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四甲基偶氮唑盐比色法测定Vero毒素
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四甲基偶氮唑蓝比色法
四甲基偶氮唑蓝比色法
一、原理　　尽管淋巴因子种类繁多,但其检测方法却大同小异,概括起来可分为生物活性检测...3）有时CTLL2细胞不参入同位素，此时可选用四甲基偶氮唑盐（MTT）比色分析法，该法原理是活细胞的线粒体可将淡黄色的MTT还原为蓝黑色的甲&#17
与"四甲基偶氮唑蓝比色法"相关的文献前10条
目的比较3种可用于促肝细胞生长因子(HGF)活性检测方法的优劣,以确定HGF活性的常规检测方法。方法以人肝癌细胞HepG2为材料,分别用3H-TdR掺入法、四甲基偶氮唑蓝比色法和
本研究采用四甲基偶氮唑蓝（ＭＴＴ）比色法检测肺泡巨噬细胞活力（ＡＭＡ），对比观察了承气合剂对毒血症大鼠ＡＭＡ的影响。结果表明毒血症模型３ｈＡＭＡ显著增高，２４ｈ有所降低，但仍高于
目的:研究手性药物氨甲蝶呤(MTX)消旋体与单一对映体对ECV304内皮细胞的细胞毒性。方法:设置溶剂对照组及氨甲蝶呤(MTX)单一体与消旋体不同浓度组、时间组,采用四甲基偶氮唑
目的探讨氨甲喋呤[(±)MTX]及其对映体[(+)MTX、(-)MTX]对ECV304细胞的生长抑制作用并探讨其机制。方法采用培养的ECV304细胞,应用MTT比色法分析其活性;
目的:建立一种用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法测定促肝细胞生长素对SMMC-7721细胞的促生长作用,以测定其生物活性的方法。方法:在体外采用MTT法,观察促肝细胞生长素在不同浓
目的通过动物实验探讨恶性肿瘤体内化疗的疗效与肿瘤细胞体外药物敏感性预测的关系。方法采用浓度梯度递增法制备小鼠淋巴瘤 EL4耐药细胞系 EI4/美法仑,四甲基偶氮唑蓝(MTY)比色
【目的】探讨质子泵抑制剂奥美拉唑体外对宫颈癌HeLa细胞凋亡的诱导作用及其可能机制。【方法】0、100、200、300μmol/L奥美拉唑分别作用于体外培养的HeLa细胞,荧光显
目的:探讨米非司酮作用于人宫颈鳞癌C ask i细胞后对顺铂敏感性的影响和机制。为临床应用米非司酮治疗宫颈鳞癌提供实验依据。方法:体外培养人宫颈鳞癌C ask i细胞,分别或联合
ＭＴＴ比色法中五种甲?溶解液的比较边兴艳（大连市儿童医院免疫室，大连１１６０１２）陈洁（大连医科大学附属第一医院检验科）关键词四甲基偶氮唑蓝比色法甲?溶解度ＭＴＴ（四甲基偶氮唑蓝
目的:比较不同血清浓度培养体系对表皮干细胞增殖分化的影响。方法:采用两步酶消化法和Ⅳ型胶原差速贴壁相结合的方法获得人原代表皮干细胞,分别以0%、5%、10%、15%和20%血清浓
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四甲基偶氮唑盐比色法测定原发性肝癌对化疗药物的敏感性
目的:探讨肿瘤药敏试验在肝癌化疗选药中的作用.方法:将12例患者的肝癌组织进行体外培养,以临床常用的9种化疗药物加以干预,四甲基偶氮唑盐比色法(MTT法)检测化疗药物对癌细胞的抑制率.结果:9种化疗药物对肝癌细胞的抑制率差异有显著性(P＜0.01),肝癌对多西他赛高度敏感,对泽菲、顺铂、卡铂、阿霉素、丝裂霉素、5-氟尿嘧啶中度敏感,对羟基喜树碱、健择低度敏感.结论:肿瘤药敏试验对肝癌化疗起重要作用.以MTT法检测相关化疗药物对肝癌细胞的抑制率.优选敏感药物组成化疗方案,可实现个体化治疗,从而提高疗效,减轻不良反应.
