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& & 大家好，我是菜鸟，实验中，在pet28a的空载体中需要进行酶切，也就 BamH1 和 EcoR1 的酶切位点，我发现这两个酶切位点挨着的，中间完全没有任何碱基连着，我知道有些挨着的可以进行双酶切，有些又不行，但是不知道我的这两个可以不，有高手曾经做过这个没？求助，做了好几天双酶切了，也用碱性磷酸酶处理了的。做出来的转化子的阴性对照始终特别高，是不是必须要逐一的做双酶切？
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严格说是不能双酶切，Takara的产品目录列举了部分限制性内切酶的保护碱基数， 1个保护碱基可能切动，2个保护碱基切没有问题。现在看来你用这两个酶双酶切 或者分步酶切效果都很差 一个建议是先一个酶切，然后补平&&再用另一个酶切，这样变成一端是粘端&&一端则是平端连接了。
方法2可以更换酶切位点，挑选其它的酶切位点做吧。
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lucly 发表于
严格说是不能双酶切，Takara的产品目录列举了部分限制性内切酶的保护碱基数， 1个保护碱基可能切动，2个保护 ...
谢谢你的回复，只是现在换酶切位点已经不太可能，我想一个切后胶回收，再做第二个酶切，然后胶回收。不知道可以不？
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分布切下来只有一个酶切保护碱基 这可能会成功 也可能不成功。因为这两个酶 在1个保护碱基的时候可能被切 也可能不被切。
至于你的方法，分步酶分 不用每步都胶回收， 可以第一个酶切后 只要PCR纯化就可以了，用胶回收太麻烦了。
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生物秀榜眼
雨落小题 发表于
谢谢你的回复，只是现在换酶切位点已经不太可能，我想一个切后胶回收，再做第二个酶切，然后胶回收。不知 ...
我一般是这么酶切的：
BamHI和EcoRI酶是哪个公司的都可以，fermentas，NEB，takara，Toyobo
buffer我用的是NEB的 3 + BSA
配好20微升的酶切体系后，载体要少，200ng足够了，然后先加BamHI，酶切两小时后，再在体系里面加上EcoRI，再酶切两个小时，不用跑胶，直接加溶胶液回收
这么酶切，成功率在66%左右，我一般挑3个克隆，有两个是对的，一个是载体，没有被酶切开
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生物秀探花
以前重组pET28a也用这两个位点，没遇到什么问题
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hehuagang 发表于
以前重组pET28a也用这两个位点，没遇到什么问题
& &&&嗯，这个酶切位点的引物设计是老板设计的，我质粒双酶切后的负对照转化子很多，连了几次几批的都是，取质粒双酶切样品跑胶发现没切干净（不是完全的一条带），所以查看图谱，发现两个挨着的，所以觉得可能不怎么好切，才用的单酶切，一个一个切的，现在正在连接，希望有好的结果，谢谢大家了
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yanlichong 发表于
我一般是这么酶切的：
BamHI和EcoRI酶是哪个公司的都可以，fermentas，NEB，takara，Toyobo
buffer我用 ...
&&我前面用的NEB& &BamHI-HF&&EcorR1-HF&&这两个酶试的，用的buffer4，没加BSA,上NEB的网站上查了的。。
谢谢你的宝贵意见。
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lucly 发表于
分布切下来只有一个酶切保护碱基 这可能会成功 也可能不成功。因为这两个酶 在1个保护碱基的时候可能被切 也 ...
