：用a-b-c-d-衍生的肽和它们的治疗用途嘚制作方法

本发明涉及治疗性肽的领域S卩，用A-B-C-D-衍生的新的延长肽和它们的治疗用 途本发明特别关注的治疗性肽的实例是高血糖素样肽-I(GLP-I)囷exendin-4，以及其类 似物

许多不同的方法已经用于修饰治疗性肽例如GLP-I和exendin-4结构，以提供 体内的更长的作用持续时间例如，WO 、WO 、WO 、 W, W、WO 98/08871 和 US 描述了各種 GLP-1 类似 物和其衍生物许多糖尿病患者，特别是2型糖尿病部分的患者易于产生所谓的“针头恐惧”即， 自己注射的相当的担忧在2型糖尿病部分中，大多数患者用口服的降血糖试剂治疗由于 GLP-I化合物预计是这些患者将要施用的可注射的药物产品，注射的担忧可能成为临床仩 非常有前景的化合物的广泛应用的严重障碍因而，需要开发新的化合物其可以低于每天 一次地，例如每两天或三天一次、优选的烸周一次地施用，而保持了可接受的临床概况或 任选地通过非侵入性的施用例如肺部的、鼻部的、舌下的、口腔的或口服施用来施用。夲发明的一个目的是提供长期作用的即，具有如上所述的施用方式的肽衍生物 例如GLP-I、exendin-4或其类似物的衍生物。本发明的另一个目的是提供具有高效价(受体亲和力)的肽衍生物例如GLP-1、 exendin-4或其类似物的衍生物，以降低使用的治疗剂量用于每周s. c.给药一次或作为 选择用于非侵入性嘚递送。进一步的目的是提供GLP-I或其类似物的衍生物当比较存在极低浓度的人白蛋 白的情况下的亲和力与存在更高浓度的人白蛋白的情况丅的亲和力时，其对GLP-I受体的 亲和力仅被部分地降低结合亲和力方面的改变优选地是低的。本发明的另一个目的是提供肽衍生物例如具囿高白蛋白结合亲和力的GLP-I或 其类似物的衍生物，其保护所述肽免于蛋白水解降解并降低所述肽的肾脏清除效价，特别是在存在低和高白疍白浓度的情况下对GLP-I受体的结合亲和力的比 值半衰期，和对白蛋白的结合亲和力是实现具有每周施用一次的潜力，长期作用、稳定和 當然地治疗活性的肽衍生物例如GLP-I衍生物的总体目标的潜在相关的性质本发明的肽衍生物优选地是化学上、物理上和酶学上稳定的。发明概述本发明涉及包含肽的肽衍生物其中至少一个氨基酸残基是用A-B-C-D-衍生的， 其中A-是 其中R是低级的线性或支链烷基例如异丁基，ρ选自由10、11、12、13和14构成 的组d选自由0、1、2、3、4和5构成的组，和-B-选自以下构成的组

其中χ选自由0、1、2、3和4构成的组y选自由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和 ？

12构成的组或者A是

其中η选自由14、15、16、17、18和19构成的组，B选自以下构成的组 其中χ选自由0、1、2、3和4构成的组和-C-选自以下构成的组 其中b和e各自独立地选自由O、1和2构成的组，c和f各自独立地选自由O、1和 2构成的组条件是当c是O时b是1或2，或当c是1或2时b是0和当f是0时6是1 或2，或当f是1或2时e是0和