LIU De-chuan
作者单位：
中国人民解放军第175医院肿瘤科,福建漳州,363000
中国人民解放军第175医院病理科,福建漳州,363000
年，卷(期)：
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肿瘤化疗敏感度预测及应用
& & 肿瘤化学治疗的目标是通过个体化的治疗方案提高疗效、减少毒性反应。由于个体基因组的差异及肿瘤的异质性,具有相同临床病理特征的不同个体对同一化疗药物或化疗方案的反应性可能不同。对复发患者,经验用药的有效性仅10%～30%[ 122 ]。目前,通过药敏试验、基因表达分析、蛋白质组学分析等方法,预测肿瘤化疗敏感度及优化药物治疗方案方面已有大量的研究,对实现肿瘤个体化治疗具有潜在的重要价值。现就该领域的研究进展和发展趋势进行综述。
1　肿瘤化疗药敏试验
& & 肿瘤化疗药敏试验(
chemosensitivity assays)是指在肿瘤细胞离体后通过实验室技术,检测肿瘤细胞被特定化疗药物杀死或抑制的情况。20世纪7O年代后期建立的适宜人肿瘤原代细胞生长的双层软琼脂培养系统,即人肿瘤细胞集落测定( human tumor colony
assay, HTCA) ,为肿瘤化疗药敏试验的发展打下了基础。而后发展到可以从实体肿瘤标本中分离出肿瘤细胞进行原代培养,经化疗药物作用之后评价药物的疗效,至今已发展出可在体内和体外进行的20多种方法。
1.1　体外法
1.1.1　四甲基偶氮唑盐比色法(MTT法)&　Mosmann等于1983&年建立此方法。其原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性四甲基偶氮唑盐(MTT)还原为不溶于水的蓝紫色结晶甲瓒( formazan) ,并沉积在细胞中,而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒,用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值,可间接反映活细胞数量。该方法的特点是快速、费用低,已广泛用于大规模的抗肿瘤药物筛选、抗癌效应细胞[自然杀伤细胞(NK)&、淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)&、细胞毒T淋巴细胞(CTL) ]细胞毒效应、细胞因子和抗癌药物药敏检测,以及肿瘤放射敏感度测定等。1991年被美国国立癌症研究所纳入抗癌药物筛选程序。Taylor等[ 3 ]用MTT法预测120例Ⅲ、Ⅳ期卵巢癌患者的化疗敏感性、耐药性,并与临床疗效相对比,发现MTT法预测耐药的阳性预测值为
83% ,与临床结果有很高相关性;敏感组、耐药组的5年生存率分别是24%和12%。
甲瓒不溶于水,需被溶解后才能被检测,如果溶解不均质,会对实验结果的准确性产生影响;该方法检测到的是活细胞,不能区分正常细胞和肿瘤细胞;凋亡早期细胞,线粒体活性未受损,甲瓒生成亦不会受到影响。为了更有效地溶解甲瓒结晶, MTT法进行了一些改进,如改变溶剂(如DMSO )&、增加电子耦合剂等。此外,还发展出产物为水溶性的其他MTT类似物比色法,如XTT法、MTS法等方法,使得检验的准确率更高,使用更方便。
