沉淀悬浮于一定的缓冲液中，离心沉淀后，再用同一缓冲液恢复，浓度以Ａ1 cm/540 nm=1.5左右为宜，置4 ℃保存。
&四、免疫胶体金的应用
1、胶体金在光镜水平、电镜水平的应用
直径为3～15 nm胶体金均可用作电镜水平的标记物。最大优点是可以通过应用不同大小的颗粒进行双重或多重标记。
胶体金用于光镜水平、电镜水平的研究，主要包括：①细胞悬液或单层培养中细胞表面抗原的观察。②单层培养中细胞内抗原的检测。③组织切片中抗原的检测。
2、胶体金在流式细胞仪中的应用
应用胶体金标记的抗体，分析细胞表面抗原。胶体金可以明显地改变红激光散射角，区分不同的标记，能同时进行几种标记。
3、凝集试验
单分散的免疫金溶胶清澈透明。与相应抗原或抗体发生专一性反应后出现凝聚，溶胶颗粒增大、沉降，光散射随之发生变化，溶液的颜色发生变化。
4、免疫印迹技术
用聚丙烯酰胺凝胶电泳将蛋白质分离，得到的区带转移至硝酸纤维素膜，与特异性的抗体保温后，再与胶体金标记物温育，根据膜上胶体金颗粒颜色深浅可测知样品中的特异性抗原。金免疫印迹技术有相当高的灵敏度。采用免疫金银染色法，灵敏度可低至0.1 ng。
5、胶体金在肉眼水平的应用--胶体金免疫结合试验
根据检测装置的不同可分为金免疫层析试验和金免疫渗滤试验。
1、金免疫层析试验
（1）免疫层析条的组成，有4个组分：⑴吸水纸（加样区）。⑵玻璃纤维膜，膜上吸附着干燥的金标抗体（流动带）。⑶硝酸纤维素膜，膜上包被着抗原或抗体条带和能与标记物直接起反应的质控物条带（检测带）。⑷吸水纸。以上各组分首尾互相衔接。
（2）免疫层析条制作中须注意的几个问题
微孔滤膜：硝酸纤维素膜有2个特性：较高的蛋白吸附容量和良好的亲水性，应用最多。硝酸纤维素膜的活化：先使硝酸纤维素膜上形成氨基手臂，然后再加入戊二醛在手臂上形成自由醛基，多肽与活化膜的活性基团共价联接。
受体：①与膜材料的结合稳定。②有较高的生物活性，因而有足够的配体捕获容量。③有较高的纯度，以保证检测的特异性。④可流动性。标记或非标记受体以干态吸附于流动带，在流动带加入高效助溶剂，从而使受体具有快速溶解的特性。
（3）反应模式有夹心法、间接法、竞争法
例1 金免疫层析法检测吗啡（竞争法）：
吗啡是鸦片类镇痛药，抑制中枢神经系统。是可待因和海洛因的主要代谢物质，吗啡不经代谢即可排泄。
测定原理：吗啡偶联物和胶体金标记的抗吗啡单克隆抗体固定于膜上测试区。通过吗啡偶联物和尿液中的吗啡竞争结合金标单克隆抗体，最小检出量300 ng/ml。
结果判定：
阳性（+）：吗啡300 ng/ml以上，质控区出现一条紫红色条带，测试区内不出现紫红色条带。吗啡浓度高于300 ng/ml时，胶体金抗体与吗啡全部结合，从而不与吗啡偶联物结合而不出现紫红色条带。阴性（-）：吗啡在300ng/ml以下。出现两条紫红色条带，一条在测试区内，另一条在质控区内。吗啡浓度低于300ng/ml时，胶体金抗体不能与吗啡全部结合。这样，胶体金抗体在层析过程中会被固定在膜上的吗啡偶联物结合，测试区内会出现一条紫红色条带。无效：质控区未出现紫红色条带，表明不正确的操作过程或试剂盒已变质损坏。
质控区 测试区 流动带
二抗 吗啡偶联物 金标单抗
例2 金层析免疫法测定甲胎蛋白（夹心法）：
甲胎蛋白（AFP）是原发性肝癌的肿瘤标示物，对肝癌的早期诊断、早期治疗具有重要临床意义。AFP单抗A、B，羊抗鼠二抗固定于硝酸纤维素膜上，金标AFP单抗C固定于玻璃纤维素膜上。阴性1条带，阳性2条带， 3条带为强阳性，不出现有色条带为试剂失效。
质控带 阳性 阳性 流动带
羊抗鼠二抗 单抗A 单抗B 金标单抗C
例3 金免疫层析法检测梅毒抗体（间接法）：
胶体金标记的抗人IgG，样品中的梅毒抗体与胶体金标记的抗人IgG结合，沿硝酸纤维素膜移动，在包被有基因重组的梅毒螺旋体抗原结合，出现红色反应线。
质控带 阳性 流动带
抗原 金标抗人IgG
2、金免疫渗滤分析
（1）试剂盒：渗滤装置为一充满吸水垫料的塑料小盒，在盒盖中央的小孔下面放置了一片硝酸纤维素膜，膜上预包被抗原或抗体斑点。
（2）反应模式：间接法、夹心法、捕获法、竞争法。