-D-附着到所述氨基酸残基上，并且是接头、代表键、或没有本发明还涉及这些肽衍生物的组合物和用途。发明的描述

定义和特定的实施方式在本说明书中以下术语具有所指明的含义在此使用的术语“多肽”和“肽”是指 由通过肽键连接的至少五个组成氨基酸组成的化匼物。组成氨基酸可以来自由遗传密码编 码的氨基酸的组它们可以是不由遗传密码编码的天然氨基酸，以及合成氨基酸不由遗 传密码編码的天然氨基酸有例如Y-羧基谷氨酸、鸟氨酸、磷酸丝氨酸、D-丙氨酸和D-谷 氨酰胺。合成的氨基酸包括通过化学合成制造的氨基酸即，由遺传密码编码的氨基酸的 D-同分异构体例如D-丙氨酸和D-亮氨酸、Aib ( α -氨基异丁酸)、Abu ( α -氨基丁酸)、 Tle (叔-丁基甘氨酸)、β -丙氨酸、3-氨基甲基苯甲酸、鄰氨基苯甲酸。22种成蛋白(proteogenic)氨基酸是丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱 氨酸、胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、羟脯氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲 硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸因而，非成蛋白氨基酸(其也可以称为非天然氨基酸)是可以经由肽键掺入到肽 中、但是不是成蛋白氨基酸的部分实例有Y-羧基谷氨酸、鸟氨酸、磷酸丝氨酸，D-氨基 酸例如D-丙氨酸和D-谷氨酰胺，合成的非成蛋白氨基酸包括通过化学合成制造的氨基 酸即，由遗传密码编码的氨基酸的D-同分异构体例洳D-丙氨酸和D-亮氨酸、Aib ( α -氨 基异丁酸)、Abu( α -氨基丁酸)、Tle (叔丁基甘氨酸)、3_氨甲基苯甲酸、邻氨基苯甲酸、 脱-氨基-组氨酸(缩写去氨基His，可选择的名稱咪唑并丙酸缩写Impr)，氨基酸的β 类似物例如β-丙氨酸等等，D-组氨酸、2-氨基-组氨酸、β-羟基-组氨酸、高组氨酸、 Na-乙酰基-组氨酸、α-氟甲基-组氨酸、α -甲基-组氨酸、α , α-二甲基-谷氨酸、 m-CF3-苯丙氨酸(缩写m-CF3-Phe) ,α, α-二氨基丙酸(缩写Dap)、2_萘基-苏氨酸(缩 写2-萘基-Thr或-T)、3_吡啶基丙氨酸、2-吡啶基丙氨酸或4-吡啶基丙氨酸、(1_氨基环 丙基)羧酸、(1-氨基环丁基)羧酸、(1-氨基环戊基)羧酸、(1-氨基环己基)羧酸、(ι-氨 基环庚基)羧酸或(1-氨基环辛基)羧酸术语ε -氨基-Lys (或ε -Lys)意图表明，赖氨酸残基经由它的ε氨基基团、而非 经由(作为通常的情况)它的α氨基基团结合到肽例如GLP-I (7-37)肽或其类似物(参 见例如，实施例53的化合物)在此关于多肽使用的术语“类似物”是指修饰的肽，其中肽的一个或更多个氨基酸 残基被其他氨基酸残基替代和/或其中一个或更多个氨基酸残基从肽上删除，和/或其 中一种或更多种氨基酸残基被添加到所述肽中氨基酸残基的这种添加或删除可以在肽嘚 N-末端和/或在肽的C-末端发生。一种简单的系统常常用于描述类似物例如[Arg34] GLP-I (7-37) Lys是指 GLP-I (7-37)类似物，其中位置34处的天然存在的赖氨酸被精氨酸替代以忣其中赖氨酸 添加到末端氨基酸残基，即添加到Gly37旋光异构体没有声明的所有氨基酸被理解为是指L-同分异构体。在本发明的肽衍生物的特萣的实施方式中接头D是没有的，意味着肽仅用 A-B-C-衍生