1.1.2　三磷酸腺苷生物荧光法(ATP2tumor chemosensitivity assay, ATP2TCA)&　ATP是一切细胞代谢的能量来源,当细胞死亡时,ATP在酶的作用下迅速水解。在培育的细胞中加入荧光色素2荧光色素酶复合物,通过检测发出的荧光强度来反映ATP含量,进而反映活细胞的数量。其优点是灵敏度高,所需细胞数少,可用于仅有穿刺活检组织、无手术切除标本患者的化疗敏感度预测;结果稳定,干扰因素少;快速,工作量不大。缺点是不能区分检测到的活细胞是正常细胞还是肿瘤细胞。Kim等[ 4 ]&报道,&乳腺癌患者中,&临床治疗有反应组ATP2TCA检测到的细胞死亡率显著高于治疗无反应组,ATP2TCA的成功率、敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、与临床反应的符合率分别是9310%&、%、100%、6617%、和8510%。Cree等[ 5 ]将180例复发性铂耐药卵巢癌患者随机分为根据药敏试验结果用药组(药敏组)和经验用药组(经验组) ,虽然意向处理分析显示两组患者的有效率( 26%对31% )&、中位无进展生存期( PFS) (91d对104d)&、总生存期(OS)差异无统计学意义,但由经验组转入药敏组后有41% ( 12 /39)的患者显示有效,研究者认为该小规模随机临床试验显示药敏试验有提高化疗有效率和PFS的趋势。
1.1.3　三维立体组织培养法( histoculture drug response assay, HDRA)&　由Hoffman在1991年建立。该方法的基本原理是将肿瘤以组织块的形式在体外培养并加入化疗药物,较早是用3H2thymidine渗入法,现多采用MTT法观察组织块对化疗药物的敏感度。并引入计算机图像分析技术,形成组织块培养2终点染色2计算机图像分析法( tissueculture2end point staining2computer image analysis, TECIA ) ,进一步简化了实验步骤[ 6 ]。组织培养法能够保持实体瘤在体内的三维生长方式、组织结构、细胞异质性等多种特性,更接近体内实体瘤细胞的环境。在卵巢癌和口腔鳞癌的药敏试验中, HDRA法的阳性预测值、阴性预测值、与临床反应的符合率分别是69%和90%、78%和80%、74%和8218%[ 728 ]。卵巢癌患者中,药敏试验顺铂敏感患者的5年生存率显著高于顺铂耐药者(5010%&对1110% ) [ 8 ]&。目前还缺乏根据药敏试验结果进行化疗的前瞻性随机对照临床试验来检验该方法的准确性。
1.1.4　胶原凝胶包埋培养药物敏感实验( collagen gel drop let embedded culture drug sensitivity test,
CD2DST)&　肿瘤细胞生长的微环境对肿瘤细胞生长具有重要影响。20世纪70年代末建立了一种将乳腺癌上皮细胞种植到胶原中以形成三维立体结构的新型细胞培养技术。90年代起,该细胞培养技术应用到肿瘤药敏试验。CD2DST使肿瘤细胞能够在接近体内的三维立体环境下生长,加入化疗药物共同培养。利用图像软件分析药物的抑制率,&计算肿瘤细胞形成克隆的光密度(D) ,评估药物体外杀伤作用。CD2DST特点是: (1)肿瘤细胞在接近体内的三维立体环境下生长。(2)所需细胞数量少(105个) ,可用于细针穿刺、、腹水等恶性肿瘤细胞量少的标本的检测。(3)由于使用了图像分析系统,排除了成纤维细胞污染的干扰,结果更准确。(4)可按药物的体内浓度水平进行体外药敏试验。
& & 目前, CD2DST用于肿瘤体外药敏试验多见于日本学者报道,成功率6113%&～8413% ,试验结果与临床治疗反应相关[ 9210 ]。在一项非小细胞患者的前瞻性研究中, 22例患者CD2DST结果有敏感药物并接受含敏感药物的化疗,治疗的反应率为7217% ,中位生存期15个月; 11例患者CD2DST结果无敏感药物,接受标准的经验方案治疗,反应率为0,中位生存期6个月。提示CD2DST可用于筛选化疗敏感患者及优化化疗方案,也可通过CD2DST辨别出不能从化疗受益的患者[ 10 ]。
