2×Taq PCR MasterMix_中科瑞泰（北京）生物科技有限公司
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2×Taq PCR MasterMix
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2×Taq PCR MasterMix
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500μl/5×500μl
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PCR MasterMix
● 产品包装：
注：以50μl
PCR反应体系为例，每次使用25μl 2×MasterMix，500μl可做20次 50μl PCR反应。
● 储存条件: -20℃可长期保存；4℃稳定贮存3个月。经常使用时，一旦融化后请4℃贮存，尽量避免反复冻融。
● 产品简介：
本产品包含Taq DNA聚合酶、s、MgCl2、反应缓冲液、PCR反应的增强剂和优化剂以及稳定剂，浓度为2×。使用时，只需补加实验所需的引物和模板后即可进行PCR反应，可最大限度的减少人为误差，具有快速简便、稳定性好等优点。适用于常规PCR反应、复杂模板（如GC含量高，有二级结构）的扩增以及大规模基因检测。使用该产品得到的PCR扩增产物末端含有一个A碱基，可以直接用于TA克隆。
● 质量控制：
经检测无外源核酸酶活性；PCR方法检测无宿主残余基因组DNA；能有效地扩增人基因组中的单拷贝基因。
●使用说明：
1. 冰浴中彻底融化2×MasterMix，混匀后Minispin将溶液收集到管底。
2. 按照下表在0.2ml PCR管中制备反应体系：
3. 快甩离心将反应液收集到管底。
4. PCR仪如果没有热盖加热的话，补加25μl矿物油。
5. PCR仪上执行以下程序：
*注： PCR 反应条件视模板、引物等的结构条件不同而各异。在实际操作中需根据模板、目的片段的大小、碱基序列和引物的长短等具体情况，设定最佳的反应条件（温度、时间等）。2×Taq PCR Master Mix扩增效果比较M III-DNA Marker III, 1-5000bp, 2-3000bp, 3-600bp
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PCR反应3个步骤中的变性过程所需的温度为______。
A．50～70℃
C．94～95℃ D．100℃
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提问人：匿名网友
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PCR反应3个步骤中的变性过程所需的温度为______。&&A．50～70℃&&B．72℃&&C．94～95℃ D．100℃
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确认密码：多聚酶链式反应(PCR)是一种体外迅速扩增DNA片段的技术.PCR过程一般经历下述三十多次循环:95℃下使模板 DNA变性.解链→55℃下复性→72℃下引物链延伸.下列有关PCR过程的叙述中不正确的是 A．变性过程中破坏的是DNA分子内碱基对之间的氢键.也可利用解旋酶实现 B．复性过程中引物与DNA模板链的结合是依靠碱基互补配对原则完成 C．延 题目和参考答案——精英家教网——
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（08太原市第一次测评）多聚酶链式反应（PCR）是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。PCR过程一般经历下述三十多次循环：95℃下使模板 DNA变性、解链→55℃下复性（引物与DNA模板链结合）→72℃下引物链延伸（形成新的脱氧核苷酸链）。下列有关PCR过程的叙述中不正确的是& & A．变性过程中破坏的是DNA分子内碱基对之间的氢键，也可利用解旋酶实现& & B．复性过程中引物与DNA模板链的结合是依靠碱基互补配对原则完成& & C．延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP、四种核糖核苷酸& & D．PCR与细胞内DNA复制相比所需要酶的最适温度较高
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典型的PCR由（1）高温变性模板；（2）引物与模板退火；（3）引物沿模板延伸三步反应组成一个循环，通过多次循环反应，使目的DNA得以迅速扩增。其主要步骤是：
