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【求助】各位朋友，激光共聚焦显微镜拍的照片用什么软件查看啊？
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这个帖子发布于3年零11天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
会的朋友麻烦指导一下，不胜感激！
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hbchendl .lif格式是徕卡激光共聚焦显微镜的数据文件，包括了图片及其他拍摄条件数据。可以回到显微镜的电脑上打开然后把图片提取出来。原来是leica 拍的图片 感谢陈老师的指点一直用leica 拍的都是 lei 格式的文件可能与机器型号有关顺便查了一下常见confocal 数据文件的格式zeiss：.lsmleica：.lei，.lifnih：.rawfuji：.infnikon：.ics，.nd2oiympus：.oif，.oib没见过的还望各位补充btw 这个文件可以试试用IPP能不能打开
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confocal 都有配套软件可以导出图片 选择TIF格式导出即可否则需要专业软件打开
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看文件后缀。专业软件会保留许多信息。加标尺比较方便。
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小弟不太会用，直接把文件从显微镜的电脑上拷回来了，后缀是.lif的文件，用了很多软件都不行
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你这个格式有点怪 确定没有自行修改或软件错误？是什么机器？
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.lif格式是徕卡激光共聚焦显微镜的数据文件，包括了图片及其他拍摄条件数据。可以回到显微镜的电脑上打开然后把图片提取出来。
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hbchendl .lif格式是徕卡激光共聚焦显微镜的数据文件，包括了图片及其他拍摄条件数据。可以回到显微镜的电脑上打开然后把图片提取出来。原来是leica 拍的图片 感谢陈老师的指点一直用leica 拍的都是 lei 格式的文件可能与机器型号有关顺便查了一下常见confocal 数据文件的格式zeiss：.lsmleica：.lei，.lifnih：.rawfuji：.infnikon：.ics，.nd2oiympus：.oif，.oib没见过的还望各位补充btw 这个文件可以试试用IPP能不能打开
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新版的IPP7.0与IPP9.0能够打开.lif文件。D版的IPP6.0就别想了。
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hbchendl 新版的IPP7.0与IPP9.0能够打开.lif文件。D版的IPP6.0就别想了。D版的ipp6能打开olympus的oib格式的文件。呵呵
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多谢各位老师的解答！学生不胜感激！
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imagej装biofomat插件后都可打开。
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hbchendl .lif格式是徕卡激光共聚焦显微镜的数据文件，包括了图片及其他拍摄条件数据。可以回到显微镜的电脑上打开然后把图片提取出来。解决了，谢谢老师！
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用Iimaris打开lsm图片gallery视图都是黑的 怎么弄啊 3D视图可以看到图片，但是我要看单张的。
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关于丁香园关注今日：62 | 主题：462817
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【求助】激光共聚焦
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这个帖子发布于9年零291天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
前辈，我还有个问题，我作成骨细胞的培养及鉴定，现在细胞养出来了，可是鉴定结果不理想，导师建议让我用激光共聚焦显微镜检测，可是我不太懂这方面的技术，请给我个建议贝，我该怎么设计啊，做一型胶原的荧光染色可以吗？但细胞纯度可以从这定量分析吗？
