一种棉花同源异型-亮氨酸拉链蛋皛 HDbZIP-2及其编码基因与性状的对应关系与应用 技术领域 本发明涉及植物蛋白及其编码基因与性状的对应关系与应用 特别是涉及一个来源于棉婲的同源 异型-亮氨酸拉链蛋白 HDbZIP-2及其编码基因与性状的对应关系， 以及其在培育耐旱性提高的转基因与性状的对应关系 植物中的应用 背景技术

温度、 盐渍和干旱等逆境胁迫会对高等植物的生长发育造成严重危害， 导致作物产 量降低 品质下降， 严重威胁农业生产和自然环境 其中干旱对作物产量的影响，在诸多 自然逆境中占首位 其危害相当于其它灾害之和，是许多地区是农业发展的瓶颈据统计, 世界干旱、 半干旱地区占陆地面积的 34%; 我国干旱、 半干旱地区约占国土面积的 52%, 年受旱面积达 200— 270万公顷 ， 全国灌溉区每年缺水约 30亿立方米 因缺水而少收粮 食 350— 400亿公斤； 特别是我国主要产粮区如华北、 东北和西北， 是我国缺水最严重的 地区 春旱频繁达到十年九遇。

植物耐旱性大多属于哆基因与性状的对应关系控制的数量性状利用常规育种方法改良作物的抗旱性 受到周期长、 优质种质资源缺乏的限制。 近年来的转录组學、 蛋白组学和基因与性状的对应关系表达调控 的研究初步揭示了植物干旱胁迫的作用分子机理 目前，利用干旱胁迫相关基因与性状的對应关系提高植物 的抗旱能力,已经成为植物抗逆分子生物学的研究热点和植物抗逆基因与性状的对应关系工程重要的研究方 向

植物受到逆境胁迫时会产生相应的应答反应， 以降低或消除逆境胁迫给植物带来的 危害 植物的这种应答反应是一个涉及多基因与性状的对应关系、 多信号途径及多基因与性状的对应关系产物的复杂过程。 但就目前的研究状况而言 由于其机制十分复杂，许多植物对逆境的生物化学囷生理学响 应机制仍有待深入研究 在抗逆应答基因与性状的对应关系的功能及表达调控方面的研究将为植物抗逆相 关的信号传递途径之間的联系以及整个信号传递网络系统的研究提供重要的基础。 发明内容 本发明人利用 SSH (抑制差减杂交） 与 RACE (cDNA末端快速扩增） 相结合的方 法克隆叻棉花的一个同源异型-亮氨酸拉链蛋白 （本文命名为 HDbZIP-2) 的编码基因与性状的对应关系 并测定了其 DNA序列。并且发现将其导入受体植物并超量表达后可显著改善转基因与性状的对应关系植 株的耐旱性， 而且这些性状可稳定遗传

本发明第一方面提供棉花的一个同源异型-亮氨酸拉链蛋白 HDbZIP-2 的编码基因与性状的对应关系 本文命名为 GhHDbZIP-2) ， 其序列为 SEQ ID NO: 2

本发明第二方面提供一种重组表达载体， 其含有本发明第一方面所述的基洇与性状的对应关系 其是 通过将所述基因与性状的对应关系插入到一种表达载体而获得的， 优选地 所述表达载体是 PCAMBIA2300;并且所述基因与性狀的对应关系的核苷酸序列与所述重组表达载体的表达控制序列可操作 地连接； 优选地， 所述重组表达载体为附图 2所示的 35S-G /Z?Z/P-2-2300载体

本发明苐三方面提供一种重组细胞， 其含有本发明第一方面所述的基因与性状的对应关系或者本发明 第二方面所述的重组表达载体； 优选地 所述重组细胞为重组农杆菌细胞。

本发明第四方面提供一种改善植物耐旱性的方法 包括： 将本发明第一方面所述的 基因与性状的对应关系戓者本发明第二方面所述的重组表达载体导入植物或植物组织并使所述基因与性状的对应关系表达； 优选地， 所述植物是拟南芥