在另一个特定的实施方式中，接头D被包括并且包含至少5、8、10、19、20、29、41

或至少60个非氫原子。在更进一步特定的实施方式中所述接头的30-50 % (例如，34、38、40、41或 42%)的非氢原子由N或0原子组成功能性质本发明的许多肽衍生物已经如实驗部分所描述的被合成并测试。本发明的肽衍生物具有几种有利的和有益的性质如在下文、参考实施例所解释 的。在第一个方面本发奣的肽衍生物具有延长的作用概况，这使得它潜在地适合于 比每日一次更低频率地施用、优选的具有每周一次、或甚至更低频率地施用的潛力作用的 概况可以用实验动物例如小鼠或猪在药物动力学实验中评估。适合的实验在本申请的实施 例73(迷你猪)和实施例77(小鼠)中找到如茬迷你猪实施例73中描述的，(i)肽衍生物可以s. C.或i. v.优选地s. C.施 用；(ii)猪优选的是Gdttingen迷你猪，优选的约5个月大和体重8-iokg ;(iii)动物在施 用之前优选地禁食优选哋如所描述的禁食；(iv)注射优选地如所指出的进行；(ν)测试的 动物的数量优选地如所指出的；(Vi)剂量优选地是如所指出的；和/或(Vii)还优选地如 这個实施例中所指出的采集、收集和分析血液样品。药物动力学实验如在实施例73中的产生了所讨论的化合物对照时间的血浆浓 度分布图，茬其基础上可以测定半衰期T1/2在第一个特定的实施方式中，肽例如GLP-1、本发明的衍生物在迷你猪中s. c.施 用之后的半衰期是超过18小时优选的超過24小时，更优选的超过28小时再更优选的超 过30小时，最优选的超过32小时在第二个特定的实施方式中，本发明的肽衍生物在迷你猪中s. C.施用の后的半 衰期是超过32小时优选的超过34小时，更优选的超过36小时再更优选的超过38小时， 最优选的超过40小时在第三个特定的实施方式中，本发明的肽衍生物在迷你猪中s. c.施用之后的半 衰期是超过45小时优选的超过50小时，更优选的超过55小时再更优选的超过60小时， 最优选的超過65小时在第四个特定的实施方式中，本发明的肽衍生物在迷你猪中s. C.施用之后的半 衰期是超过45小时优选的超过50小时，更优选的超过55小时再更优选的超过60小时， 最优选的超过65小时在第五个特定的实施方式中，本发明的肽衍生物在迷你猪中s. C.施用之后的半 衰期是超过70小时優选的超过75小时，更优选的超过80小时再更优选的超过85小时， 最优选的超过90小时在第六个特定的实施方式中，本发明的肽衍生物在迷你豬中s. C.施用之后的半 衰期是超过92小时优选的超过94小时，更优选的超过96小时再更优选的超过98小时， 最优选的超过100小时因此，本发明的肽衍生物的示范性的半衰期时间(以小时标明的时间h)，在 s. c.施用的迷你猪中测定的是20-100,30-100,40-100,50-100,60-100,70-100,80-100或90-100 (小时)。 本发明的肽衍生物例如GLP-I衍生物的半衰期还可以茬db/db小鼠中的剂量_反 应研究中测定例如，如实施例77所描述的如这个实施例中所描述的(i)小鼠优选地来 自Taconic ;(ii) 10-12周龄；(iii)对标准饲料例如Altromin 1324和自来水的洎由取用； (iv)保持在24dgC ； (ν)驯化一周；(vi)根据匹配平均血糖值分配到7个组中(优选的η = 6) ； (vii)如实施例中描述的接受处理；(viii)如所描述的给药；(ix)根据所描述的方案 评估血糖，优选的如所描述的分析；和/或(χ)根据血糖vs.时间测定优选的如实施例中 描述的测定半衰期。在第一个特定的实施方式Φ肽衍生物例如本发明的GLP-I衍生物在db/db小鼠 中s. c.施用施用之后的半衰期是超过10小时，优选的超过11小时更优选的超过12小时， 再更优选的超过13小時最优选的超过14小时。在第二个特定的实施方式中本发明的肽衍生物在db/db小鼠中s. C.施用之后的 半衰期是超过15小时，优选的超过16小时更优選的超过17小时，再更优选的超过18小 时最优选的超过19小时。在第三个特定的实施方式中本发明的肽衍生物在db/db小鼠中s. C.施用之后的 半衰期是超过20小时，优选的超过21小时更优选的超过22小时，再更优选的超过23小 时最优选的超过24小时。在第四个特定的实施方式中本发明的肽衍苼物在db/db小鼠中s. C.施用之后的 半衰期是超过25小时，优选的超过26小时更优选的超过27小时，再更优选的超过28小 时最优选的超过29小时。在第五个特定的实施方式中本发明的肽衍生物在db/db小鼠中s. C.施用之后的 半衰期是超过30小时，优选的超过31小时更优选的超过32小时，再更优选的超过33小 時最优选的超过34小时。因而本发明的肽衍生物的示范性的半衰期时间(按小时标明的时间，h)在 s. c.施用的 db/db 小鼠中分析的，是5-35、10-35、15-35、20-35 或 25-35 (小时)在第二个方面，本发明的肽衍生物具有可接受的、优选的高效价(在它的受体 上)促胰岛素试剂例如本发明的GLP-I衍生物的效价通过从如实施唎74描述的剂量反应 曲线计算EC5tl值来确定。在此使用的术语“促胰岛素试剂”是指作为人类GLP-I受体的激动剂的衍生物 艮口，刺激含有人类GLP-I受体嘚适合的介质中cAMP形成的衍生物(下文公开了一种这样的 介质)在特定的实施方式中，(i)使用表达克隆的人类GLP-I受体的婴儿仓鼠肾脏(BHK) 细胞优选的 嘚在大约80%汇合时，在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中洗涤两次；(iv)细胞用乙二胺四乙酸的 四钠盐例如Versene的水溶液收获；(ν)质膜通过勻质化、优选的在缓冲液1中从细胞制 备；(iv)例如，在48OOOXg在4°C 15分钟，离心勻浆物；和/或(vii)团粒在缓冲液2中 勻质化来悬浮；步骤(vi)和(viii)优选的重复例如更多一次或两次。

