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摘要 : SDS是一种阴离子去垢剂，化学名十二烷基苯磺酸钠，由于在高温条件下能裂解细胞并与细胞中多糖结合而被作为提取物质被广泛使用。SDS法提取主要应用于植物DNA的提取和质粒提取，本文对这两个实验操作步骤进行讲解。
SDS是一种阴离子去垢剂，化学名十二烷基苯磺酸钠，由于在高温条件下能裂解细胞并与细胞中多糖结合而被作为提取物质被广泛使用。SDS法提取主要应用于植物和质粒提取，本文对这两个实验操作步骤进行讲解。
SDS法提取植物
本方法由Dellaporta,Wood和Hicks(1983)的方法修改而成。其基本原理是研磨的用热的SDS裂解后，加入高浓度的KAc，0℃放置以除去蛋白和多糖类杂质，最后用乙醇或异丙醇沉淀。
一、材料试剂和
1 材料 新鲜的组织材料或-80℃冻存的材料
Tris-HCl 100mmol/L(pH8.0)
50mmol/L (pH8.0)
NaCl 500 mmol/L
灭菌后加&-巯基乙醇至10 mmol/L
(2)裂解液20%
(3)高盐溶液5mol/L KAc
(4) RNaseA 10mg/ml
(5) 异丙醇
(6)灭菌ddH2O或TE
3. 仪器: 离心机， 恒温水浴, 台式高速离心机，电泳装置
二、实验步骤
1取幼嫩的组织材料1-2g,用蒸馏水冲洗干净，再用灭菌ddH2O冲洗2次，放入经液氮预冷的研钵中，加入液氮研磨至粉末状，用干净的灭菌不锈钢勺转移粉末到加有500&L提取液的离心管中,轻轻混匀。
2 向管中加入50&L20%SDS溶液，混匀，不可过于强烈震荡以防基因组DNA断裂 ，65℃保温10min，并不时摇动。
3 加入150&L 5mol/L KAc，混匀，置冰上20-30 min。
4 4℃,15 000rpm离心15min,转移上清到另一离心管中，加入0.7V的异丙醇，混匀，-20℃沉淀30 min 。
5 12 000rpm离心10min回收基因组DNA沉淀，吹干后加入适量的灭菌ddH2O或TE溶解DNA。
6 加入1/10体积的RNaseA，37℃保温20min，除去RNA。
7 CI抽提后，加2V乙醇，-20℃沉淀30 min 。12 000rpm离心10min回收基因组DNA沉淀。
8 用400&L 70%乙醇洗一次后，吹干，加入适量的灭菌ddH2O或TE溶解DNA。
9 电泳检测完整性。
三、结果分析
1. 用紫外分光光度计在230nm、260nm、 280nm和310nm波长分别读数。其中260nm用琼脂糖凝胶电泳(0.8%)检测核DNA的完整性。完整性好的基因组DNA应是一条比23Kb滞后的电泳带, 若降解则成为弥散状。电泳前缘为未除干净的RNA。
2.如果DNA沉淀呈白色透明状而且溶解后成粘稠状，说明DNA含有较多的多糖类物质，可以在取材前将植物放暗处24hr，以达到去除淀粉的目的。
3. DNA沉淀呈棕色，难以酶切
植物材料含有大量酚类化合物，与DNA共价结合，使DNA呈棕色，并抑制DNA的酶解反应。为防止此情况出现，可在加入2 &CTAB的同时加入2-5%的巯基乙醇，或者加入亚精胺(100&l DNA加5&l 0.1mol/L的亚精胺)。
4.DNA中含有多糖或盐类
将DNA用100%乙醇或异丙醇沉淀出来，离心，沉淀用70%乙醇清洗两次或更多次，吹干后重溶于TE中。(注意乙醇一定要吹干, 否则电泳点样时, 样品上漂)
5.DNA已降解电泳条带呈弥散状
样品降解可能有两种情况：一是机械振动过剧烈，二是操作过程中DNase污染。在提取DNA的各个操作过程中要避免剧烈振荡，提取液及用品要高温高压灭菌。另外，使用Tip头吸取过程中应避免产生气泡，Tip头应剪去Tip头尖，避免反复冻融DNA。
SDS裂解法提取大量质粒
本法的产量低得多，但却比其他方法更温和，是提取大质粒(大于15kb)的首选方法。
试验步骤：