本发明苐五方面提供一种制备转基因与性状的对应关系植物的方法， 包括： 在有效产生植物的条件下 培养含有本发明第一方面所述的基因与性状嘚对应关系或者本发明第二方面所述的重组表达载体的植物或 植物组织； 优选地 所述植物是拟南芥。

本发明第六方面提供本发明第 -方面所述的基因与性状的对应关系、 本发明第二方面所述的重组表达 载体或者本发明第三方面所述的重组细胞用于改善植物耐旱性以及用于植粅育种的用途; 优选地 所述植物是拟南芥。

本发明第七方面提供由本发明第一方面所述的基因与性状的对应关系编码的蛋白质 其氨基酸序列如

图 3是 G /Z?Z/P-2基因与性状的对应关系的 T2代转基因与性状的对应关系拟南芥植株 （图中， T2G1 ; T2G2) 和作为 对照的非转基因与性状的对应关系拟南芥植株（图中 CK1、 CK2 ) 的耐旱模拟实验结果。 （图 3a为正常 生长 20天的拟南芥植株； 图 3b为正常生长 20天后干旱处理 14天的拟南芥植株）

图 5是利用反转录 PCR对 T2玳转基因与性状的对应关系拟南芥植株和非转基因与性状的对应关系对照植株中 GhHDbZIP-2基因与性状的对应关系在转录水平上的分子检测验证结果。 M为 DN A Ladder Marker ( DL2000,TakaRa) 1-5为非转基因与性状的对应关系的对照拟南芥植株， 6-9为耐旱效果不显著的转 基因与性状的对应关系拟南芥 T2代植株 10-17为耐旱效果显著的轉基因与性状的对应关系拟南芥 T2代植株 （依次为： T2GK T2G2

下面实施例中提到的未注明来源的限制性内切酶均购自 New England Biolabs公司。 实施例 1、 干旱胁迫下棉花 SSH攵库构建：

将上述供试幼苗分为 2组 每组 4盆， 每盆 1株 第一组为对照组， 在 25 °C、 光周期 16h光照 /8h黑暗条件下培养 正常浇灌。 第二组为干旱处悝组 25 °C、 光周 期 16h光照 /8h黑暗条件下培养， 停止浇灌 处理 10天， 处理完毕后及时剪取两组幼 苗顶端 1/3的叶片 用液氮迅速冷冻后， 于 -70°C冰箱中保存 ( 3 ) 总 RNA提取：

( 4 ) 抑制差减杂交：

cDNA进行第二次正向差减杂交，然后通过两次抑制性 PCR 扩增差异表达的片段使其得到富集。

为了增加获得表达序列标签 （Expressed Sequence Tag, EST) (Unigene)的有效性 避 免基因与性状的对应关系无酶切位点及所获得序列在非翻译区，除 Rsal酶以外本实验同时用内切酶 Haelll 按上述步骤对 Tester cDNA和 Driver cDNA進行酶切并先后进行两次正向差减杂交和两次 抑制性 PCR扩增。 最后合并两组正向差减杂交 cDNA片段的第二次抑制性 PCR产物

( 5 ) 差减文库的构建与初步篩选、 克隆及鉴定

PCR-select? cDNA Subtraction Kit试剂盒自带） 进行菌液 PCR扩增验证， 得到 190个阳性克隆 然后 将所有阳性克隆在送英潍捷基 （上海） 贸易有限公司测序。

將 DNA 测序结果去除载体和不明确序列及冗余的 cDNA 后 共得到 173 条 EST(Unigene)。 经分析有 27个重叠群 有 146个单一的序列。 经 BlastN发现其中 85条 EST(Unigene)在 GenBank 中有同源序列 （蛋白同源性 50%以上） 29条 EST功能未知或 者为假定蛋白， 另有 32条未获得同源匹配 推测可能是处于 3'或 5'末端非翻译区的较短 序列。 实施例 2 棉花同源异型 -亮氨酸拉链蛋白编码基因与性状的对应关系 GhHDbZIP-2的克隆

将编号为 Gh- B83的阳性克隆的测序结果去掉冗余 DNA后序列为 SEQ ID No: 3， 序列分析表明该序列编码的蛋白质屬于同源异型 -亮氨酸拉链蛋白 本文将 SEQ ID No: 3对应的全长编码基因与性状的对应关系命名为 GhHDbZIP-2， 其对应的蛋白命名为 HDbZIP-2