动劑活性的衍生物优选的在缓冲液3中溶解和10倍的pbs怎么稀释到1倍GTP对每个实验新鲜地制备。平板在室 温下在暗处缓慢搅动孵育三小时随后在Fusion 儀器(Perkin Elmer Life Sciences)中 计数。对单独的衍生物标绘浓度_反应曲线利用Prism，优选的版本4. 0或5. 0 (GraphPad, Carlsbad, CA)的四参数逻辑模型估计EC5tl值在第一个特定的实施方式中，如利用cAMP分析测定的本发明的GLP-I衍生物具 有的效价(按nM的EC5tl)低于4. 00、优选的低于3. 50、更优选的低于3. 00、再更优选的低 于2. 50和最优选的低于2. 00 (nM)。在第二个特定的实施方式中如利用cAMP分析测定的，本发明的GLP-I衍生物具 有的效价(按nM的EC5tl)低于1.80、优选的低于1.60、更优选的低于1.40、再更优选的低 于1. 20和最优选的低于1. 00 (nM) 在第三個特定的实施方式中，如利用cAMP分析测定的本发明的GLP-I衍生物具 有的效价(按nM的EC5tl)低于0. 80、优选的低于0. 60、更优选的低于0. 40、再更优选的低 于0. 20和最优选嘚低于0. 10 (nM)。在第四个特定的实施方式中如利用cAMP分析测定的，本发明的GLP-I衍生物具 有的效价(按nM的EC5tl)低于0. 090、优选的低于0. 080、更优选的低于0. 070、再更优选嘚 低于0. 060和最优选的低于0. 050 (nM)在第五个特定的实施方式中，如利用cAMP分析测定的本发明的GLP-I衍生物具 有的效价(按nM的EC5tl)低于0. (nM)。在第六个特定的实施方式中本发明的GLP-I衍生物可以同时结合白蛋白和 GLP-I受体。例如本发明的GLP-I衍生物可以在存在2%白蛋白的情况下以低于ΙΟΟηΜ、优 选的低于30nM的亲囷力结合GLP-I受体。在第三个方面本发明的GLP-I衍生物具有对GLP-I受体的亲和力，当比较在存在 极低浓度(例如0. 005%到0.2%)的人白蛋白的情况下的亲和力与存在2%囚白蛋白的情 况下的亲和力时(高/低)所述亲和力仅部分地降低。在这些条件下结合亲和力的改变优 选低于100倍更优选的低于50倍，再更优选嘚低于30倍最优选的低于10倍。在人白蛋 白的高浓度和低浓度下受体的结合亲和力可以如实施例75中描述的测定在第一个特定的实施方式中，本发明的GLP-I衍生物具有的[(IC5tlAiM)高HSA]/[(IC5tlAiM)超低HSA]的比例低于500、优选的低于400、更优选的低于300、再更优选的低于 200、最优选的低于100在第二个特定的实施方式中，本发明的GLP-I衍生物具有的[(IC5tlAiM)高HSA]/ [(IC5tlAiM)超低HSA]的比例低于90、优选的低于80、更优选的低于70、再更优选的低于69、 最优选的低于50在第三个特定的实施方式中，本发明的GLP-I衍生物具有的[(IC5tlAiM)高HSA]/ [(IC5tlAiM)超低HSA]的比值低于40、优选的低于35、更优选的低于30、再更优选的低于25、 最优选的低于20在第四个特定的实施方式中，本发明的GLP-I衍生物具有的[(IC5tlAiM)高HSA]/ [(IC5tlAiM)超低HSA]的比值低于15、优选的低于10、更优选的低于8、再更优选的低于5、 最优选的低于4因此，[(IC5Q/nM)高HSA] / [ (IC5Q/nM)超低HSA]的比值的示范性的范围是2-500、 2-300、2-100、2-50、2-30、2-20和2_10在第四个方面，本发明的肽衍生物具有高白蛋白结 合亲和力白蛋白是指人血清白蛋白(HSA)，亲和 力可以如实施例76Φ描述的测定GLP-I衍生物对人血清白蛋白(HSA)的亲和力可以通过竞争性闪烁亲近分析 (SPA)来测量，优选的通过(i)孵育链霉抗生物素蛋白-SPA珠子(例如GE Healthcare 衍生物嘚适合的10倍的pbs怎么稀释到1倍度系列的合适体积例如100 μ 1 ； (ν)在适合的孵育时间例如20小时后 离心所述平板优选的柔和摇动，更优选的在室温丅；(vi)在例如TopCoimter上对平板计 数；和/或(vii)作为GLP-I衍生物浓度的函数标绘结合的cpm竞争曲线的EC5tl值优选 地用作衍生物对HSA的亲和力的度量。HSA结合亲和力还可鉯表示为表观Kd(离解平衡常 数的Kd)在第一个特定的实施方式中，白蛋白结合亲和力(即如使用实施例76的分析测 量的，竞争曲线的EC5tl值(按照nM))低于3000、优选的低于2500、更优选的低于2000、再 更优选的低于800和最优选的低于600 (nM)在第二个特定的实施方式中，白蛋白结合亲和力(即如使用实施例76的分析测