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激光扫描共焦显微镜技术及应用（转）l
样品要求：1.经荧光探剂标记(单标、双标、三标）2.固定的或活的组织3.固定的或活的贴壁培养细胞(Confocal专用小培养皿，盖玻片)4.悬浮细胞，甩片或滴片后，用盖玻片封一.
组成倒置或直立荧光显微镜、扫描头(照明针孔、探测针孔、荧光滤片系统、镜扫描系统和光电倍增管)、扫描头控制电路、计算机和图像输出设备二. 原理
Confocal 利用放置在光源后的照明针孔和放置在检测器前的探测针孔实现点照明和点探测，来自光源的光通过照明针孔发射出的光聚焦在样品焦平面的某个点上，该点所发射的荧光成像在探测针孔上，该点以外的任何发射光均被探测针孔阻挡。照明针孔与探测针孔对被照射点或被探测点来说是共轭的，因此被探测点即共焦点，被探测点所在的平面即共焦平面。计算机以像点的方式将被探测点显示在计算机屏幕上，为了产生一幅完整的图像，由光路中的扫描系统在样品焦平面上扫描，从而产生一幅完整的共焦图像。只要载物台沿着Z轴上下移动，将样品新的一个层面移动到共焦平面上，样品的新层面又成像在显示器上，随着Z轴的不断移动，就可得到样品不同层面连续的光切图像 。三. 激光扫描共焦显微镜的设计特点:1.点照明2.具有照明pinhole和探测pinhole3.照明pinhole和探测pinhole共轭(共焦), 共焦点即被探测点，被探测点所在的平面为共焦平面4.具有扫描系统—— 逐点扫描成像 5.具有多个（四个） 荧光通道，可同时探测多个被标记物 l
Leica TCS NT 的技术指标 1. xy分辨率比传统显微镜小1.4x传统显微镜: Rxy=0.61l/NAConfocal: Rxy=0.4l/NA2. 样品的最大厚度:大约 2mm(10X/0.2物镜)取决于三点: 物镜的景深, 与NA成反比Z轴的最大移动范围 激光的穿透力3. 样品的最小光切厚度: 大约0.35 mm 取决于两点: 物镜的数值孔径NAZ轴的最小移动步距: 40nm
Z轴的分辨率: 0.35 mm 4. 激光器 Kr/Ar激光器: 477nm, 488nm, 568nm, 647nmAr激光器(UV): 361nmo
激光器的特点:1) 方向性好: 激光基本眼直线传播2) 单色性好
l=10-8nm3) 高亮度: 激光方向性好, 其在空间上的能量分布是高度集中的4) 偏振性: 激光为平面偏振光, 光纤耦合5. 四个荧光通道, 一个透射光通道, 即除了可同时采集多标记荧光图像外还可以同时采集透射光图像,但透射光图像为非共焦图像4. 激光器 Kr/Ar激光器: 477nm, 488nm, 568nm, 647nmAr激光器(UV): 361nmo
激光器的特点:1) 方向性好: 激光基本眼直线传播2) 单色性好
l=10-8nm3) 高亮度: 激光方向性好, 其在空间上的能量分布是高度集中的4) 偏振性: 激光为平面偏振光, 光纤耦合5. 四个荧光通道, 一个透射光通道, 即除了可同时采集多标记荧光图像外还可以同时采集透射光图像,但透射光图像为非共焦图像四. 共焦显微镜的类型：1.点(慢)扫描共焦显微镜: 分辨率高, 图像清晰; 噪音低; 采集图像速度慢;目镜中观察不到共焦图像2.线(狭缝)扫描共焦 显微镜(video rate) 分辨率低; 噪音高; 扫描速度快 240幅/秒; 目镜中可观察到共焦图像3.Nipkov转盘式扫描共焦显微镜 性能介于上述两者之间l
功能1.多荧光标记样品的图像采集2.无损伤、连续光学切片，显微“CT”3.真正的三维重组4.假三维图的显示5.可沿Z轴（xy平面）和Y轴（xz平面）方向进行光切6.定量分析7.xyt 、xzt、xyzt 和 xt 扫描—— 时间序列扫描8.图像处理9. 旋转扫描10.区域扫描11.光谱扫描 激光扫描共焦显微镜技术的应用应用 ：o
定位、定量o
动态测量¨ 活细胞或组织内游离Ca2+浓度的测量¨ 活细胞内H+浓度（ pH值）的测量¨ 自由基的检测¨ 药物进入细胞的动态过程、定位分布及定量 o
细胞膜电位的测量o
荧光漂白恢复（FRAP）的测量o
笼锁解笼锁的测量o
荧光能量共振转移（FRET）的测量o
其他应用一.定位、定量o
免疫荧光标记（单标、双标或三 标）的定位、定量如：细胞膜受体或抗原的分布，微丝、微管的分布、 两种或三种蛋白的共存与共定位、蛋白与细胞器的共定位o
细胞凋亡: AnnexinV-fitc + PIo
末端原位杂交-fitc + PIo
荧光原位杂交： 染色体基因定位o
单细胞凝胶电泳o
GFP的表达o
游离Ca2+ 的分布与定量o
定位、定量研究中常用荧光探针1.Amine-Reactive Probes与抗体耦联、与配体耦联、与肽耦联、与人工合成的寡聚核苷酸耦联的探针，可用于免疫组化、荧光原位杂交、受体标记等FITC (fluorescent isothiocyanate) BODIPY FL 503/512异硫氰基荧光素 494/518TRITC 四甲基异硫氰基罗丹明 544/572 BODIPY TMR 543/569Texas Red 德州红 595/615 BODIPY TR592/618PE 藻红蛋白 565/578 cy3 490/530cy5 650/6901)细胞表面抗原、胞内某种蛋白免役荧光标记： 与抗体耦联, 直标: 一抗+荧光探针间标: 二抗+荧光探针如: 微管蛋白 抗 tublin抗体+荧光探针肌动蛋白 Palloidine+荧光探针2)细胞膜表面受体