间接法：抗原固定于膜上&标本（抗体），洗涤&金标二抗。
夹心法：抗体A固定于膜上&标本（抗原）&金标单抗B。
捕获法：在固相载体上包被二抗&样品（待测抗体）&抗原&金标单抗。
竞争法：在载体上包被抗体&加入待测抗原&加入标记抗原
3、金免疫层析分析和金免疫渗滤分析的比较
（1）相同点：检测原理相同。以微孔滤膜为载体，滤膜的毛细管作用促进抗原抗体结合反应，通过胶体金结合物达到检测目的。
（2）不同点：
硝酸纤维素膜的种类、形式及组成方式。金免疫层析分析为狭长形膜，由4部分组成，依次是吸水纸、玻璃纤维素膜、硝酸纤维素膜、吸水纸。金免疫渗滤分析为圆形硝酸纤维素膜及底层的吸水垫料。
标记配体的形式。金免疫层析分析为固相形式，金免疫渗滤分析为液相形式。
液体的移动方向。金免疫层析分析是通过层析作用的横向流动，金免疫渗滤分析是通过垂直穿透固定有配体的硝酸纤维素膜而进行。
操作步骤。金免疫层析分析大多只有加样一个步骤；金免疫渗滤分析有加样、洗涤、加标记配体等。
4、金免疫层析分析和金免疫渗滤分析特点
（1）单份测定，试剂和样本用量极小，样本量可低至1～2ul。
（2）不需任何检测仪器，适于现场应用。
（3）没有诸如放射性同位素、邻苯二胺等有害物质参与。
（4）实验结果可以长期保存。
（5）检测速度快，几分钟即可用肉眼观察结果。
5、胶体金免疫结合试验在临床检验中的应用
主要用于检测正常体液中不存在的抗原性物质、正常人含量极低而在特殊情况下异常升高的物质。
（1）激素。早早孕诊断试剂人绒毛膜促性腺激素，检测尿液。
（2）传染病病原的抗原和抗体。肝炎病毒、艾滋病病毒抗体等。
（3）性病病原：梅毒螺旋体抗体、淋球菌等。
（4）细菌：结核杆菌抗体、胃幽门螺杆菌抗体等。
（5）寄生虫：弓形虫抗体、血吸虫抗体等。
（6）肿瘤标记物：前列腺癌特异抗原（消化道恶性肿瘤尤其是结肠癌）、甲胎蛋白（肝癌）
（7）心血管病检测标志物：血清心肌肌钙蛋白、肌红蛋白和肌酸激酶同工酶，诊断急性心肌梗塞。
（8）其他蛋白质：甲状腺微粒体抗体（桥本甲状腺炎）
（9）其他：血糖、尿糖及尿液中吗啡和海洛因等。
6、金免疫结合试验的发展前景
（1）进一步提高检测灵敏度。采用信号放大系统如生物素亲和素系统或免疫金银染色法，并结合一些相应的简单检测仪器。
（2）实现检测多元化。在同一膜上作多种项测定，检测某些具有联检意义的物质。
（3）实现定量或半定量检测。
GIFA可用反射光密度计对斑点颜色的强度进行测定，可得到半定量的结果；控制受体捕获量：固定多种不同量的受体，在膜上包被多条反应线，观察各自显色情况，将待测物含量确定于某一浓度区间。
（4）通用试剂的应用。
胶体金标记葡萄球菌蛋白A代替抗人IgG标记物；链亲和素可作为通用固定受体，与各种生物素化抗体结合用于检测相应的抗原性物质。
编辑：songjiajie2010
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胶体金免疫层析法检测食品中天然存在的危害物质的研究进展
导读：食品科学※专题论述，胶体金免疫层析法检测食品中天然存在的危害物质的研究进展，（南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，摘要：胶体金免疫层析法是一种简易、快速的检测方法，现已广泛应用于食品安全检测、生物医学诊断等许多领域，食品中的有害成分可分为人为添加和天然存在的两部分，本文综述了胶体金免疫层析法在食品中天然存在的危害物质快速检测中的应用，天然危害物质，以胶体金为示踪物应用于抗原抗体反应的免疫层析
食品科学 ※专题论述
2014, Vol.35, No.05
胶体金免疫层析法检测食品中天然存在的危害物质的研究进展
徐超莲，赖卫华*，刘道峰
（南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047）