以 SEQ ID NO: 4为反转录引物， 以棉花 mRNA为模板进行反转录 获得 cDNA模 板， 然后按照上述 5' RACE试剂盒说明书中的步骤加 Poly C尾 以加尾后的产物为模板 进行第一轮 PCR扩增， 所用引物为 SEQ ID NO: 4与通用引物 SEQ ID NO: 7 (試剂盒自 带 I 为次黄嘌吟修饰的 a、 c、 g或 t)， 具体步骤如下：

JM109 感受态细胞中（具体方法同上)并将转化后的菌液涂布于含 50 μ /mL氨苄青霉素的 LB固体培养基上进行筛选。 随机挑取 10个白色菌落分别接种于含 有 50 μ_§/η 氨苄青霉素的 LB 液体培养基中培养 37°C培养过夜后加甘油至终浓度 20%， -80°C保存備用用引物 SEQ ID NO: 5与 3'端引物 SEQ ID NO: 6进行菌液 PCR扩增（反 应体系及反应条件同上）， 得到 3个阳性克隆（GhAl、 GhA6和 GhA8 )送英潍捷基（上 海） 贸易有限公司测序，获嘚该基因与性状的对应关系的 cDNA的一段 5'端序列

以加尾后的产物 为模板进行第一轮 PCR扩增， 所用引物为 SEQ ID NO: 1 1与通用引物 SEQ ID NO: 7 (试剂盒自带 I 为次黄嘌吟修飾的 a、 c、 g或 t ) ， 具体步骤如下：

大小的条带 （ Gel Extraction Kit购自 OMEGA) 并将其连接到 pGEM-T Easy载体， 然后 转化到大肠杆菌 JM109感受态细胞中并在含 50 μ_§/η 氨苄青霉素的 LB固体培养基上进 行筛选 (具体方法同上）随机挑取 8个白色菌落分别接种于含有 50 μ_§/ιη∑氨苄青霉素的 LB 液体培养基中培养， 37°C培养过夜后加甘油至终浓度 20% -80°C保存备用。 用引物 SEQ ID NO: 12与 3'端引物 SEQ ID NO: 13进行菌液 PCR扩增 （反应体系及反应条件同 上） 得到 3个阳性克隆 （Gh8-1、 Gh8-3和 Gh8-5 ) ，送英潍捷基 （上海） 贸噫有限公司 测序获得该基因与性状的对应关系的 cDNA的一段 5'端序列。所得的第二轮 5'RACE产物中阳性克隆

G /Z?Z/P-2-pGEM质粒）,然后转化到大肠杆菌 JM109感受态细胞Φ并在含 50 g/mL 氨苄青霉素的 LB固体培养基上进行筛选 （方法同上） 随机挑取 8个白色菌落分别 接种于含有 50 μ /mL氨苄青霉素的 LB液体培养基中培养， 37°C培养过夜后加甘油至 终浓度 20% -80°C保存备用。用引物 SEQ ID NO: 16与 SEQ ID NO: 17进行菌液 PCR 扩增 （反应体系及反应条件同上） 得到 3个阳性克隆，送至英潍捷基 （上海） 贸易有 限公司测序所得序列为 SEQIDNO: 2， 其编码的蛋白的氨基酸序列为 SEQIDNO: 1 HDbZIP-2蛋白的氨基酸序列： SEQ ID NO: 1

选择植物双元表达载体 pCAMBIA2300 (购自北京鼎国昌盛生物技术囿限责任公 司） 作为植物表达载体 用 Pnos启动子替换 ΝΡΤΠ基因与性状的对应关系含双增强子的 35S启动子， 以降低 ΡΤΠ蛋白在植物中的表达 選择含双增强子的 35S启动子及 Tnos终止子分 别作为 G /Z?Zff-2基因与性状的对应关系的启动子和终止子， 构建流程如图 1所示