配体+荧光探针如: nAchR、mAchR、多巴胺受体(D1,D2)标记 Gm1: 霍乱毒素受体 霍乱毒素+FITC2.标记细胞器荧光探针1)线粒体 MitochondriaRodamin 123 505/534 ，可染活细胞，阳离子性,可检测线粒体膜电位, 且在多数细胞中停留时间短JC1 线粒体膜电位低时为单体 490/527 发绿光线粒体膜电位低时为多聚体 490/590 发红光可标记活细胞线粒体，且为检测线粒体膜电位最佳探针Mitotracker Green FM 490/516, 染活细胞或固定细胞 ,稳定不漏出Mitoracker Orange CMTMRos 551/576, (氧化型)Mitoracker Orange 还原型, 只能染活细胞 2)溶酶体 Lysosome中性红 541/640: 微偏碱性, 可标记溶酶体等酸性器官为非特异性AO : LysoTracker Green DND-26 504/511, 染活细胞LysoTracker BlueLysoTracker Red3)内质网 Endoplasmic ReticulumDiOC6 484/500: 非特异性, 较高浓度标记内质网,较低浓度标记线粒体4)高尔基体 Golgi apparatusNBD C6-ceramie 466/536, 可染活或死细胞 ¨细胞器的单克隆抗体5)细胞核PI propidium iodide 536/617 DNA/\RNA 死细胞碘化丙啶EB ethidium bromide 518/617 DNA/RNA 死细胞Hochest 1 DNA A-T 活细胞Hochest 33258 (同上)DAPI 358/461 DNA A-T 半通透细胞Chromomycin A3 450/470 DNA G-CAO 500/526 DNA 活细胞460/650 RNATOTO-1 514/533 DNA
死细胞SYTO 活细胞3. GFP 绿色荧光蛋白GFP的的发现：60年代，Shimomura等首先从水母中分离出一种水母发光蛋白(aequoren)，该蛋白与钙和肠腔素结合后可产生蓝色荧光。然而水母整体几提取的颗粒都呈绿色，后经证实在水母体内还存在另外一种发光蛋白即绿色荧光蛋白 GFP, 后经研究表明，在水母体内Ca2+和肠腔素与水母发光蛋白结合后，水母发光蛋白产生蓝色荧光，GFP在蓝光的激发下，产生绿色荧光 。将外源基因与GFP DNA 相连, GFP可作为外源基因的报告基因实时监测外源基因的表达.GFP主要应用: 对活细胞中的蛋白质进行准确定位及动态观察如: 可实时原位跟踪特定蛋白在细胞生长、分裂、分化过程中的时空表达GFP基因与分泌蛋白基因连接后转染细胞, 可动态观察该分泌蛋白分泌到细胞外的过程GFP基因与定位于某一细胞器特殊蛋白基因相连,就能显示活细胞中细胞核、内质网、高尔基体、线粒体等细胞器的结构及病理过程l
定位与定量测量应注意的问题定位：1.可以对图像进行修饰，2.pinhole 可尽可能的小。3.确认共定位时要取两个通道荧光相互干扰的对照图像定量：1.仪器的各个条件必须一致2.必须用原始图像进行定量测量3.Pinhole尽可能的大二.显微CT与三维重组光切的层数：
VoxelsizeZ ? 2VoxelsizeX三.动态测量l
Physiology:细胞内离子动态变化测量1).游离Ca2+测量检测游离Ca2+变化荧光探针的原理：这类探针多为Ca2+螯合剂，不与Ca2+结合时不发荧光，通常也不能进入细胞膜，只有与乙酰甲酯AM相连方可进入细胞内，被细胞内酯酶水解后并与胞内游离钙结合后发出荧光。Kd值为Ca2+解离常数，表明检测Ca2+浓度的范围:0.1xKd-10xkd, Kd和很多因素有关，如pH、 Mg2+、与蛋白的结合、温度等。细胞内生理Ca2+浓度值(10-100n M)，细胞内Ca2+超载浓度值（基础Ca2+浓度的10倍左右）
荧光探针 激发波长
发射波长 KdFLuo3-AM, K+, dextran 506nm
525nm 390nM
Calcium Green-1 507nm
530nm 190nMCalcium Green-2
535nm 550nMFura red
637nm 140nMOregon Green 488
20,000nMCalcium Crimson
602nm 328nMIndo-1
356nm 405/458nm 230nMFura-2
340/380 476nm 145nMl
DF/F=(F-Fbase)/(Fbase-FBG)l
Ca2+浓度绝对测量l
单波长公式法Fluo3: 530nm Kd=450nM[Ca2+]I =Kd(F-Fmin)/(Fmax-F)Fmin: 细胞内无钙时的荧光强度( MnCl2)Fmax：细胞内钙饱和时的荧光强度(A23187)o
测量时切记细胞内静息Ca2+浓度的相对荧光强度值不能太低（F值不低于40）细胞内生理Ca2+浓度值（10-8 -10-7 M）细胞内Ca2+超载浓度值（基础Ca2+浓度的10倍左右）o
标准曲线法根据仪器条件和负载条件，以不同Ca2+浓度的Buffer(EGTA- Ca2+)做标准曲线，横轴为Ca2+浓度，纵轴为荧光强度o
比例荧光的测量.双波长(比例荧光：ratio) Indo1(360, 420/480), fura2(340/380, 440)[Ca2+]I =Kd(R-Rmin)/(Rmax-R)Ff2/Fs2o