& &就是就是，我的居然没有试成功，哎，都快研二了。生物真的是好悲催的专业啊！
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murongxiaoxiao大叔级摄影爱好者，喜欢分享绝对零度积极有责任心，热心公益事业yiii红米达人，爱拍照的北京女孩分子生物学技术(分子生物学,质粒,基因表达,肠杆菌) - DNA技术 - 生物秀
标题: 分子生物学技术(分子生物学,质粒,基因表达,肠杆菌)
摘要: [分子生物学技术(分子生物学,质粒,基因表达,肠杆菌)] 求助：我现在做基因表达，宿主为大肠杆菌(Escherichia coli)，质粒为pET28a。基本做法先将目的基因用Nco1 and Hind 111 处理，同时用这两个酶处理pET28a：分别回收目的片段和酶切的质粒。用T4 ligase 连接12小时或20小时，转化，筛选。整个过程我已做了十几便了，一直没有成功。迫切希望各位同仁能帮忙分析一下，我回在那一步出现问题？现在我头都做大了。 关键词:[分子生物学 质粒 基因表达 肠杆菌 酶切 目的基因 宿主]……
求助：我现在做基因表达，宿主为大肠杆菌(Escherichia coli)，质粒为pET28a。基本做法先将目的基因用Nco1 and Hind 111 处理，同时用这两个酶处理pET28a：分别回收目的片段和酶切的质粒。用T4 ligase 连接12小时或20小时，转化，筛选。整个过程我已做了十几便了，一直没有成功。迫切希望各位同仁能帮忙分析一下，我回在那一步出现问题？现在我头都做大了。
回复什么酶呀，那个公司的。再介绍详细一点，大家一起学习！回复你在酶切的时候有没有注意框架是不是正确？另外：你说的没成功到底是哪一步没成功呢？回复1.目的基因和质粒pET28a对于Nco1和Hind 111 是否真的是单酶切位点。2.质粒pET28a用Nco1和Hind 111 双酶切后,有两个片段.你是否选择了那个带有复制原点的片段。3.如果连接片段较小,我建议你用胶连.回收胶时尽量切片段浓度最高的地方.尽量切胶少一点。就是要连接片段纯度和浓度高。4.做好感受态和连接的操作过程，做胶连的话,操作动作快点。每次连接，用一环质做对照。切记。5.用新鲜的T4 ligase .如果你的载体构建设计没有问题，上面5点可以解决你的问题了.回复【1】目的基因的来源？确保能够切开！【2】用DH5alpha或JM109做宿主菌回复做感受态转化的时候有没有以空质粒做对照呀？新鲜感受态效率高，作好放过夜转化效率更高。回复什么酶呀，那个公司的。再介绍详细一点，大家一起学习！酶切用的是Nco1 与Hind111，连接用的是TAKARA的T4 连接酶回复你在酶切的时候有没有注意框架是不是正确？另外：你说的没成功到底是哪一步没成功呢？因为在酶切的每一步都要跑电泳，片段大小都与预期一致，连接以后进行转化，单转化子很少，并且也提不出质粒，转化子在加有抗性培养基中不生长。说一我不清楚是那里出的问题回复1.目的基因和质粒pET28a对于Nco1和Hind 111 是否真的是单酶切位点。2.质粒pET28a用Nco1和Hind 111 双酶切后,有两个片段.你是否选择了那个带有复制原点的片段。3.如果连接片段较小,我建议你用胶连.回收胶时尽量切片段浓度最高的地方.尽量切胶少一点。就是要连接片段纯度和浓度高。4.做好感受态和连接的操作过程，做胶连的话,操作动作快点。每次连接，用一环质做对照。切记。5.用新鲜的T4 ligase .如果你的载体构建设计没有问题，上面5点可以解决你的问题了.太谢谢你的提点，我把你说的几点回答一下，再帮我参考一下：1。是单切位点，2。双酶切后切下的片段很小，只有几十bp3我是胶回收后再连接，你能告书我胶连是怎么会事吗4能不能给我提供一个连接体系，量，时间等回复【1】目的基因的来源？确保能够切开！【2】用DH5alpha或JM109做宿主菌我用DH5alpha做宿主菌，目的基因连接在T-VECTOR上，有这两个酶切位点，我怎样才能知道酶切正确，没有乱切那回复1.保证连接T载体成功，转化到你的克隆宿主菌成功；2.载体上面有你的酶切位点，酶切后电泳直接看你的片段大小。回复Post is deleted回复三七花wroted:能不能给我提供一个连接体系，量，时间等？T载体的连接体系是这样的：2X rapid ligation buffer( T4 DNA ligase )
5ul pGEM-T or pGEM-T easy vector (50ng )
x ul *according the concentration of DNAT4 DNA ligase(3 weiss units/ ul )
1ul Deionized water to a final volume of
10ul把以上成分混合以后，室温连接一个小时，也可以4度连接过夜。回复大家争论的这么热闹呀，我也来凑凑热闹了。首先，我觉得可能和单酶切位点，还是双酶切位点，没有太大的关系。因为无论是单酶切还是双酶切，只要切开了，连上了就会长出菌来。而有两个酶切位点的后果是影响蛋白表达产物的有无。所以我觉得关键的点在于：第一：载体和目的片断是否都切开了？第二：如果没有切开，再切！！如果切开了，那么就是连接体系的问题。从这两点入手，解决问题。推荐过程：第一：目的片断扩增后先和T载体连接。T载体推荐Takara新出的Simple T 。
