为什么基因测序失败?都提纯了基因,跑了电泳有结果,测序上游引物有成功,下游引物却没有?为什么?
【爆】_oh6
1、你测的是片段?引物是自己设计的吗?下游测不出来有可能是引物不佳.之前是否用此引物测过?2、你的片段多长?必须双向测通吗?如果必须双向的话,不妨连接载体,比如T载体什么的,然后提质粒出来,用载体上的通用引物测,会好一些.3、实在无法解决,可以让测序公司根据上游的测序结果自行设计引物,多测几个反应,直到测通.这样费用要高一些.
是双向测通，以前没用过，如果下游引物不佳，为什么还能扩增，跑出电泳呢？如果是测序公司的原因也有可能吧？你的建议蛮好的，连接T载体。
看来你是用PCR引物直接做测序引物了。虽然很多情况下的确可以通用，但是不排除有时候不能的情况...测序引物要求纯度高，而且退火温度比PCR严格些。还是用通用引物测最省事，涂板摇菌也不耽误多少时间...
通用引物和自己设计的那引物测序有什么不同么？为什么不都用通用引物呢？
通用引物都是经过很多次验证的，肯定能够测出来的。而PCR引物根据基因的不同，每个都不一样，仅验证了PCR能够成功，但测序并未验证过，所以成功率肯定比不上通用引物。
测序引物对Tm、GC%、长度、同源性、二级结构、纯度等指标上都比PCR引物严格，比如你的引物Tm在65度，55度退火一样能P出条带，但是测序就不行了。所以有时会出现能P出来但测不出的情况。
“为什么不都用通用引物呢”，呃，反正我们实验室测序90%都是用通用引物，自己设计引物的时候极少...能用的时候肯定用的...
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扫描下载二维码PCR有杂带怎么办?我的PCR做出来有很多杂带,而且很亮,目的条带却很暗,阳性对照没问题,能批出来,说明引物没问题,到底是怎么回事?
梦魇My3325
在你现有的退火温度上各增加三度,降低三度,都去试一下先；如果杂带的长度比目的带长的话,就适当缩短退火和延伸时间.
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可以提高温度试试
总的来说，是引物特异性不好，你的引物是不是太短了？提高退火温度试试，1度1度提升另外，试试热启动，低温下容易生成非特异条带，第一个循环还是很重要的。
1. raise annealing temperature.2. try new primer(s).
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标题: 测序正确，但是蛋白不表达
摘要: [测序正确，但是蛋白不表达] 我在pET28a载体上连了一段300bp的序列，转入BL21（DE3）中，测序结果正确，我用1mM IPTG，37度诱导5个小时，吸了40微升菌液和10微升上样buffer一起煮5分钟，电泳结果没有看见目的蛋白的条带，目的蛋白理论大小为13000。我又从别的实验室要了BL21（DE3）和pET28a 关键词:[载体 蛋白不表达 测序 序列 测序结果 目的蛋白 条带 蛋白质]……
我在pET28a载体上连了一段300bp的序列，转入BL21（DE3）中，测序结果正确，我用1mM IPTG，37度诱导5个小时，吸了40微升菌液和10微升上样buffer一起煮5分钟，电泳结果没有看见目的蛋白的条带，目的蛋白理论大小为13000。我又从别的实验室要了BL21（DE3）和pET28a，重新连接转化还是不表达，请各位高手帮忙分析原因，出谋划策，谢谢！回复
一般来说没有原因。
换载体可能是最快捷的方案。
换表达系统是最后要尝试的方案。
不表达原因很多，诱导条件，温度，对宿主细胞的毒性，偏好性，还有很多说不清楚的原因。做表达好比买彩票，有一定的几率，要尝试各种条件。你只买了一张，没中也很正常。
楼上的两位版主说的很有道理，蛋白质研究之所以困难就是因为每一个蛋白的情况都不同。建议你让身边的蛋白质研究高手先看看你的设计和测序结果有没有问题，如果没有的话可以先简单的尝试优化条件（多挑几个克隆、更换不同的培养基、改变诱导试剂、尝试不同的诱导剂浓度等等），如果最终还是没有表达的话就更换载体吧。
关于稀有密码子什么的就不说了，估计大家都知道。还有比较重要的是mRNA的二级结构，如果转录出的mRNA在N端有较大的发夹结构，而且能量超过一定值（具体多少一时想不起来），也是很难翻译的。
既然已经构建出来了，先尝试各种诱导表达条件比较重要。诱导的OD值，温度，IPTG浓度都要试。我们实验室曾经碰到过需要OD在1.5以上诱导才表达的。还有你只是用菌液去跑电泳，也不是特别精确。有时候你的蛋白表达量低，可能需要培养几百ml，然后纯化后，再去跑电泳才能看到条带。
可能你把楼上的这几位说的方法都试过了，还是不能表达。
我就遭遇过了。
哎，惨不忍睹啊。
连全基因合成都用了啊……
每想及此，焦灼不堪！
换载体试试吧
100多个氨基酸的序列，不表达的可能性很小。
诱导条件其实非常宽泛，一般不必细细摸索。
如果没有低级错误的话（12%的胶可能看不见这么小的蛋白），换载体可能会有一定的效果。
找一下同源蛋白的表达条件应该是最快捷的方式了。
本人也有类似经历，测序结果正确就是不表达。建议不要再分析了，直接换载体。
呵呵，都是同道中人啊，大家说的对极了，换载体才是最实在的，不过换之前最好测一下空载体是否好用，就是只诱导空载体表达一下标签，有了再插入目的序列
想请问最后换的什么载体，表达出来了没有呢？
本人也遇见过同样的问题，pet28a及pet30a都表达不出来，后来换了载体pGEX，表达成功。建议你也换载体。不知有无进展？
我觉得楼主上样量比较少，应该100ul菌液离心后用10ul 1*的上样缓冲液裂解后上样比较好比较
换了pET32a，终于表达出来了，而且相当给力！
本人也遇见过同样的问题，pet28a及pet30a都表达不出来，后来换了载体pGEX，表达成功。建议你也换载体。不知有无进展？
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多谢关心，换了pET32a，表达出来了
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为什么自己跑出条带了，送去华大测序又说没跑出条带，不能测序？
难道是降解了？
如果是这样 要怎么解决？
pcr 未纯化
那怎样提高浓度？
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