1. 将500ml细菌沉淀物洗过后重悬于10ml用冰预冷的10%蔗糖、50mmol/L Tris.Cl(pH8.0)溶液中，将悬液移至30ml的带盖螺口塑料试管中。
2. 加入2ml新配制的溶菌酶溶液[10mg/ml,溶于10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)]。当溶液的pH值小于8.0时，溶菌酶不能有效地发挥作用。
3. 加8ml 0.25mol/L EDTA(pH8.0), 将管倒置数次以混匀悬液，在冰上放置10min。
4. 加4ml 10% SDS，用玻棒迅速混匀内容物，使SDS均匀分散到整个细菌悬液中，操作应尽可能温和小心，以便最大限度地避免释放出来的DNA受到剪切。
5. 立即加入6ml 5mol/L NaCl(终浓度为1mol/L)， 再次用玻棒温和彻底地混匀内容物，在冰上放置至少1h。
6. 以4℃[用Beckman Ti50型转头(或与其相当的转头)]，30 000rpm离心30min，小心将上清转移到一个50ml的一次性塑料离心管中，弃去沉淀物。如果细菌碎片未能全部除尽，可用35 000rpm再离心20min，将上清转移到另一管中，去掉存在离心管内的粘稠状液体。
7. 上清分别用酚/氯仿和氯仿各抽提1次。
8. 将水相转移到250ml的离心瓶中，于室温加入2倍体积的(约60ml )乙醇，充分混匀，室温下放置1-2h。
9. 以4℃，5000rpm离心20min，回收核酸。
10. 离心管倒置于纸巾上，使最后残存的乙醇流干，在真空干燥内短时间干燥沉淀物，但不要使之完全干燥。
11. 用3mlTE(pH8.0)溶解DNA。
最后，大家要注意的是，植物基因组DNA提取中，各个操作步骤都要避免剧烈振荡，避免反复冻融DNA。SDS法是提取大于15kb的质粒首选方法，要注意在真空干燥沉淀物时，不能使其完全干燥。
作者：keeii 点击：次
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法医实验室几种常用DNA提取方法及比较
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3秒自动关闭窗口DNA的粗提取与鉴定
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DNA的粗提取与鉴定
作者：佚名 教案来源：网络 点击数： &&&
实验十一&&DNA的粗提取与鉴定
文 章来源 莲山 课 件 w w w.5Y k J. c oM 第六章 遗传和变异
实验十一& DNA的粗提取与鉴定
目的　　1、初步掌握DNA的粗提取和鉴定的方法　　2、观察提取出来的DNA物质
实验原理　　1、DNA在NaCl溶液中的溶解度，是随着NaCl的浓度的变化而改变的。当NaCl的物质的量浓度为0.14mOl／L时,DNA的溶解度最低。利用这一原理，可以使溶解在NaCl溶液中的DNA析出。　　2、DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精溶液。利用这一原理，可以进一步提取出含杂质较少的DNA。　　3、DNA遇二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。
注意事项　　1、步骤3析出含DNA的黏稠物中，蒸馏水要沿烧杯内壁缓缓加入，不能一次快速倒入。　　2、实验中有多个步骤都要用玻璃棒进行搅拌，但是在不同的步骤中玻璃棒的用法不同。实验用具　　鸡血细胞液（5～10mL）；体积分数为95％的冷酒精，蒸馏水，质量浓度为0.1g／mL的柠檬酸钠溶液，物质的量浓度分别为2mol／L和0.015mol／L的NaCl溶液，二苯胺试剂；烧杯（100mL，1个， 50mL， 500mL，各2个），漏斗，试管（20mL，2个），玻璃棒，滴管，量筒（100mL，1个），纱布，镊子，滤纸，铁架台，铁环，三角架，酒精灯，石棉网，载玻片，试管夹。课时安排　