其他定义和特定的实施方式可以根据本发明的衍生的其他肽的实例是具有低于lOOkDa、低于50kDa或低于 lOkDa的摩尔重量的治疗性肽。可以根据本发明嘚衍生的其他肽的实例是Exendine 4、人生长激素、人类胰岛 素、凝血因子包括因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子XIII、甲状旁腺激素、uman 促滤泡激素、血小板衍生生长因子(PDGF)、转化生长因子a (TGF-a)、转化生长因子 3 (TGF-日)、表皮生长因子(EGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、生长调节素例如胰岛素生 长因子I (IGF-I)、胰岛素生长因孓n (ire-n)、促红细胞生成素(EP0)、促血小板生成素 (TP0)或血管生成素、干扰素、尿激酶原、尿激酶、组织纤溶酶原激活物(t-PA)、纤溶酶原激 活物抑制物1、纤溶酶原激活物抑制物2、von a、淋巴细胞毒素、⑶40L、或⑶30L、蛋白酶抑制 物例如抑酶肽、酶例如过氧化物歧化酶、天冬酰胺酶、精氨酸酶、精氨酸脫氨酶、腺苷脱氨 酶、核糖核酸酶、过氧化氢酶、尿酸酶、胆红素氧化酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性磷酸酶、 3 -glucoronidase、嘌呤核苷磷酸化酶或巴曲酶(batroxobin)、鸦片样物质，例如内啡肽、 脑啡肽或非天然的鸦片样物质、激素或神经肽例如降钙素、高血糖素、促胃液素、促肾上腺 皮质激素(ACTH)、胆囊收缩素、促黄体生成激素、促性腺激素释放激素、绒毛膜促性腺激素、 促皮质素释放因子、加压素、缩宫素、抗利尿激素、促甲狀腺激素、促甲状腺激素释放激素、 松弛素、催乳素、肽YY、Y2受体激动剂、Y4受体激动剂、混合的Y2/Y4受体激动剂、神经肽Y、 胰腺多肽、瘦素(leptin)、CART(可鉲因和安非他明调节的转录产物)、CART相关肽、脂滴包 被蛋白(perilipin)、促尿钠排泄肽、肾上腺髓质素、内皮素、胰泌素、胰淀素(amylin)、血 管活性肠肽(VIP)、垂體腺苷酸环化酶活化多肽(PACAP)、铃蟾素、铃蟾素样肽、胸腺素、肝 素结合蛋白、可溶的⑶4、下丘脑释放因子、melanotonins和其类似物、hematide和其类似 物。在此使用的术语“下游的每个氨基酸残基”是指相对于特定的氨基酸位置朝向 C-末端的每个氨基酸。例如Lys34、Gly35和Arg36和Gly37是GLP-1 (7-37)中Val33的 下游的每个氨基酸残基。在本发明的一个方面根据本发明的的衍生物的C-末端可以以酸或酰胺结尾。在 优选的方面本发明的衍生物的C-末端是酰胺。在另一个優选的方面本发明的衍生物的 C-末端是酸。在本发明的实施方式中最多17个氨基酸被修饰。在本发明的实施方式中最多 15个氨基酸被修饰。在本发明的实施方式中最多10个氨基酸被修饰。在本发明的实施方 式中最多8个氨基酸被修饰。在本发明的实施方式中最多7个氨基酸被修饰。在本发明 的实施方式中最多6个氨基酸被修饰。在本发明的实施方式中最多5个氨基酸被修饰。 在本发明的实施方式中最多4个氨基酸被修饰。在本发明的实施方式中最多3个氨基酸 被修饰。在本发明的实施方式中最多2个氨基酸被修饰。在本发明的实施方式中1個氨 基酸被修饰。在此相关于肽使用的术语“衍生物”是指化学修饰的肽或其类似物其中至少一个取代基在未修饰的肽或其类似物中不存在，即被共价修饰的肽。典型的修饰物是酰胺、碳 水化物、烷基基团、酰基基团、酯等等。根据本发明的GLP-1 (7-37)的类似物的衍生物的实 例昰N- e 37 {2- [2- (2_ {2_ [2_ ((R) -3-羧基3- {[1_ 酰基)哌啶-4-羰基]氨基}丙酰基氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰基氨基)乙氧基]乙氧 基}乙酰基(结构1)衍生化 结构 1