1.1.5　极端耐药试验( extreme drug resistance assay, EDRassay)&　肿瘤药敏试验结果的阳性预测值往往远低于其预测耐药的准确性,通过体外药敏试验辨别不敏感的化疗药物,可以减少不必要的毒性反应、避免耐药性的产生[11]。
& & EDR assay是将肿瘤细胞植入软琼脂中培养,并长时间暴露于高浓度的化疗药物[血浆药物浓度2时间曲线下面积(AUC)为体内的5～80倍]。通过与阴性对照组比较,计算出个体的肿瘤细胞抑制百分率(percentage cell
inhibition,PCI)&。基于既往的耐药性检测结果,得出各化疗药物人群PCI的中位数(M)和标准差( SD)&。按个体肿瘤细胞的PCI&M、PCI介于M与M21SD之间和PCI&划分为低度耐药(LDR)&、中度耐药( IDR)和极端耐药( EDR)&。EDR assay特点是: ( 1)准确性高:对耐药预测的准确性高达99%。(2)检验的成功率高达90%。(3)使用范围广,可用于各种实体肿瘤组织及恶性胸、腹水检查。
& & Matsuo等[ 12 ]对173例进展期卵巢癌患者进行铂和紫杉类药物EDR Assay检测发现,对铂类及紫杉类药物低度耐药者PFS、OS均明显高于中度或极端耐药者( 52year OSrates, 4111%对3019% ,P&= 01014)&。Loizzi等[ 13 ]回顾分析了按EDR Assay结果接受治疗或接受经验方案治疗的复发性卵巢癌各50例,铂敏感患者中总反应率分别是65%和35% ,OS分别是38和21个月; PFS分别是15和7个月;铂耐药患者,按EDR assay结果治疗未改善生存。一项小规模(48例)的前瞻性研究显示,复发性胶质瘤肿瘤组织体外对盐酸伊立替康三水合物活性产物SN38极端耐药、中及低度耐药者的肿瘤进展时间( TTP)和中位生存期差异有统计学意义(6周对3个月, 13周对38周) [ 14 ]。不少研究显示EDR assay结果与卵巢癌、胶质瘤预后相关,借助EDR&assay检测避免接受不敏感化疗药物及毒性具有良好的应用前景。但目前尚缺乏前瞻性根据EDR assay进行治疗的随机对照临床试验结果[ 12215 ]。
1.1.6　ChemoFx assay　体外培养的活肿瘤细胞贴壁生长,受药物作用后凋亡或死细胞由于细胞挛缩、细胞膜完整性破坏而从培养基上脱落[ 16 ]。基于上述原理,
Precision Ther2apeutics公司于1996年开发出用于预测肿瘤化疗敏感度的ChemoFx assay。该试验通过将组织块在体外原代培养后获得足够数量的肿瘤细胞,经胰蛋白酶作用后,将特定数量的肿瘤细胞种入微孔板中培育,细胞贴壁生长。加入6种不同浓度的化疗药物作用一定的时间后,经冲洗、固定,移去死亡、不贴壁的细胞。贴壁留下的活细胞经核荧光染色后,通过自动显微镜图像分析系统计数,得出每种药物不同浓度的细胞存活率,并设阴性对照。数据汇总后,得出每种药物的剂量2反应曲线。
& & ChemoFx assay的特点是(1)检验所需样本量小:实体肿瘤仅需35mg组织,液体标本仅需40mL,可用于穿刺活检及恶性和腹水等标本的检验。(2)检验药物的范围广,还可用于生物制剂的检验。(3)可对单药或最高三药联合的方案进行检验。(4)该检验中所使用的不同的药物浓度包括了体内肿瘤细胞暴露的药物浓度,检验结果对临床药物使用更具有指导意义。目前, ChemoFx assay可用于各种实体肿瘤的化疗敏感度检验,但尚未应用于血液肿瘤及的检验。
& & Mi等[ 17 ]报道, ChemoFx
assay对乳腺癌患者检测的成功率8319%
,可重复性高(变异系数& 3% ) ;药敏试验中多西紫杉醇、卡培他滨的敏感性与临床疗效相关,预测乳腺癌新辅助化疗达到病理完全缓解的准确率为75%。一项对192例卵巢癌的研究提示, ChemoFx assay检测铂敏感性与总生存显著相关:铂敏感、中度敏感、不敏感的总生存期分别是和2812个月(&P&=