摘 要：胶体金免疫层析法是一种简易、快速的检测方法，现已广泛应用于食品安全检测、生物医学诊断等许多领域。食品中的有害成分可分为人为添加和天然存在的两部分。本文综述了胶体金免疫层析法在食品中天然存在的危害物质快速检测中的应用，并对其发展前景进行展望。关键词：胶体金；免疫层析；食品安全；天然危害物质
Progress in the Detection of Naturally Occurring Hazardous Substances in Foods by Colloidal Gold
Immunochromatography Assay
XU Chao-lian, LAI Wei-hua*, LIU Dao-feng
(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang
330047, China)
Abstract: Colloidal gold immunochromatography assay is a simple and fast immunological detection technology and is now widely applied in many fields including food safety detection, biomedical diagnosis, and so on. The food-derived hazardous substances are classified into either artificially added or naturally occurring.includeman-added additives and ly existing hazards In this article, the application of colloidal gold immunochromatography assay in the detection of the naturally ing occurring hazardous substances is reviewed. The further development of the immunochromatography assay is prospected as well.Key words:
natural hazardous substances中图分类号：TS207
文献标志码：A doi:10.7506/spkx1405050
文章编号：（7-05
目前，以胶体金为示踪物应用于抗原抗体反应的免疫层析方法已广泛地应用于食品安全的快速检测。胶体金是由氯金酸在还原剂如柠檬酸三钠、抗坏血酸、柠檬酸钠、鞣酸等的作用下聚合成一定大小的金颗粒，并在静电作用下形成稳定的胶体状态[1]。因为胶体金具有肉眼可见的红色，当抗原与抗体结合部位的金颗粒达到一定数量时，便可观察到红色条带，通过红色条带即可判断检测结果。通常实际检测根据具体情况可以采用两种不同的方式：双抗夹心法和竞争法。以胶体金为免疫标记物方法的优点是操作简单、价格低廉、成本较低、特异性和灵敏度较高、肉眼易判断、检测时间短，特别适合广大基层和大批量现场检测。
胶体金独特的理化特性及作为标记物的独特优点，使其在食品安全检测、生物医学诊断等各个领域得到了广泛地应用，且胶体金试纸条的产业化已规模化且产品
日益成熟。近年来，食品生产的工业化和工业发展带来的污染使得因此而起的食品安全重大事件引起国际社会的广泛关注。然而，除了人工合成的化学物质的非法添加等造成的污染外，食品中天然存在的危害物质：食源性致病菌、生物毒素、过敏原及环境中的重金属，更是引起食品安全问题频繁发生的重要因素。本文从胶体金免疫层析法在食品中天然存在的危害物质快速检测中的研究应用展开综述。1
胶体金免疫层析法快速检测食源性致病菌
食源性致病菌主要有沙门氏菌、大肠杆菌O157∶H7、志贺菌、单增李斯特菌等。纵观全球各地，由食源性致病菌引起的食物中毒已经成为当前世界上最突出的食品安全问题。据报道，全球每年发生40～60亿例食源性疾
收稿日期：
基金项目：江西省主要学科学术和技术带头人培养计划项目（20113BCB22007）；江西省教育厅落地项目（KJLD13009）；