细胞器的Ca2+测量1.线粒体内游离Ca2+测量Fluo-3 + TMRM(线粒体荧光探针，红色）2. 特异定位的重组水母发光蛋白水母发光蛋白与 Ca2+结合后发蓝光用含有水母发光蛋白和含有特定细胞器蛋白的表达载体转染细胞，可测定亚细胞器内的游离Ca2+变化
目前已商品化的探针可检测：线粒体、内质网、细胞核内的游离Ca2+，因生物发光很弱不能使用Confocal检测 细胞内游离Ca2+测量的应用l
钙的特性1．细胞内外的电化学梯度103-104倍2．细胞膜渗透性稍有改变或钙库释放稍有增加，导致胞内钙明显升高3．细胞内钙为细胞激活“开关”l
细胞内钙的生理作用1．肌肉的兴奋收缩-收缩偶联2．神经递质的释放3．学习记忆的增强4．卵子受精5．细胞分裂和再生6．细胞调亡7．细胞间通讯8．细胞信号传导9. DNA合成10. 基因表达l
细胞内钙超载与疾病1．高血压、脑缺血、心脏病、内分泌病—胞内钙浓度异常2．糖尿病、风湿性关节炎、多发性硬化病—胞内钙浓度增高3．人体缺钙—骨钙大量丢失，神经细胞的钙浓度增高4．老化和老年性痴呆-神经细胞内钙浓度增高 细胞内生理Ca2+浓度值（10-8 -10-7 M）细胞内Ca2+超载浓度值（基础Ca2+浓度的10倍左右）五.荧光漂白恢复(FRAP: Fluorescence Recover after photobleaching)定义:经荧光探针标记的细胞的某一区域一旦被高强度的激光照射后,荧光物质的光化学结构被迫坏,荧光强度下降, 且为不可逆的过程, 但此处荧光强度会渐渐恢复, 荧光强度和恢复的快慢和多少,代表周围分子扩散的速率, 或分子运动速度。R=(I2-I1 /I0-I2)?100%R-荧光漂白恢复率：代表分子的运动速度应用：细胞间通讯， 细胞膜流动性，蛋白分子的运动六.笼锁解笼锁的测量定义：笼锁化合物全称为光致不稳定笼锁化合物，为人工合成的用隐蔽基团修饰生物活性分子的化合物，一旦被紫外光照射，两者间的共价键几解离而释放出活性分子，这一光解作用称为解笼锁。
笼锁化合物的种类：笼锁的神经递质、笼锁的第二信使、笼锁钙等七．荧光能量共振转移( fluorescence Resonance Energy Transfer)能量转移：能量从分子的一个部位向另一个部位的传递，或能量从一个分子向另一个分子传递。能量的提供者叫能量供体，能量的接受者叫能量受体。能量共振转移：分子可以看作为正负电荷分离的一个偶极子，受激发以一定的频率振动，如果其附近有一个振动频率相同的另一分子存在，则通过这两个分子之间的偶极-偶极相互作用，能量可以非辐射方式从前者转移到后者，这种能量转移称为共振转移荧光能量共振转移的条件两个荧光分子：供体-FL1，受体-FL2供体与受体的距离在2-7nm供体的发射波长与受体的激发波长一致l
检测以FL1的激发波长的光照射样品，没有共振转移时，只检 测到 FL1的发射光(绿光)，发生共振转移时，就可检测出FL1的荧光(绿光)减弱，FL2(红光)的增强。l
应用：检测大分子的相互作用D 大分子构象的改变(蛋白)例：大分子(亚基)的结合与分离D 受体与配体的结合 o 常用荧光探剂：FITC/TRITC, Cy3/Cy5, BFP/GFP
八 .其它应用生物材料,例: 细胞在生物材料中的生长状态及分布激光扫描共焦显微镜的发展趋势：l
连续光谱型Confocall
多光子激光扫描显微镜—— Multiphoton Laser Scanning Microscopy
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上海晶安生物激光共聚焦培养皿概况和特点： ? 标准细胞培养皿、板和高质量玻璃底的完美结合。革新设计提供了一个独立、平整的底部。 ? 在体外培养环境下，为高分辨率显微镜提供更清晰的视野。 ? 共聚焦培养皿由高质量的聚苯乙烯和高透明度硼硅酸盐玻璃制成。 ? 具有高光学性能的玻璃材料保证了底部的最佳平整度，从而避免了光的去偏振化。
玻璃底特征：
? 高透明度硼硅酸盐玻璃。 ? 玻璃底厚度：0.17mm+-0.02mm。 ? 最大的光透过范围，无法荧光。 ? 超平界面。
应用范围： ? 相差显微镜 ? 荧光显微镜 ? 激光共聚焦显微镜 ? 活细胞成像 ? 相差干涉显微镜 ? 激光发射显微镜 ? 荧光原味杂交技术（FISH）
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上海晶安生物
上海晶安生物激光共聚焦培养皿概况和特点：
? 标准细胞培养皿、板和高质量玻璃底的完美结合。革新设计提供了一个独立、平整的底部。
? 在体外培养环境下，为高分辨率显微镜提供更清晰的视野。
? 共聚焦培养皿由高质量的聚苯乙烯和高透明度硼硅酸盐玻璃制成。
? 具有高光学性能的玻璃材料保证了底部的最佳平整度，从而避免了光的去偏振化。
玻璃底特征：
? 高透明度硼硅酸盐玻璃。
? 玻璃底厚度：0.17mm+-0.02mm。
? 最大的光透过范围，无法荧光。
? 超平界面。
应用范围：
? 相差显微镜
? 荧光显微镜
? 激光共聚焦显微镜
? 活细胞成像
? 相差干涉显微镜
? 激光发射显微镜
? 荧光原味杂交技术（FISH）
请问一下～我要看细胞上的受体在刺激后是否内化～用什么标记受体呢？用配体加荧光的话～怎么排除配体导致的内化呢？刚开始实验～谢谢帮助