0103) [ 18 ]。目前正在卵巢癌、乳腺癌患者中进行关于ChemoFx assay检验准确性的前瞻性临床试验。
1.2　体内法　体外药敏试验虽具有快速、简便等优点,但不能反映药物在体内的药代动力学特征。异种移植法体内药敏试验更接近肿瘤在人体中的真实环境,并能反映试验药物的药代动力学特征,对化疗药物的筛选意义重大,是药物开发临床前研究的重要步骤。目前主要的方法有以下几种。
1.2.1　裸鼠模型　Tygarrd&于1969年首次用人体肿瘤裸鼠移植瘤模型进行药敏检测。按移植部位的不同又分为裸鼠皮下移植法、裸鼠肾包膜下移植法和裸鼠的常位移植法。裸鼠存在免疫缺陷,对异种移植无明显的排斥反应,用于人肿瘤移植时,可保持人肿瘤的生物学特性及原有的对化疗药物的敏感度,被广泛地应用于各种新药及干预方法的临床前体内试验。但由于裸鼠免疫缺陷,饲养及试验条件要求严格,试验费用高,需时较长(需要2&～6&个月试验周期) ,故未能在临床上广泛应用。关于其检验结果与临床反应相关性研究鲜见报道。Sakamoto等[ 19 ]对19例患者采用裸鼠模型进行化疗药物敏感度检验,阳性预测值83% ,阴性预测值100% ,准确率95%。
1.2.2　肾包膜下移植体内药敏测定法( subrenal cap sule assay, SRCA)&　SRCA是近十几年发展起来的肿瘤组织异种移植技术,最初采用的是裸鼠肾包膜下移植模型,随后研究发现,移植瘤6d内能逃避宿主的免疫排斥反应,进而改用正常免疫力小鼠模型。其方法是将1mm3人瘤组织块移植于小鼠肾包膜下,并给小鼠施予化疗药物。移植时和试验结束分别于移植原位用装有测微尺的解剖显微镜测量瘤块并计算体积差,以判断化疗的敏感度。采用正常免疫力小鼠进行SRCA操作相对裸鼠模型简单,试验周期短,但存在宿主对移植瘤免疫抑制及炎症细胞浸润等问题。有作者提出用环磷酰胺或环孢菌素A预处理小鼠,消除普通小鼠抗异种移植免疫排斥反应对SRCA结果的干扰[20]。
& & Hahka2Kempp inen等[21]报道SRCA在转移性黑色素瘤患者的敏感度、特异度、准确率分别是77%、54%和65%。Maenpaa等[ 22 ]报道,根据经验和SRCA结果选择化疗方案的卵巢癌患者中位生存期差异无统计学意义。由于实验动物饲养繁琐、所需资源庞大, SRCA试验结果与临床相关性报道样本量均较小且结果不一,目前尚未有前瞻性随机对照研究。
2　基因组学及蛋白质组学在预测化疗敏感度方面的应用
2.1　基因组学在预测化疗敏感度方面的应用　迅速发展的人类基因组和个体遗传性差异研究使通过比较基因表达差异预测化疗敏感度成为研究的热点,从而形成药物基因组学(pharmacogenomics)&。以cDNA芯片技术为基础的高通量基因表达分析,可比较化疗敏感细胞与耐药细胞的基因表达全貌,克服既往对单个或数个基因比较的片面性。对用于预测化疗敏感度的多基因分析有多种不同称谓,如基因标签( gene
signatures)&、多基因生物标记(multigene
markers)&、多基因预测子(multigene p redictors)或多基因分类器(multigene classifers)。乳腺癌在该领域的研究最为活跃。
& & 早期的研究着重于一般化疗敏感度的预测,即预测个体接受化疗药物后出现疗效或耐药的可能,以期甄别耐药患者,避免不必要的化疗毒性反应。Hess等[ 23 ]和Roberts等[ 24 ]研究发现,化疗敏感和耐药的乳腺癌、卵巢癌等多种肿瘤组织中,基因表达谱不同,提示基因表达差异可用于预测化疗敏感度。有两个正在进行的Ⅲ期临床试验(
TA I2LORx和M INDACT)将检验多基因分析对一般化疗敏感性
预测的准确性。