江西省生猪产业质量安全岗位专家项目（JXARS-03）
作者简介：徐超莲（1988―），女，硕士研究生，研究方向为食品工程。E-mail：*通信作者：赖卫华（1968―），男，教授，博士，研究方向为食品科学。E-mail：
258 2014, Vol.35, No.05
病，发展中国家每年约有180万人口死于食源性疾病，即使是在发达国家，每年亦有10%以上的人群感染食源性疾病[2]。1996年日本发生了世界上规模最大、涉及6300名学生的大肠杆菌O157∶H7食物中毒，死亡2人[3]，全球已有6大洲30多个国家报道有该菌所致的感染流行[4]。单增李斯特氏菌其主要的传染源是动物性食品，据美国疾病预防控制中心（Centers for Disease Control，CDC）报道，美国每年约有600～2000例病人，死亡约450人[5]。2010年日本4090个养鸡场中抽取203个调查，48个显示大气浮尘感染沙门氏菌，感染率达23.6%[6]。最近一项食源性疾病主动监测显示，我国平均6个半人中就有1人次罹患食源性疾病。食源性疾病已成为我国头号食品安全问题。目前，检测食源性致病菌的主要方法之一是免疫层析法，其中基于双抗夹心原理的胶体金免疫层析法在检测食源性致病菌领域的发展已比较成熟，特别是针对于大肠杆菌O157、沙门氏菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌等致病菌已有较多的研究报道，具体见表1。
待检菌大肠杆菌O157大肠杆菌O157大肠杆菌O157大肠杆菌O157单增李斯特菌单增李斯特菌鼠伤寒沙门氏菌沙门氏菌沙门氏菌伤寒沙门氏菌金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌志贺氏菌霍乱弧菌副溶血弧菌嗜水气单胞菌迟缓爱德华氏菌
胶体金免疫层析法在食源性致病菌的检测应用进展the detection of foodborne pathogens
标记抗体抗O157∶H7单克隆抗体抗O157∶H7单克隆抗体抗O157∶H7单克隆抗体抗O157∶H7单克隆抗体抗单增李斯特多克隆抗体抗单增李斯特单克隆抗体兔抗鼠伤寒沙门氏菌多抗抗沙门氏菌单克隆抗体抗沙门氏菌多克隆抗体抗伤寒沙门氏菌O901多糖的多克隆抗体
标记抗Protein A的IgG抗重组凝集因子A的多克隆抗体抗志贺氏菌单克隆抗体抗O1群霍乱弧菌多价单克隆抗体抗副溶血弧菌多克隆抗体抗嗜水气单胞菌单克隆抗体记抗迟缓爱德华氏菌单克隆抗体
检测样本模拟食品样本莴苣、牛肉等牛奶、水、牛肉
灵敏度10CFU/mL104 CFU/mL10CFU/mL
※专题论述
以提高食源性致病菌的检测灵敏度和特异性。此外，有些研究还在此基础上，结合了免疫磁珠富集技术或生物素-链霉亲和素系统，提高其检测灵敏度：如Qi Hui等[11]用免疫层析法结合免疫磁珠富集技术快速检测大肠杆菌O157，灵敏度为103CFU/mL，比直接用免疫层析法检测灵敏度提高了2个数量级[8]；Zhao Xihong等[10]基于生物素-链霉亲和素系统制备胶体金免疫层析试纸条检测大肠杆菌O157，检测食品中10倍稀释的O157，最低限度为2.3×103 CFU/mL，经富集后检测限度达2.3 CFU/mL。随着检测能力不断提高，胶体金免疫层析试纸条也趋向定量检测和多元检测发展。例如，谢士嘉等[12]建立了胶体金试纸条-胶体金生物传感器有机整合的胶体金定量检测系统检测单增李斯特菌，在人为肉眼判断3.5×104 CFU/mL的基础上提高了检测的敏感性，定量检测灵敏度为3.5×103 CFU/mL，线性范围3.5×103～3.5×108 CFU/mL，回收率在99%～101.7%之间；王卫杰[28]建立了同时检测E.coli O157∶H7和Salmonella Tyhpimurium的免疫层析技术，同时检测时检测限为105 CFU/mL，可以提高检测效率，降低检测成本，对需要多个指标联检物质的检测具有很大的应用价值[29]。但目前，关于食源性致病菌多元检测的文献报道较少，可以借鉴其他物质多元检测的思路，研制出食源性致病菌联检的胶体金试纸条。2