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发一个能打开共聚焦显微镜拍摄的.oib后缀的图片的软件（任意电脑都能运行后打开），和共聚焦的电脑一样效果，有标尺
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发一个能打开共聚焦显微镜拍摄的.oib后缀的图片的软件（任意电脑都能运行后打开），和共聚焦的电脑一样效果，有标尺如题，实验室老师对共聚焦机器看管很严，只能在他们上班时间操作，图片拍摄完毕放在那个机器的电脑上，还得插一次性光盘拷贝走，真麻烦，为了能很方便的半天晚上随时分析实验结果，我发一款能安装在任何一台电脑上的软件，能打开共聚焦显微镜拍摄的.oib后缀的图片,这个软件就是共聚焦机器相连的电脑上分析图像的软件，一模一样，运行后在我的电脑上和在共聚焦那个电脑上打开图片的效果一摸一样，还带标尺，方便极了，大家可以下载，软件名称： FV1000Viewer
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win8 不能用啊 保存图片就闪退
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【求助】请各位老师帮忙分析一下激光共聚焦图片是否正常，致谢
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本人近期对一段组织（厚约1mm）做了一次共聚焦，因以前没做组织方面的经验，不知此图片中的背景是否正常，个人感觉背景有点深，但又不确定。请有此方面经验的老师帮忙分析一下，万分感谢。具体操作如下：1.4%多聚甲醛固定了四天（因初次预定的观察日期推迟致使多固定了几天）。2.pbs-Tween洗5次x5min（所有清洗过程均在24孔板中进行， 每次用量为2ml）3.二抗同源血清、1%BSA 0.5%Triton RT封闭1h4.1%BSA 0.1%Triron PBS中 孵育一抗 湿盒 4度 过夜5.0.1%Triton PBS-Tween 洗5次x10min6.0.1%Triton TR标记的二抗 湿盒中 RT 1h 7.PBS-Tween 洗5次x10min8. 防焠灭剂封片 4度保存 第二天共聚焦观察一、二抗和防淬灭剂均来自scrus，浓度均为其推荐浓度。操作中戴手套、口罩，载玻片、盖玻片均泡过酸清洗。另外，原本准备了三个标本，因第一次做没有经验，电镜室的老师找了将近一个小时才初步摸索好各种参数，第一个标本就花了2小时。此段时间，另外两个标本一直放于旁边备用，但当观察完第一个、再看第二个标本时，相同参数下却找不到任何荧光点，刚开始以为标本没做好，但换用第三个标本同样未发现任何荧光。当时我看到房间温度计显示20摄氏度，怀疑是温度所致，将标本置于冰箱中冷却后再次观察后果然成功观察到了目标物，但强度却明显低于第一个标本。镜下观察前所有标本一直避光，现在看来温度对荧光还是有一定影响的。所以想通过自身的教训提醒各位同道以后做共聚焦时别出现类似“事故”.....好了，小弟在此期待着各位前辈对此图的评价。如果确是背景过深的话，请各位前辈提些建议。小弟在此谢过各位啦
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这是组织不同层面的图片：
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你用的什么染色？怎么感觉这么模糊呢？还有你要染的东西和细胞怎么是同一种颜色的荧光？
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不成功的实验。
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FFGGQQ 你用的什么染色？怎么感觉这么模糊呢？还有你要染的东西和细胞怎么是同一种颜色的荧光？首先，十分感谢您的关注。1.一抗是羊抗鼠，二抗是牛抗羊-TR.激发波长543nm（不知是否还有更佳的激发波长？）。2.我们的实验是以某固定间隔对组织进行连续切片扫描，所以对于同一物体而言，每一层的图像荧光强度也将逐渐变化（由强到弱或由弱到强）。我们的目的是只对目标物定量分析。3.我理解您的疑问。细胞被部分染色在我们意料之中，因为我们要观察的目标物与此细胞具有部分同源性，只是没想到细胞的荧光也这么强而且周围背景不知为何也不理想........（而对于目标物的标记目前市面上只有一种抗体，也就是实验中用的这种，所以更换抗体似乎不太现实，如果DAPI对细胞核进行复染情况会不会有所改善？如果可以用DAPI的话，以后观察时需要用双通道吗？）。4.分析图片时我也在想细胞的荧光色有可能会影响我们对目标物的计数，却苦于没经验不知该如何是好，所以才来求助各位前辈...期盼您的回复。这是众多图片（众多层）中的另一张：期盼您的回复。
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tree1004 不成功的实验。前辈您所说的“不成功”是指目标物未能与其他物质在荧光颜色上区分开来吗？还是另有所指？如果是前者的话，我现在苦恼的是：我们的目标物与图中的细胞具有部分同源性，标记此目标物的抗体目前却只有这一种。所以恳请前辈赐点经验以解燃眉之急....