这个T 载体，切去了多克隆位点，用起来会比较舒服。第二：提质粒，作双酶切。胶回收试剂盒回收目的片断。第三：提质粒（表达载体），用PCR产物回收试剂盒回收切开的载体。第四：将目的片断和载体连接，T4 连接酶，过夜连接。第五：转化大肠杆菌(Escherichia coli)。第六：你先这么做吧，用到了再说。祝你好运！是的，我一直是这么做的。不过在第一步我用的是T-easy vector，也转化成功，提出了目的基因，但我已转化了几次，都没成功回复三七花wroted:能不能给我提供一个连接体系，量，时间等？T载体的连接体系是这样的：2X rapid ligation buffer( T4 DNA ligase )
5ul pGEM-T or pGEM-T easy vector (50ng )
x ul *according the concentration of DNAT4 DNA ligase(3 weiss units/ ul )
1ul Deionized water to a final volume of
10ul把以上成分混合以后，室温连接一个小时，也可以4度连接过夜。不是，我说的是酶切后的目的基因和质粒的连接回复1.保证连接T载体成功，转化到你的克隆宿主菌成功；2.载体上面有你的酶切位点，酶切后电泳直接看你的片段大小。是的，这两步与你讲的类似。不过请教一个具体问题，pET28a大约5300bp，双酶切下不到100左右，酶切后片段位置与酶切前（三条带）相比，会在那一位置。回复1.保证连接T载体成功，转化到你的克隆宿主菌成功；2.载体上面有你的酶切位点，酶切后电泳直接看你的片段大小。是的，这两步与你讲的类似。不过请教一个具体问题，pET28a大约5300bp，双酶切下不到100左右，酶切后片段位置与酶切前（三条带）相比，会在那一位置。回复是的，这两步与你讲的类似。不过请教一个具体问题，pET28a大约5300bp，双酶切下不到100左右，酶切后片段位置与酶切前（三条带）相比，会在那一位置。你是想看看用双酶切pET28a的结果吗，你可以用其它的单酶切下来比较，100bp就是小了点，它们的位置应该是相近的，如果你要与酶切前的片段（不一定是三条带哦），我觉得没意义。回复你是想看看用双酶切pET28a的结果吗，你可以用其它的单酶切下来比较，100bp就是小了点，它们的位置应该是相近的，如果你要与酶切前的片段（不一定是三条带哦），我觉得没意义。谢谢很好的建议回复求助：我现在做基因表达，宿主为大肠杆菌(Escherichia coli)，质粒为pET28a。基本做法先将目的基因用Nco1 and Hind 111 处理，同时用这两个酶处理pET28a：分别回收目的片段和酶切的质粒。用T4 ligase 连接12小时或20小时，转化，筛选。整个过程我已做了十几便了，一直没有成功。迫切希望各位同仁能帮忙分析一下，我回在那一步出现问题？现在我头都做大了。如果你常作克隆，我的建议：酶切载体和目的基因时，两个酶先、后切。中间可用乙醇沉淀，确证酶切成功。你也可通过单酶切确证位点数和酶的效力。T4和感受态的效能通过单酶切质粒，胶回收，转化来进行鉴定。找出原因，问题自然可以解决。另外，磨刀不误砍柴工。
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Hind111 与 Not1双酶切请教 急急急！！！
各位大侠好！
& & 我用宝生物的内切酶切克隆载体上的目的片段，切出来从电泳图上看好像是单酶切。我的酶切体系：20ul体系。37℃，2h。
& && && && && &&&Hind 111&&0.5ul
& && && && && && && && && &&&Not 1& &&&0.5ul
& && && && && && && && && & 0.5*K+BSA& &2ul（各1ul）
& && && && && && && && && & 重组质粒& & 2ul
& && && && && && && && && &&&ddH2O& &&&15ul
请问各位用过这两种内切酶的大侠，指点迷津，小弟毕业在即，愁得快顶不住了。
pMD18-T载体 2692bp，目的基因片段 2934bp。重组质粒5692bp。
酶切后应该显示目的条带2934bp，T载体2692bp。
HindIII和NotI双酶切缓冲液是0.5K+BSA，只是各加了1ul。
你marker最大的带是多少？2700bp和2900bp很难分的。
Marker最大是6000bp。所以感觉可能是单酶切切开了。
单切也有问题，大小有点偏大，你就楼上说的那样，用两个酶分别单酶切试试，或者用你片段内部的酶切切试试
老板一般不会轻易认同酶失效....
除非确切的证明酶已经失效了，
请问您知道怎样做对照说明么....
我已经做了 质粒 俩种酶的单酶切&&双酶切（一个先加另一个后加）
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