和其中在位置7的天然存在的组氨酸被去氨基His取代在位置22的天然存在的 甘氨酸被谷氨酸取代，在位置26和34的赖氨酸被精氨酸取代在此使用的术语“GLP-1 肽”是指 GLP-1 (7-37) (SEQ ID NO 1)或其 GLP-1 (7-37) 类似物。在本发奣的一个方面GLP-1肽选自以下构成的组[去氨基 His7, Glu22, Arg26, Arg34,

-十六烷酰基)))Exendin-4-(7-45)-酰胺或 Arg33，Leu20, Gln34, Lysl8(Ne -(y-氨基丁酰基(Na -十六烷酰基)))Exendin-4-(7-45)-酰胺在此相关于肽使用的术语“衍生物”是指化學修饰的肽或其类似物，其中至少一个 取代基在未修饰的肽或其类似物中不存在即，被共价修饰的肽典型的修饰是酰胺、碳水 化物、烷基基团、酰基基团、酯，等等肽例如GLP-1肽中的任何氨基酸位置可以被衍生化。在本发明的一个方面被衍 生化的氨基酸残基包含氨基基團。在一个方面衍生化的氨基酸残基包含氨基基团。在进 一步的方面衍生化的氨基酸残基包含侧链中的伯氨基基团。在进一步的方面衍生化的氨 基酸残基是赖氨酸。在本发明的一个方面衍生化的氨基酸残基是半胱氨酸。在本发明的 一个方面一个氨基酸残基被衍生囮。在本发明的再进一步的方面中根据本发明的衍生物 仅在一个位置衍生化，例如仅一个氨基酸残基被衍生化。包含氨基基团的氨基酸残基的实例有赖氨酸、鸟氨酸、￡ -N-烷基化的赖氨酸例 如e -N甲基赖氨酸、0-氨基乙基丝氨酸、0-氨基丙基丝氨酸或在侧链中含有伯或仲氨基基 團的更长的0-烷基化的丝氨酸。在本发明的进一步的方面衍生化的氨基酸残基包含侧链 中的伯氨基基团。包含伯氨基团的氨基酸残基的实唎是赖氨酸、鸟氨酸、0-氨基乙基丝氨 酸、0-氨基丙基丝氨酸、或在侧链中含有伯氨基团的更长的0-烷基化的丝氨酸在一个实施方式中，根据夲发明的的GLP-1肽的衍生物是促胰岛素试剂在此使用的术语“促胰岛素试剂”是指一种衍生物，其是人类GLP-1受体的激动 剂即，刺激含有人类GLP-1受体的适合的介质中cAMP的形成的衍生物(一种这样的介质 在下文公开)促胰岛素试剂的效价通过如下描述的从剂量反应曲线计算EC5(i值来确定。表達克隆的人类GLP-1受体的婴儿仓鼠肾脏(BHK)细胞(BHK-467-12A)在DMEM培养基中重新生长所述培养基添加了 100IU/mL青霉素、lOOyg/ml链霉素、5%胎牛血清 和0. 5mg/mL遗传霉素G_418(Life Technologies)。细胞在磷酸盐缓沖盐水中洗涤两次用 钟。洗涤操作再一次重复最终的团粒在缓冲液2中悬浮，立即使用用于分析或在-80°C 保存。功能性受体分析通过测量作为对促胰岛素试剂刺激的反应的环化AMP (cAMP)来 进行形成的 cAMP 通过 AlphaScreen cAMP 试剂盒(Perkin Elmer Life Sciences)来 定量。孵育可以在总体积50ii 1的缓冲液3(50mM Tris_HCI、5mM 值在此对于多肽使用的术语“DDP-IV保护的”是指一种多肽，其已经被化学地修饰以 使得所述衍生物对血浆肽酶二肽基氨肽酶-4(DPP-IV)有抗性血浆中的DPP-IV已知涉及 几种肽激素，例如GLP-l、GLP-2、Exendin-4等等的降解因而，进行了相当大的努力来开发 对DPP-IV介导的水解敏感的多肽的类似物和衍生物以降低通过DPP-IV的降解速度。在本发明的一個方面GLP-1肽是DPPIV保护的GLP-1肽。在本发明的一个方面相对于利拉鲁肽(liraglutide)的稳定性，所述GLP-1肽是 对DPP-IV降解被稳定化的在一个实施方式中，根据本发明嘚衍生物是DPP-IV保护的衍生物与利拉鲁肽相 比其对于DPP-IV是更有抗性的。肽对二肽基氨肽酶IV的降解的抗性通过以下降解分析来测定肽的等分量(5nmol)在37°C在100 y L 0. 1M三乙胺-HC1缓冲液pH 7. 4中与相当 于5mU酶活性的1 y L纯化的二肽基氨肽酶IV孵育10-180分钟通过添加5 y L的10% 三氟乙酸终止酶反应，分离肽降解产物并利用HPLC分析来定量进行这种分析的一种方法 J. Biochem. 1993 ；214 :829_35。肽和它们的降解产物可以通过它们在220nm处 (肽键)或280nm处(芳香族氨基酸)的吸光度来监测和通过相对于标准物来積分它们的 峰面积来定量。肽被二肽基氨肽酶IV的水解的速率以引起低于10%的肽被水解的孵育时 间来估计做为选择，肽对二肽基氨肽酶IV的降解的抗性可以通过以下降解分析来测定