& & 近期研究人员更热衷于探索化疗方案特异的基因标签( gene signature)预测的准确性。一项乳腺癌多中心临床试验结果显示,化疗方案FEC、TET特异的基因标签预测化疗病理完全缓解(pCR)的敏感度分别为96%和93%、特异度66%和69%、阳性预测值68%和71%、阴性预测值96%和92%。根据方案特异性基因标签选择合适化疗方案, pCR比例由44%提高到70% ,提示方案特异性基因标签对化疗敏感度的预测具有重要价值[ 25 ]。
& & 上述研究显示根据化疗方案特异的基因标签结果选择化疗方案可提高化疗的pCR比例,但是否可以改善患者的PFS和OS有待前瞻性的临床试验验证。如确实可改善生存期,将是个体化治疗的一大进步,但使用现有的技术方法进行类似的临床试验费用极高。
2.2　蛋白质组学在预测化疗敏感度方面的应用　由于从DNA到蛋白质需经过翻译、转录、转录后修饰等生化过程,基因的表达并不能完全反映蛋白质的表达。蛋白质是细胞所有功能的执行者,蛋白质组学从整体的角度来研究组织或细胞内动态变化的全部蛋白质组成成分、表达水平和修饰状态,更直接地解释肿瘤的生物学行为和药理学现象。研究者对乳腺癌、卵巢癌等肿瘤的耐药细胞进行了蛋白质组学研究并发现了相关的蛋白质组学特征[ 26227 ]。L iu等[ 26 ]用双向凝胶电泳法比较乳腺癌多药耐药细胞系MCF7 /AdVp3000&和MCF7,鉴定出包括142323 sigma蛋白的17个差异表达蛋白质。转染142323
sigma SiRNA后,MCF7 /
& & AdVp3000细胞系142323 sigma蛋白的表达下降,其耐药性也显著下降。Britten用表面增强激光解吸电离飞行时间质谱( SELD I2TOF2MS)&技术对顺铂耐药的卵巢癌细胞系OAW42和2780分析发现了两个特异性重复出现的多肽峰(m / z ) [ 27 ]。Ma等[ 28 ]通过整合60个人类肿瘤细胞系(NCI260)对118种抗癌物质敏感度和蛋白质组学分析结果,构建出基于蛋白表达的化疗敏感度分类器。该学者最近报道,将基因组学和蛋白质组学的信息整合,构建出29个结合了基因组学和蛋白质组学信息的分类器。例如预测常用于卵巢癌、乳腺癌等的紫杉醇化疗敏感度的分类器含7个基因标记和2个蛋白质标记。化疗敏感度预测的总的准确率为01817,更有助于预测化疗敏感度[ 29 ]。由于蛋白质研究技术远比基因技术复杂和困难,所需设备及人力资源昂贵,目前基于蛋白质组学分析的化疗敏感度预测还停留在人类肿瘤细胞系层面的实验室研究。
3　问题与展望
& & 尽管药敏试验的实验技术发展迅速,根据药敏试验实施个体化的化疗方案也越来越受到重视,但目前药敏试验在各个实验室中进行,实验技术多种多样且缺乏严格的规范和质量控制。对标本的制备、试验步骤、结果解释进行规范,试验结果才更有可比性。当前对各药敏试验预测准确性的报道多为回顾性研究,缺乏通过严格设计的前瞻性随机临床试验结果。在WHO国际临床试验注册平台(International
Clinical Trials&Registry Platform , ICTRP)注册的与预测化疗敏感度或耐药有关的临床试验仅有8项。前瞻性地将患者随机纳入根据药敏试验结果选择化疗方案组或接受经验方案组,比较客观反应率和生存期,以评价药敏试验的准确性及其对生存期的影响是非常必要的。
随着人类全基因组测序工作的进展,基因组学的研究的热点也从结构基因组学转向功能基因组学。通过对耐药基因的筛选、基因功能的鉴定,确定重要的特定药物耐药相关的蛋白质功能域,以期筛选出特定药物耐药的分子标志物。这可能是实现个体化治疗、寻找新的药物靶点的有效方法。
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