将待扩增的模板DNA置高温下（通常为93℃-94℃）使其变性解成单链；
　　人工合成的两个寡核苷酸引物在其合适的复性温度下分别与目的基因两侧的两条单链互补结合，两个引物在模板上结合的位置决定了扩增片段的长短；
　　耐热的DNA聚合酶（Taq酶）在72℃将单核苷酸从引物的3’端开始掺入，以目的基因为模板从5’→3’方向延伸，合成DNA的新互补链。
实验过程：一、试剂准备
1. DNA模板
2．对应目的基因的特异引物（在PCR反应中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能继续按照模板DNA复制，而不能从无到有，凭空合成。这一小段序列就是你所要有设计的引物。可以是DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根据你的模板链设计。因此，扩增不同的基因需要设计不同的引物）
dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
二、操作步骤
1．在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。
&&&&&&10&PCR
buffer&&&&&&&&&&&&&&&&
（2mM）&&&&&&&&&&&&
引物1（10pM）&&&&&&&&&&&&&&&&&
　引物2（10pM）&&&&&&&&&&&&&&&&&
Taq酶（2U/μl）&&&&&&&&&&&&&&&
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　
加ddH2O至&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油。
2．调整好反应程序。将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行扩增。一般：在93℃预变性3-5min，进入循环扩增阶段：93℃
60s，循环30-35次，最后在72℃
保温7min。
3．结束反应，PCR产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存。
4．PCR的电泳检测：如在反应管中加有石蜡油，需用100μl氯仿进行抽提反应混合液，以除去石蜡油；否则，直接取5-10μl电泳检测。
三、注意事项１．PCR反应应该在一个没有DNA污染的干净环境中进行。最好设立一个专用的PCR实验室。
２．纯化模板所选用的方法对污染的风险有极大影响。一般而言，只要能够得到可靠的结果，纯化的方法越简单越好。
３．所有试剂都应该没有核酸和核酸酶的污染。操作过程中均应戴手套。
４．PCR试剂配制应使用最高质量的新鲜双蒸水，采用0.22μm滤膜过滤除菌或高压灭菌。
５．试剂都应该以大体积配制，试验一下是否满意，然后分装成仅够一次使用的量储存，从而确保实验与实验之间的连续性。
６．试剂或样品准备过程中都要使用一次性灭菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿应洗涤干净并高压灭菌。
７．PCR的样品应在冰浴上化开，并且要充分混匀。
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第二节 DNA片段的扩增――PCR技术
作者：佚名 教案来源：网络 点击数： &&&
第二节&DNA片段的扩增――PCR技术
文章来源 莲山课件 w w w.5 Y Kj.Co M &
第二节 DNA片段的扩增――PCR技术
[课标要求]
1．理解PCR的原理，讨论PCR应用。 2．尝试PCR技术的基本操作。 [知识梳理]
一．背景知识
1． 细胞内DNA复制步骤：
（1）在&&&&&&&&&&& 作用下解开DNA双链
(2 ) 在&&&&&&&&&&& 作用下，以DNA单链为模板，合成一段&&&&&&&&&&& ;（两条DNA模板链各需一个RNA引物）
(3 ) 以RNA引物为起点，在&&&&&&&&& 作用下，以&&&&&&&&&& 为原料，按照碱基互补配对原则合成两条新链。
2． 聚合酶链式反应(PCR)概念;&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 。
． PCR过程与细胞内DNA复制过程区别：
（1）引物是人工合成的&&&&&&& 单链，２０－３０个脱氧核苷酸，而不是RNA。
(2)& 解旋通过对反应&&&&&&& 的控制来实现而不依靠&&&&&&&&&& &&&。
4．PCR过程：
(1) 将PCR缓冲液、&&&&&&&&& 、一对引物、四种&&&&&&&&& 、DNA聚合酶、Mg2+等成分加入到特制的微量离心管中。