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tree1004 不成功的实验。请问大侠 我从细胞上清液中提取到的100nm左右的囊泡结构（exosome）能否用荧光标记抗体结合到囊泡表面的蛋白后 再用激光共聚焦显微镜观察呀
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追寻希冀 首先，十分感谢您的关注。1.一抗是羊抗鼠，二抗是牛抗羊-TR.激发波长543nm（不知是否还有更佳的激发波长？）。2.我们的实验是以某固定间隔对组织进行连续切片扫描，所以对于同一物体而言，每一层的图像荧光强度也将逐渐变化（由强到弱或由弱到强）。我们的目的是只对目标物定量分析。3.我理解您的疑问。细胞被部分染色在我们意料之中，因为我们要观察的目标物与此细胞具有部分同源性，只是没想到细胞的荧光也这么强而且周围背景不知为何也不理想........（而对于目标物的标记目前市面上只有一种抗体，也就是实验中用的这种，所以更换抗体似乎不太现实，如果DAPI对细胞核进行复染情况会不会有所改善？如果可以用DAPI的话，以后观察时需要用双通道吗？）。4.分析图片时我也在想细胞的荧光色有可能会影响我们对目标物的计数，却苦于没经验不知该如何是好，所以才来求助各位前辈...期盼您的回复。这是众多图片（众多层）中的另一张：期盼您的回复。嗯，看来你的问题第一是抗体特异性不好，背景值太高，一个办法是看看有没有 block-Ab，先把细胞表面那些乱七八糟的抗原屏蔽掉。另外，还可以用PKH 给细胞膜染色，有种PKH是红色的，忘记是PKH35还是67了，这是种lipid dye，有这个，你可以很清晰的标记出细胞膜的范围，而且这东西很亮。在confocol下你可以把那个绿色荧光调的弱一些，只留下你需要的标记物，然后把图片和PKH染色的细胞重叠。如果你运气好，就能得到一个很漂亮的红配绿的艺术品了。至于DAPI，嗯，有PKH了你还需要DAPI吗？如果你还想再玩的high一些，还可以3D重建，弄个细胞的3D影像，可以清晰的显示出来你标记的东西在细胞上的具体位置...OK ...SCI paper不是梦对了，还补充一句，虽然可能性不大，但你没加羊抗鼠抗体的阴性对照显微镜下是不是也有这么强的绿色荧光？
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zhang_nana 请问大侠 我从细胞上清液中提取到的100nm左右的囊泡结构（exosome）能否用荧光标记抗体结合到囊泡表面的蛋白后 再用激光共聚焦显微镜观察呀首先声明：我不是卖PKH的，但我真的很喜欢用这东西染带膜结构的东西。挂了荧光的抗体当然也是一个不错的选择，但这个你要选择细胞表面高表达的抗原特异抗体。否则，confocol拍出来的影像就不是一个连续的环，而是一个一个分散的点
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非常感谢FFGGQQ的建议，我提取的就是膜囊性的小泡，悬浮于PBS中，有脂质双层结构，表面高表达MHC-I /II分子。能否用荧光二抗标记？大概的标记方法呢 ？是否加入一定量的抗体孵育就可以了啊？
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非常感谢FFGGQQ的建议，我提取的就是膜囊性的小泡，悬浮于PBS中，有脂质双层结构，表面高表达MHC-I /II分子。能否用荧光二抗标记？大概的标记方法呢 ？是否加入一定量的抗体孵育就可以了啊？=====我没用过抗MHC抗体，如果你有合适的特意性抗体的话，就拿来染吧，一抗结合MHC分子，2抗上荧光。另外，还建议你，最好往PBS里加点胎牛血清（图便宜就用新生牛血清）1% 即可双抗染色好处是信号比较强，但问题也存在背景会强一些。如果背景太高，你可以看看只用荧光标记的抗MHC 抗体。再不行的话...嗯，你周围有人用PKH吗？
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FFGGQQ 嗯，看来你的问题第一是抗体特异性不好，背景值太高，一个办法是看看有没有 block-Ab，先把细胞表面那些乱七八糟的抗原屏蔽掉。另外，还可以用PKH 给细胞膜染色，有种PKH是红色的，忘记是PKH35还是67了，这是种lipid dye，有这个，你可以很清晰的标记出细胞膜的范围，而且这东西很亮。在confocol下你可以把那个绿色荧光调的弱一些，只留下你需要的标记物，然后把图片和PKH染色的细胞重叠。如果你运气好，就能得到一个很漂亮的红配绿的艺术品了。至于DAPI，嗯，有PKH了你还需要DAPI吗？如果你还想再玩的high一些，还可以3D重建，弄个细胞的3D影像，可以清晰的显示出来你标记的东西在细胞上的具体位置...OK ...SCI paper不是梦对了，还补充一句，虽然可能性不大，但你没加羊抗鼠抗体的阴性对照显微镜下是不是也有这么强的绿色荧光？感谢前辈的热心解答。1.在您这儿首次学到了用Ab封闭嘿嘿，只是目前还未查到相关的文献......上次的封闭血清是10%胎牛，下次打算增加到30%试试2.另外，您所说的PKH价格大约多少？容易买到吗？3.关于3D重建，我还想问一下前辈：3D重建是不是把扫描出的所有图像集合后得出的3维图？要完成此过程的话，技术人员的操作复杂吗？我一个标本大约扫描出300张图片，大约再需要多长时间可完成3D重建？4.本来第一次实验的3个标本中有一个是阴性对照，但因意外最终没能观察成，打算下周再做一次，到时候再看看结果如何，会把结果反馈上来。再次期待您的解答，先谢啦。