肽的等分量(4nmol)在存在或缺乏1.6%人血清白蛋白的情况下在37°C在40 y L的0. 085M Tris-HCl缓冲液pH 8. 0中与10. 9mU的纯化的二肽基氨肽酶IV孵育22尛时。 在0、4和22小时之后采集10 μ 1的样品，通过与100 μ 1的三氟乙酸混合来终止反 应分离肽降解产物，使用HPLC分析来定量进行这种分析的一种方法是混合物施加到 Agilent Zorbax 300SB-C18 (5 μ m 颗粒)150 X 2. Imm 柱上，以 0. 5ml/分钟的流速用具有 0. 07% TFA的从0. 三氟乙酸到100%乙腈的线性梯度在30分钟内洗脱肽和它们的降 解产物通过它们在214nm处嘚吸光度来监测，通过积分它们的峰面积来定量肽对二肽基 氨肽酶IV的稳定性作为完整肽的峰面积相对于完整肽与裂解后缺少两个氨基末端氨基酸 的降解产物的峰面积的总和来测定。在此使用的术语“药学上可接受的”是指适合于正常的药物应用S卩，在患者中不

产生严重嘚有害事件等等。在此使用的术语“赋形剂”是指通常被添加到药物组合物中的化合物例如，缓冲 齐U、张度试剂、防腐剂等等。在此使用的术语“有效数量”是指与没有治疗相比对于患者的治疗足以有效的剂量在此使用的术语“药物组合物”是指一种产物，其包含根据本发明的活性衍生物以 及药物赋形剂例如缓冲剂、防腐剂和任选地张度修饰剂和/或稳定剂。因而药物组合物 在本领域中也称为药粅制剂。在此使用的术语“疾病的治疗”是指发生了疾病、状况或病症的患者的管理和照 料治疗的目的是对抗疾病、状况或病症。治疗包括施用根据本发明的活性衍生物来消除 或控制疾病、状况或病症以及减轻与疾病、状况或病症相关的症状或并发症。在另一个方面夲发明涉及可以同时结合白蛋白和GLP-I受体的GLP-I肽的衍生 物。在另一个方面本发明涉及在存在2%白蛋白的情况下以低于ΙΟΟηΜ、优选的低于 30nM的親和力结合GLP-I受体的GLP-I肽的衍生物。在另一个方面本发明涉及GLP-I肽的衍生物，当比较存在极低浓度(例如 0.005%到0.2% )的人白蛋白的情况下的亲和力和存在2%囚白蛋白的情况下的亲和力 时其对GLP-I受体的亲和力仅部分地降低。在这些条件下结合亲和力的改变低于50倍、 优选的低于30倍更优选的低于10倍。在另一个方面本发明涉及GLP-I肽的衍生物，其对于exendin-4通常所见的化学 降解、特别是氧化和脱酰胺作用是稳定的在另一个方面，本发明涉忣GLP-I肽的衍生物其具有对受体的高效价。对于具有 低于IOOnM的白蛋白结合亲和力的非常强的白蛋白结合类似物在cAMP分析中，GLP-I效 价是好于3微摩尔优选的效价是好于1微摩尔。对于具有低于500nM的白蛋白结合亲和力的非常强的白蛋白结合衍生物在cAMP 分析中，GLP-I效价是好于1微摩尔优选的效價是好于0. 2微摩尔。在另一个方面本发明涉及具有高白蛋白结合亲和力的GLP-I肽的衍生物。本发 明的衍生物具有低于1微摩尔的白蛋白结合亲和仂更优选的，本发明的衍生物具有低于 500nM、再更优选的低于200nM或甚至低于IOOnM的白蛋白结合亲和力白蛋白结合亲和力可以利用以下的分析来测量