一课时课前准备& &&制备鸡血细胞液，方法是：将质量浓度为0.1g／mL的柠檬酸钠溶液100mL，置于500mL烧怀中，注入新鲜的鸡血（约180mL），用玻璃棒搅拌，使其充分混合，以免凝血。静置于冰箱内一天，使血细胞自行沉淀。也可以用离心机离心2 min（转速1000转/分）。用吸管吸去上清液。板书
实验十一 DNA的粗提取与鉴定
实验原理&&& 1、析出溶解在NaC1溶液中的DNA。&&& 2、用冷酒精提取出含杂质较少的DNA。&&& 3、DNA在沸水浴时被二苯胺染成蓝色。方法步骤：　　1、提取鸡血细胞的细胞核物质：顺时针方向搅拌，稍快，稍重。 5 min　　2、溶解细胞核内的DNA　　3、析出含DNA的黏稠物：蒸馏水300mL，逆时针方向搅拌，缓慢　　4、过滤：取黏稠物　　5、再溶解：顺时针方向搅拌，较慢。3 min　　6、过滤：取滤液。　　7、提取出含杂质较少的DNA，逆时针方向搅拌，稍慢。5 min　　8、DNA的鉴定：沸水浴5min（（１）无变化（２）蓝色）
上节课我们通过几个验证性实验，证明了DNA是主要的遗传物质。那么DNA是什么样的物质呢？今天我们就通过实验将它提取出来，进行观察和鉴定。　& 通过预习，我们知道选用鸡血细胞液作为实验材料。在制备鸡血细胞液时，所用的柠檬酸钠有防止血液凝固的作用。　　
制备过程中，一定要用刚宰杀的鸡的新鲜血，并且要与抗凝剂充分混合，防止凝血。我们采用静置一天的方法，获得鸡血细胞液。　　大家在动手做实验之前先要明确几个需要注意的问题。　　1、要严格按照实验指导的方法步骤去操作。　　2、实验中有多个步骤都要用玻璃棒进行搅拌，使用时玻璃棒不要碰到烧杯底，在不同的步骤中玻璃棒的用法不同，每一步的用法参照黑板上的指导去操作。　　3、在DNA的鉴定中，所用的二苯胺是一种有毒性的试剂，大家在使用时注意不要让药液接触到皮肤或身体的其他部位，也不要近距离观察。　　下面在实验进行过程中，要思考每一操作步骤要达到什么目的。　　在进行步骤1时，利用搅拌的5分钟，做如下提问：　　为什么要加蒸馏水？加入蒸馏水后细胞将会怎样？　　（让细胞内溶液的浓度大于周围溶液的浓度，细胞会吸水以至胀破）　　为什么要用力搅拌？　　（可以加速血细胞和细胞核的破裂）　　所以下一步骤过滤将滤去的是细胞膜和核膜等物质。　　在进行步骤3时，要向全班明确：这一步骤是这个实验成败的关键，注意加蒸馏水的方法和使用玻璃棒的方法，千万不能太快太猛，防止打碎DNA。　　观察滤取出来的黏稠物的颜色。
有的同学提取的黏稠物较少，原因可能是在溶解DNA时不充分，也可能是析出黏稠物时搅拌的快了。　　将黏稠物再溶解时一定要充分，多搅拌。以免有DNA损失。　　加入冷酒精时动作要慢。　　当玻璃棒上出现丝状物缠绕时，继续慢慢搅拌。至不再增加时，取出吸干上面的水分。仔细观察丝状物呈什么颜色？（黄色）　　这些丝状物要用二苯胺鉴定。使用二苯胺时要注意不要接触到药液。进行沸水浴时，在实验室较为通风的地方集体进行。　　利用沸水浴的5 min。　　步骤3中加入蒸馏水的目的？与步骤1有什么区别？　　（步骤3中加蒸馏水是使NaCl溶液的浓度逐渐降至0．14mol／L，使DNA的黏稠物析出。而步骤1加蒸馏水是为了让细胞吸水胀破）　　步骤7为什么要加50mL的冷酒精？　　（因为DNA不溶于冷酒精，而其他物质可以溶解在酒精中，使含杂质较少的DNA丝状物可以析出。悬浮于溶液中）　　现在大家从水浴锅中拿出试管，比较两个试管中溶液的颜色有什么不同？　　（有丝状物的试管变成蓝色，另一试管还是原来颜色）　　这一鉴定结果说明什么问题？　　（提取出的丝状物是DNA）　　那么你看到的丝状物的粗细是不是DNA分子的直径呢？　　（不是。DNA分子直径只有2nm。丝状物是多个DNA分子聚在一起形成的）　　下面请同学们将实验用具，按原样摆放整齐，实验桌要保持清洁。
　　今天我们通过实验将DNA提取出来进行了观察和鉴定，那么DNA的化学组成，分子结构和复制是怎样的？我们下节课再继续研究。
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