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Triton X-100用的浓度太高，时间太长，温度太高，次数太多。组织有点厚细胞形态也不该是这样的
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追寻希冀 感谢前辈的热心解答。1.在您这儿首次学到了用Ab封闭嘿嘿，只是目前还未查到相关的文献......上次的封闭血清是10%胎牛，下次打算增加到30%试试2.另外，您所说的PKH价格大约多少？容易买到吗？3.关于3D重建，我还想问一下前辈：3D重建是不是把扫描出的所有图像集合后得出的3维图？要完成此过程的话，技术人员的操作复杂吗？我一个标本大约扫描出300张图片，大约再需要多长时间可完成3D重建？4.本来第一次实验的3个标本中有一个是阴性对照，但因意外最终没能观察成，打算下周再做一次，到时候再看看结果如何，会把结果反馈上来。再次期待您的解答，先谢啦。1. 关于PKH，可以看看这个，sigma 公司的2. Confocol 3D 重建，大体上类似CT或MRI 层扫然后3D 重建吧，你在软件里设定层扫的起始点和结束点，还有一个层扫的间距，然后开扫，中间看你设定的层扫间距范围，时间上大概几分钟到若干分钟....（没事干你可以去下个电影喝杯茶）系统层扫重建完成后，会自动生成一个3D 模型，如果你的细胞染色和荧光聚焦什么的都设置的很漂亮的话，理论上你就会得到一个上面带了各种标记物的大泡。3. 至于用block-Ab，我不了解你用的是什么组织，标记什么，具体是什么导致的背景荧光。所以，具体这招怎么用，建议你还是要多了解你研究的这个组织细胞入手，细胞膜上都有什么，抗原相似性多高等等
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paroxysm Triton X-100用的浓度太高，时间太长，温度太高，次数太多。组织有点厚细胞形态也不该是这样的谢谢前辈的评价。下次我会适当降低Triton的浓度，缩短抗体反应的时间。我想请教一下前辈：1.封闭时，Triton的浓度是不是越高越好（例如0.5%）？2.您认为“次数太多”，意思是一抗和二抗孵育时不需要用Triton？我们实验中待检测的目标物质位于细胞内，如果不用Triton的话会不会影响目标物质与抗体的结合？3.您所说的“温度太高”是指哪一步骤中的温度高？4.因为我们扫描的是组织块，其中含有众多不同类型的细胞，目标物质附近的细胞种类较多。如果仅从大小上来说，第一张图中的“细胞”更像是细胞核，但到底是细胞核还是处于不同层面的其他不同类型的细胞还有待证实，我们打算下次时使用DAPI复染，看看效果。再次感谢您的关注，期待您的解答。
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FFGGQQ 1. 关于PKH，可以看看这个，sigma 公司的2. Confocol 3D 重建，大体上类似CT或MRI 层扫然后3D 重建吧，你在软件里设定层扫的起始点和结束点，还有一个层扫的间距，然后开扫，中间看你设定的层扫间距范围，时间上大概几分钟到若干分钟....（没事干你可以去下个电影喝杯茶）系统层扫重建完成后，会自动生成一个3D 模型，如果你的细胞染色和荧光聚焦什么的都设置的很漂亮的话，理论上你就会得到一个上面带了各种标记物的大泡。3. 至于用block-Ab，我不了解你用的是什么组织，标记什么，具体是什么导致的背景荧光。所以，具体这招怎么用，建议你还是要多了解你研究的这个组织细胞入手，细胞膜上都有什么，抗原相似性多高等等感谢前辈的无私帮助，确实收获颇丰。PKH26我问过了，7700 CNY，不便宜呵呵。我们这里有现成的DAPI，所以打算先用一下看看效果怎样，没准还会有什么意外发现谁知道呢嘿嘿考虑到初次实验中的细胞（更可能是细胞核）也发出绿色荧光，我现在倾向于认为与一抗的非特异性结合较多有很大关系，但也不排除组织中自发荧光的可能。打算下次在一抗孵育前，先用DAPI染核，不知道这样会不会消耗些非特异抗原的位点。另外再做一个阴性对照......关于DAPI的使用，不知还能不能分享点您的宝贵经验？嘿嘿