胶体金免疫层析法快速检测生物毒素
生物毒素也是食品安全检测中不可忽视的问题，它主要包括贝类毒素和真菌毒素。2.1
贝类毒素属于海洋天然有机物，其形成与海洋有毒藻类赤潮密切相关。有毒藻类产生的毒素通过食物链进入贝类体内，形成贝类毒素，而人们食用含贝类毒素的贝类产品会造成食物中毒。常见的贝类毒素有麻痹性贝毒、神经性贝毒、记忆缺失性贝毒和腹泻性贝毒[30]。自1967年以来，我国共发生有记载的贝类中毒事件47起，29人死亡，604人中毒后需入院治疗，中毒事件主要发生在我国的福建、台湾、浙江、广东沿海[31]。近几年来，我国贝类中毒事件频繁发生，贝类毒素已经成为环境和食品安全的严重问题，寻求一种快速筛查海产品中贝类毒素的方法尤为迫切。目前国内外已有应用胶体金技术检测海水或海产品中甲藻毒素、麻痹性贝毒、腹泻性贝毒等方面的报道，其检测原理主要为竞争抑制免疫反应。
Zhou Yu等[32-33]建立一步免疫层析法快速检测水产品样本中的双鞭甲藻毒素（PbTxs）和河豚鱼组织中的河豚毒素，灵敏度分别为20ng/mL和40ng/mL，适于现场快速检测。高利利等[34]
制备软骨藻酸（domoic acid，DA）胶体金免疫层析快速检测试纸条，能快速检测贝类
Application of colloidal gold immunochromatography assay in
参考文献[8][9][10][11][12][13][14][15][16][17][18][19][20][21][22][23][24][25]
10倍稀释的脱脂奶2.3×103 CFU/mL牛奶、橙汁、果冻3.5×10CFU/mL蔬菜、牛奶、生肉等3.9×10CFU/mL
精瘦肉生鸡蛋鱼粉PBS、血清猪肉、牛肉等牛奶牛奶冻虾、牡蛎、罗非鱼磷酸盐缓冲液小牛血清小牛血清
10CFU/mL107 CFU/mL2.3×105 CFU/mL1.14×10CFU/mL25CFU/g1×104 CFU/mL105 CFU/mL10CFU/mL
带鱼、鱿鱼、墨鱼等3.59×10CFU/mL
1×10CFU/mL1×10CFU/mL1×105 CFU/mL
猪链球菌（血清2型）抗猪链球菌（血清2型）的多克隆抗体
从近几年的文献报道看，国内外关于胶体金免疫层析法检测食源性致病菌在大肠杆菌O157、沙门氏菌、单增李斯特菌的研究应用较多。其胶体金免疫层析试纸条采用的标记抗体主要有单克隆抗体和多克隆抗体。单克隆抗体虽然制备周期较长、价格较贵，但在检测食源性致病菌时其灵敏度比多克隆抗体稍高[26]，如黄岭芳等
采用单克隆抗体为标记抗体制备的大肠杆菌O157的胶
体金免疫层析试纸条，检测限为104 CFU/mL，比采用多克隆抗体的胶体金免疫层析试纸条低100倍[27]。可见，采用在纯度相当的条件下采用亲和力强的单克隆抗体可
食品科学 ※专题论述
食品中软骨藻含量，检测灵敏度为20ng/mL。Liu Renyan等[35]研制了快速检测软海绵酸（okadaic acid，OA）的胶体金试纸条，其检出限为12ng/mL。此外，Lu Shiying等
也建立了一种现场快速筛查软海绵酸的胶体金试纸
条，定性检测限为150μg/kg，其结果与应用高效液相色谱法-质谱联用仪/质谱联用仪（high performance liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry，HPLC-MS/MS）保持一致。由于高纯度的毒素制备困难，价格昂贵，将毒素与载体蛋白偶联技术难度较大，国内外相关研究起步较晚，水平较滞后，受抗贝毒有毒成分的单克隆抗体的制备水平的限制，胶体金免疫层析法检测贝毒的研究还有很大的提升空间。2.2