(2) 高温变性：&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 。
(3) 低温复性：&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& &&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 。
(4) 中温延伸：&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 。
二． 实践案例 1．PCR实验虽然原理复杂，但操作十分简单，因为生物制剂公司已把PCR缓冲液、DNA聚合酶、脱氧核苷酸贮备液等组分配成了PCR试剂盒，实验人员仅需加入模板DNA及引物即可，所以快速、高效、灵活和易于操作是PCR技术的突出优点。 2．材料用具 略 3．活动程序 (1) 加入各种试剂，混合，离心10s，放入PCR仪中。
&(2) 扩增循环，在PCR仪上设置好PCR热循环程序：
注：反应产物在4℃保存 4．检测扩增效果 （1）稀释样品10倍 （2）以H2O作对照，在波长260nm处，将紫外分光光度计读数调到零。 （3）加入到厚度为1cm的比色杯中，测定260nm处的光吸收值 （4）DNA浓度（μg/mL）=（A260nm/0.02）×稀释倍数 三．探究活动 &PCR实验虽然操作简单，但实验设备及药品价格较高，可以利用自己准备的简易材料，设计并进行PCR技术的模拟实验操作。 &四．PCR技术意义 PCR能&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& ，从而有效地解决了因为样品中DNA含量&&&&&& 而难以对样品进行分析研究的难题，大大提高了对DNA分子的分析和检测能力，被广泛应用于&&&&&&&&&&& 、基因序列分析、遗传病诊断，古生物学研究以及形侦破案、亲子鉴定等。
五．小知识：
1．DNA的两条链是反向平行的，为了明确地表示DNA的方向，通常将DNA的羟基(-OH)末端称为5’端。DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3’端延伸DNA链。但DNA合成的方向是从子链的5’端向3’端延伸。
2．引物是一段RNA，它能与DNA母链的一段碱基序列互补配对。用于PCR的引物长度通常为20―30个核苷酸。
3．在80&C―100&C的温度范围内，DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性。当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNA链又会重新结合成双链。
[复习指导]
本节课复习要注重细胞内DNA复制过程和体外DNA片段的扩增――PCR技术的过程，运用DNA复制过程原理相同的方法，明确体外DNA片段的扩增――PCR技术在基因克隆、基因序列分析、遗传病诊断，古生物学研究以及形侦破案、亲子鉴定等方面的地位和作用。如何在体外创设细胞内DNA复制的条件是PCR技术的关键，细胞内的各种条件实际上是利用PCR仪来模拟的。PCR仪原理复杂，操作简单。
[典例解析]
1.PCR过程与细胞内的DNA复制过程相比，主要有两点不同，它们是（&& ）
①PCR过程需要的引物是人工合成的DNA单链
②PCR过程不需要DNA聚合酶
③PCR过程中DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的
④PCR过程中，DNA不需要解旋，直接以双链DNA为模板进行复制
&&&& A． ①②③④&&&&&&& B． ①②&&&&&&&&&& C．①③&&&&&&&&& D．②④
[解析] PCR过程与细胞内的DNA复制过程相比，主要有两点不同。第一，PCR过程需要的引物不是RNA，而是人工合成的DNA单链，其长度通常为20－30个脱氧核苷酸。第二，PCR过程中，DNA解旋不依赖解旋酶，而是通过对反映温度的控制来实现的。
&[答案] C。
2．在PCR扩增前，需要将下列哪些物质加入微量离心管中？（&& ）
①模板DNA ②模板RNA ③DNA解旋酶 ④耐高温的DNA聚合酶 ⑤引物& ⑥PCR缓冲液 ⑦ 脱氧核苷酸贮备液 ⑧ 核苷酸贮备液
A．①④⑤⑥⑦&&&&&&&&&&&&&& B．①③④⑤⑥⑧
&C．②③④⑤⑥⑦&&&&&&&&&&&& D．①④⑥⑦⑧
[解析] 进行PCR过程前，将PCR缓冲液、DNA模板、一对引物、四种脱氧核苷酸、DNA聚合、Mg2+等成分加入到一种特制的微量离心管中。
文章来源 莲山课件 w w w.5 Y Kj.Co M
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