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追寻希冀 感谢前辈的无私帮助，确实收获颇丰。PKH26我问过了，7700 CNY，不便宜呵呵。我们这里有现成的DAPI，所以打算先用一下看看效果怎样，没准还会有什么意外发现谁知道呢嘿嘿考虑到初次实验中的细胞（更可能是细胞核）也发出绿色荧光，我现在倾向于认为与一抗的非特异性结合较多有很大关系，但也不排除组织中自发荧光的可能。打算下次在一抗孵育前，先用DAPI染核，不知道这样会不会消耗些非特异抗原的位点。另外再做一个阴性对照......关于DAPI的使用，不知还能不能分享点您的宝贵经验？嘿嘿PKH国内卖那么贵吗？ 抢
劫啊！袋鼠国才300多刀DAPI，我都是最后封片的时候染的，几乎加进去就染了，很快，染完了也不用洗（片子都封了还洗啥.....) 。你如果没有含DAPI的封片液，也可以考虑最后再染
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追寻希冀 本人近期对一段组织（厚约1mm）做了一次共聚焦，因以前没做组织方面的经验，不知此图片中的背景是否正常，个人感觉背景有点深，但又不确定。请有此方面经验的老师帮忙分析一下，万分感谢。具体操作如下：1.4%多聚甲醛固定了四天（因初次预定的观察日期推迟致使多固定了几天）。2.pbs-Tween洗5次x5min（所有清洗过程均在24孔板中进行， 每次用量为2ml）3.二抗同源血清、1%BSA 0.5%Triton RT封闭1h4.1%BSA 0.1%Triron PBS中 孵育一抗 湿盒 4度 过夜5.0.1%Triton PBS-Tween 洗5次x10min6.0.1%Triton TR标记的二抗 湿盒中 RT 1h 7.PBS-Tween 洗5次x10min8. 防焠灭剂封片 4度保存 第二天共聚焦观察一、二抗和防淬灭剂均来自scrus，浓度均为其推荐浓度。操作中戴手套、口罩，载玻片、盖玻片均泡过酸清洗。另外，原本准备了三个标本，因第一次做没有经验，电镜室的老师找了将近一个小时才初步摸索好各种参数，第一个标本就花了2小时。此段时间，另外两个标本一直放于旁边备用，但当观察完第一个、再看第二个标本时，相同参数下却找不到任何荧光点，刚开始以为标本没做好，但换用第三个标本同样未发现任何荧光。当时我看到房间温度计显示20摄氏度，怀疑是温度所致，将标本置于冰箱中冷却后再次观察后果然成功观察到了目标物，但强度却明显低于第一个标本。镜下观察前所有标本一直避光，现在看来温度对荧光还是有一定影响的。所以想通过自身的教训提醒各位同道以后做共聚焦时别出现类似“事故”.....好了，小弟在此期待着各位前辈对此图的评价。如果确是背景过深的话，请各位前辈提些建议。小弟在此谢过各位啦激光波长不对：你采集绿色荧光应该用蓝色激光488纳米左右激发，具体要看用什么二抗，543纳米激光用来激发红色荧光。组织切片太厚：共聚焦显微镜一般只能做100微米的组织成像，另外组织太厚染色效果不好！最多建议不要超过200微米厚度。二抗染色时间太短：要跟一抗时间差不多，起码要几个小时吧。
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时隔半年，实验及文章终于搞定，终于有时间回来向各位曾热心帮助过的前辈补谢，试验期间曾试过各种不同的抗体浓度、孵育时间、漂洗液中Triton的浓度也尽量做到最小，有时甚至未用，从总的结果看来，背景深应该与一抗抗体的浓度关系最大，其次与共聚焦激光的激光波长有关，尽管试过多种方案，调过多种波长，但仍未能得到令自己满意的图片，现从背景较低的一个标本图片中选取一张，tif貌似传不上来，只好截图如下：尽管仍有部分背景，但处理过后效果还算可以接受。飞秒激光双通道时，背景往往会增多，另外两个标本其中某层的图片分别如下（仍为截图）：经处理后效果勉强接受，但3D重建后效果不算清晰，论文中未用上，很遗憾。现在回想起此前的实验之路，感觉经验真的很重要，第一次接触共聚焦和免疫荧光，其中有很多环节都要小心翼翼，加上自己的标本微小、取材艰难，抗体标记时真的有种步履薄冰的感觉，暗室里操作（尤其是漂洗时）光找标本有时就得找半天，看得眼都花了.....后续的铺片也颇费时间...当付出许多最终得到这些来之不易的图片的时候（尽管没想象中那么漂亮），心中的那种舒畅感觉也许只有自己亲身经历过的人才能体会.今天投出了自己今生的第一篇SCI，也是自己的第一篇论文，希望自己此前的付出能有美好的回报......，再次向曾提出过宝贵意见和建议、曾给予过热心帮助的各位前辈致敬，谢谢你们！
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恭喜，以后你会越做越好的
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FFGGQQ 恭喜，以后你会越做越好的谢谢前辈您的鼓励，也祝您事事顺心，嘿嘿
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关于丁香园}