真菌毒素是一些真菌在生长过程中所产生的次级代谢产物，几乎广泛地存在于所有的食品和饲料中，危害人类和动物的健康安全。目前研究较多、对人类危害较大的真菌毒素包括黄曲霉毒素（主要是AFB1和AFM1）、赭曲霉毒素A（ochratoxin A，OTA）、伏马菌素（fumonisin，FB）、玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）、脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）等，具有毒性强、污染频率高的特点，可致癌、致畸、致突变。据报道[37]，全球每年由于霉变、污染真菌毒素引起的农产品和工业原料的损失达数百亿。据联合国粮食及农业组织统计，全世界每年约有25%的谷物受真菌毒素污染。鉴于真菌毒素给粮油食品产业带来的巨大损失，相关检测技术已展开了广泛的研究，尤其是适于大批量现场快速筛查的胶体金免疫层析技术。目前，胶体金免疫层析法已广泛应用于真菌毒素的检测中。由于真菌毒素是小分子化合物，研制的免疫层析试纸条均采用的是竞争免疫层析原理，具体见表2。
胶体金免疫层析法在真菌毒素检测中的应用进展
the detection of mycotoxins
待检毒素标记抗体
抗AFB1多抗AFB1
AFB1抗AFB1单抗
抗AFB1单抗AFB1
AFB1抗AFB1单抗AFB1抗AFB1多抗
抗AFB1单抗AFB1
AFB1、AFB2、AFG1、AFG2抗AFB单抗
抗AFM1多抗AFM1
OTA抗OTA单抗OTA抗OTA多抗OTAOTA核酸适配体OTA抗OTA多抗FBs抗FB1单抗
抗FB1单抗FB1
抗ZEN或FB1单抗ZEN、FB1
DON抗DON单抗DON、ZEN抗DON和ZEN单抗
大米、玉米、小麦粉
牛奶大米、玉米、花生
酱油食品、饲料花生、普洱茶、饲料
花生牛奶玉米、小麦玉米、小麦、硬质小麦
小麦、燕麦、玉米等
玉米玉米玉米、小麦、饲料小麦、玉米小麦、玉米
灵敏度参考文献2.5 ng/mL[38]0.01 ng/mL[39]5 ng/mL[40]2 ng/mL[41]2 ng/mL[42]1 ng/mL[43]0.03、0.06、0.12、0.25 ng/mL[44]
1 ng/mL[45]10 ng/mL[46]1.5μg/kg[47]2.5 ng/mL[48]1.0 ng/mL[49]2.5 ng/mL[50]1.0μg/L[51]6 ng/mL、50 ng/mL[52]50 ng/mL[53]100 ng/mL、6 ng/mL[54]
2014, Vol.35, No.05
真菌毒素不仅对人和动物具有多种特定器官的毒性及致癌性，而且价格昂贵，研究一种能够替代真菌毒素的标准品的检测元件可能是未来真菌毒素检测发展的一个趋势。目前，针对真菌毒素半抗原的研究包括抗原模拟表位肽和抗独特型抗体[55]。Lai Weihua等[46]将噬菌体展示的OTA模拟表位应用于胶体金免疫层析试纸条，建立了一种安全快速的OTA的检测方法，检测限为10ng/mL，该方法解决了真菌毒素标品来源受限的问题，为其他真菌毒素的无毒检测提供了新的思路。此外，应用胶体金试纸条实现2种甚至是多种真菌毒素的同时检测也将是一个有价值的研究热点。近一两年来，国内外关于这方面的研究报道已比较广泛。Wang Yuankai等[52]建立了同时检测ZEN和FB1的胶体金免疫层析法，实现了食品样本的多种毒素的联检，为其他食品有害物质的多元检测提供了参考方法。3
胶体金免疫层析法快速检测环境中存在的重金属重金属是相对密度在5以上的金属，对环境造成污染的重金属主要是指汞、镉、铅、铬以及类金属砷等生物毒性显著的重金属元素。土壤、水体等环境中重金属污染可通过食物链富集而对食品安全构成威胁，在人体内积累达到一定程度，会造成慢性中毒。迄今为止，我国发生了多起重金属污染事件，因此国家出台的“十二五”规划提出对饮用水安全、重点流域水污染防治、重金属治理等一系列措施，重金属含量快速检测的需要越来越迫切。目前，国内外胶体金免疫层析法在检测重金属方面的应用比较少，只有在检测水样中的镉、铬、铜和铅有关报道，如表3所示。
胶体金免疫层析法在环境中重金属的检测应用进展
the detection heavy metals
待检重金属
镉镉铬铜铜铅铅汞