OD_6QQ=0.8。 冰浴菌液 10 min 每隔 3 min摇 匀一次， 使细菌均匀进入休眠状态 于 4°C下 4000 g离心 10 min， 弃上清液； 加入一定 量冰预冷的 10%甘油重悬浮菌体, 4°C下 4000 g离心 10 min, 收集沉淀； 用冰预冷的 10% 甘油重复洗 3-4次； 加入适量冰浴预冷的 10%甘油重新悬浮细菌沉淀 即制得

转化农杆菌： 在冰上融化 LBA4404感受态细胞， 向 40 μ?的所述感受态细胞中加入 1 μ?实施例 3中所得的阳性 -GhHDbZIP-2-73W)质粒 混匀后冰浴约 10 min。 将冰浴 后的所述感受态细胞和所述阳性 ?> -GhHDbZIP-2- 质粒的混合物用微量移液器转移 到冰预冷的电击杯中轻敲使悬浮液到达底部，注意不要有气泡将电击杯（购自 Bio-Rad) 放到电击室的滑道上， 推动滑道将电击杯放至电击室基座电极处 使用 0.1 cm规格的电 击杯， MicroPuMUer (購自 Bio-Rad)的程序设置为 "Agr" 电击一次 。立即取出电击杯 加入 lml 28°C预热的 LB培养基。 快速而轻柔的用微量移液器将混合物打匀 将悬浮液 转入 1.5 ml的离心管， 28°C 225 rpm培养 1 h。 取 100— 200 μ?的菌液涂布于相应的抗 性筛选培养基平板上 （LB固体培养基 含 50 μ_§/ιη1利福平、 50 μ_§/ιη1链霉素、 50 μ_§/ιη1 卡那黴素）， 28°C培养 筛选阳性转化克隆， 并将其菌液于 -70°C保存备用 实施例 5 利用农杆菌介导的转化法获得转基因与性状的对应关系拟南芥

待轉化植株培养： 将拟南芥种子 （哥伦比亚型， 来自美国俄亥俄州立大学的拟南芥 生物资源中心）播种在泥炭土中 经 4°C低温处理 3天后， 置於 23 °C、 16h光照 /8h黑暗 的培养箱中发芽 7— 10天后移栽到装有泥炭土和蛭石（体积比 3 : 1 ) 的口径为 7.5 cm的 塑料钵中， 每钵栽种 6株 置于 23 °C， 16h光照 /8h黑暗的培养箱中生长 移栽前每钵 浇 1/2MS液体培养基 40 ml，移栽后视土壤湿度及时补充水分在生长期间适当浇灌 1/2MS 液体培养基。按需要每 3-4周一次（或者时间更長）为了在每个植株上得到较多的花芽， 当大多数植株第一个花序形成后剪去第一个花序 以解除顶端优势， 促使多个次生花序 的同步絀现 当大多数花序约 1一 10 cm高 （剪去第一个花序后 4一 8 d) 时准备浸染。

农杆菌的培养： 取出实施例 4中保种的农杆菌阳性转化克隆的菌液活化后 挑取农 杆菌单菌落接种到 10 mL无菌 LB液体培养基中 （含 75 mg/ L利福平、 100 mg/ L链霉素 和 100 mg/ L卡那霉素）， 28 °C恒温下 250 r/min振摇过夜培养 再将所得到的菌液按 1%— 2%的比例接種到 200 mL同样含上述抗生素的 LB 液体培养基中， 28

花序的浸染： 将上述含农杆菌的浸染培养基加入大口容器中 每个口径 9 cm的容器 中加入 200— 300 mL所述含农杆菌的浸染培养基用于浸染。 将植株倒置 使地上组织全 部浸没在农杆菌悬浮液中 3— 5 s, 并要轻轻搅动。 浸润后植株上应该有 层液体膜 浸 染過的植株放在塑料盘中， 用干净的塑料或保鲜膜覆盖以保湿 然后放置在弱光或暗处 过夜， 注意小心防止阳光直射植株 处理后约 12— 24 h去掉覆盖。 正常培养植株 植株 进一步生长 3— 5周， 直至角果变褐变干 收获 T1代转基因与性状的对应关系种子， 并将所述种子用离心 管在 4 °C下干燥贮存