抗Cd-EDTA单抗抗Cd（Ⅱ）-EDTA单抗抗Cd-iEDTA单抗抗Cr-EDTA单抗抗铜单克隆抗体Cu2+依赖核酸酶Pb依赖核酸酶抗Pb2+-EDTA单抗抗汞单克隆抗体
Application of colloidal gold immunochromatography assay in
检测样本水水水水、血清
水水水水水
灵敏度100ng/mL5μg/L1mg/L50ng/mL75ng/mL10nmol/L500nmol/L50ng/mL0.8μg/L
参考文献[56][57][58][59][60][61][62][63]
Application of colloidal gold immunochromatography assay in
胶体金免疫层析法在检测重金属中标记抗体基本上采用都是抗重金属-EDTA螯合物单克隆抗体，如刘斌等[57]建立的快速检测环境水样中重金属镉残留的胶体金免疫层析法，灵敏度可达5μg/L。而黄婧[61]在国内外首次提出了将重金属依赖的核酸酶和胶体金免疫层析技术结合的创
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※专题论述
新思想，并研制了检测铜和铅的胶体金传感器，灵敏度为10nmol/L和500nmol/L，对环境中重金属离子的检测具有重要的借鉴研究意义。4
胶体金免疫层析法快速检测过敏原
全球性转基因食品的侵袭和过敏症发病率的逐年增高，导致食品过敏已成为重要的食品安全问题。食物中过敏原主要分为植物性过敏原、动物性过敏原、转基因食物过敏原。日常生活中常见的引起过敏反应的食物有：花生、牛奶、海产品类、蛋类。由食品或食品成分引起的危害健康的过敏反应会发生在大约1%～3%的人群和4%～6%的小孩中[64]。而且发达国家超过20%的人受过敏性疾病的困扰，因此对进口食品过敏原标签的要求越来越严格[65]。所以，开发快速、简便、灵敏、特异的过敏原成分筛查的免疫层析方法十分必要。目前，国内外检测过敏原主要采用酶联免疫吸附方法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA），利用胶体金免疫层析法检测的相关文献报道非常少，许多相关的研究尚待开展。Ji Kunmei等[66]建立了双位点单克隆抗体胶体金免疫层析法检测花生过敏原Ara h 1。其对标准花生样品的灵敏度为10ng/mL。Chen Jiajie等[67]建立了一种实用的筛查和鉴定食品中花生过敏原的检测系统，胶体金试纸条筛出阳性样本后用免疫印迹检测确认。由于食物过敏原成分在加热和加压等加工过程中可能会发生蛋白质变性，给以抗原抗体特异性反应的免疫层析检测方法带来难题，很多问题还有待解决。5
从近年来的文献报道来看，国内的胶体金免疫层析法在食品安全中的应用主要还是集中在检测兽药残留、农药残留、三聚氰胺等非法添加或过量添加方面，在天然存在的危害物质的检测方面应用相对较少。可以想象，随着技术的进步及各方对食品安全重视程度的增强，未来非法添加与滥用造成的食品安全威胁将逐步减少，而食品中天然存在的危害物质必将成为食品安全的关注点。
胶体金免疫层析技术作为一种新型的免疫学快速诊断和检测技术，具有需样微量、特异性强、操作简便、检测时间短等优点，适合基层和现场大批量快速检测。但是在实际检测应用中依然存在一些需要改进和优化的条件。首先为放大特异性抗原抗体的反应信号，增强胶体金的显色效果，可采用生物素亲和链霉亲和素系统或免疫金银染色法（immunogold silver staining，IGSS）等措施，并结合一些相应的生物传感器、电化学设备来拓
宽其检测范围。其次可采用多膜复合或单膜多元受体固定2种方式，一次检测可同时得到多组结果，节省检测时间及成本，这对于检测某些具有联检意义的物质具有很大的应用价值。此外，目前胶体金试纸条的检测结果的判断大多通过目测显色情况，只能定性或半定量检测，可能存在较大的误差。为了减小误差，迫切地需要研制出一种定量化的读取仪器。
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