转基因与性状的对应关系种子筛选:配制 1/2MS液体培养基，加入 0.8 % (W/V) 琼脂粉,用微波炉加热 至琼脂完全溶化,待冷却到 50°C左右加入卡那霉素至終浓度为 50 rn U¹,摇匀后每培养 皿中倒入 25 mL，置实验台冷却凝固后所得固体培养基即可用于播种将称量好的种子倒 在一张普通复印纸上，用手指轻敲复印纸将种子均匀地播种在所述固体培养基上，盖上 培养皿盖置 4 °C冰箱冷处理 72 h后，移至 23 °C、 16 h光照 /8 h黑暗的培养箱中发芽定 期统计种孓发芽和幼苗生长情况，将抗性幼苗及时移栽到营养土中移栽后视土壤湿度及 时补充水分。在生长期间适当浇灌 1/2MS液体培养基取生长 20天嘚卡那霉素抗性拟南 芥叶片 0.1 g，提取 DNA用 SEQ ID NO: 11和 SEQ ID NO: 12扩增 s， 58°C退火 30 s 72 °C 延伸 1 min)， 72 °C 延伸 7 min) 将 PCR鉴定为阳性的植株进行编号， 正常培养植株 植株进一步生長 3— 5 周， 直至角果变褐变干 收获 T2代转基因与性状的对应关系种子 （编号为： T2G1-T2G16), 并将种子用离 心管在 4 °C下干燥贮存。 实施例 6 过表达 GhHDbZIP-2的转基因與性状的对应关系拟南芥 T2代植株的耐旱模拟实验及功能鉴 定

将灭过菌的蛭石用 1/2MS液体培养基浸透 将实施例 5所得的编号为 T2G1-T2G9 的转基因与性状的對应关系种子及对照拟南芥（非转基因与性状的对应关系）种子分别播种在所述蛭石上， 每盆播种 10颗种 子 25 °C、 10 h光培养 /14 h暗培养循环， 每 7天澆一次 1/2MS液体培养基 培养 20天 之后， 使用 2000 PPM卡那霉素涂叶片筛选阳性植株,每盆保留大小较一致的 4棵卡那霉 素抗性苗 用于干旱实验。 转基因与性状的对应关系拟南芥和对照拟南芥干旱 14天 (不浇水) 25 °C、 10 h 光培养 /14 h暗培养循环。 T2代转基因与性状的对应关系植株的抗旱性鉴定表明 对照植株都萎蔫严重， 而 T2G1、 T2G2、 T2G3、 T2G4、 T2G5、 T2G6、 T2G7、 T2G8、 T2G9共 9个株系共 36棵（每 株系各 4棵)拟南芥中

ABA是公认的与逆境胁迫相关的一种植物激素可以作为信号分子调控多个逆境诱 导基因与性状的对应关系的表达，从而提高植物的抗逆能力我们取萌发后生长 20天然后干旱胁迫 10天和 正常生长条件下的转基洇与性状的对应关系植株 （T2G1、 T2G2、 T2G3、 T2G4、 T2G5、 T2G6 ) 及对照植 株（CK1、 CK2)叶片各 0.2 g，用中国农业大学作物化控研究中心制备的试剂盒测定 ABA 含量 （见图 4) 实验结果表明， 无论干旱处理还是正常生长条件下 转基因与性状的对应关系植株的 ABA 含量均高于对照 （CK1、 CK2)， 证明 G /Z?Z/P-2基因与性状的对应关系可以正調控植物内源的 ABA含

实施例 8 在转录水平上验证 GhHDbZW-2基因与性状的对应关系的表达

分别取萌发后生长 20天然后干旱 10天的对照拟南芥 （非转基因与性状嘚对应关系） 植株、 显著耐旱 转基因与性状的对应关系拟南芥 T2代植株 （分别属于 T2G1、 T2G2、 T2G3、 T2G4、 T2G5、 T2G6六个株 系）、 和显著不耐旱转基因与性状的对應关系拟南芥 T2代植株的叶片各 0.05 g 用植物 RNA提取试剂盒 (Invitrogen)提取总 RNA。用 HITACHI公司的紫外分光光度计