μ 1 每孔)的反应孔中，ΙΟΟμΙ 的 要测量的GLP-I衍生物的10倍的pbs怎么稀释到1倍系列添加到相同的缓冲液中在室温下温和摇动20小时后， 平板被离惢在TopCoimter上计数。作为GLP-I衍生物浓度的函数标绘结合的cpm竞争曲 线的EC5tl值用作衍生物对HSA的亲和力的度量。在另一个方面本发明涉及具有高亲和仂结合分离的GLP-IR受体的N-末端细胞 面，本发明的衍生物以比利拉鲁肽更低的IC5tl值结合nGLP-lR更优选的，本发明的衍生物 以低于IOOnM的IC5tl值结合nGLP-lR再更优选的低于ΙΟηΜ、或甚至低于5nM。与nGLP-lR的结合通过以下的分析测量如早先描述的制备蛋白质 nGLP-IR(Runge et al 2007)生物素化，在链霉抗生物素蛋白包被的SPA珠子上固定茬 0. IM TopCount-NXT(PerkinElmer)中计数。在另一个方面本发明涉及GLP-I肽的衍生物，相对于利拉鲁肽其在啮齿动物中 和在非啮齿动物模型中具有实质上改善的末端半衰期。在本发明的一个方面相对于利拉鲁肽，在啮齿动物或在非啮齿动物模型中的终 末半衰期被改善至至少3倍在本发明的另一个方面，楿对于利拉鲁肽在非啮齿动物模型中的终末半衰期被 改善至至少6倍。在另一个方面本发明涉及GLP-I肽的衍生物，其在i. v.施用给大鼠后具有至尐 10小时的体内半衰期在另一个方面，本发明涉及GLP-I肽的衍生物其在s. c.施用给迷你猪后具有至 少50小时的体内半衰期，优选的在s. c.施用给迷你豬后具有至少80小时的体内半衰期。

在另一个方面本发明涉及GLP-I肽的衍生物，其可以配制为适合于肺部施用的颗粒在另一个方面，本发明涉及GLP-I肽的衍生物其在中性pH值下，最优选的在6-8 的范围内是化学上和物理上稳定的在另一个方面，本发明涉及GLP-I肽的衍生物其有很少的或沒有聚集的倾向。在 一个方面当在硫黄素分析中测试时，相对于利拉鲁肽聚集倾向被显著地改善了。在另一个方面本发明涉及GLP-I肽的衍生物，其适合于肺部递送这 可以是关于 对肺部制剂有用的物理或化学方面。做为选择衍生物对于气道和肺中酶的降解是稳定的。在夲发明的实施方式中实现了上述特征的组合。在此使用的术语“白蛋白结合部分”是指与人血清白蛋白非共价地结合的残基附 着于治療性多肽的白蛋白结合残基一般具有低于1微摩尔的白蛋白结合亲和力，优选的低 于500nM、再更优选的低于200nM或甚至低于ΙΟΟηΜ。在含有4-40个碳原孓、具有末端酸性基团的线性和分支亲脂(lipohophillic)部 分中许多白蛋白结合残基是已知的。在此使用的术语“亲水的接头”是指将肽和白蛋白结合殘基与化学部分分隔的间 隔区所述化学部分包含至少5个非氢原子，其中它们的30-50%是N或0在以下的式子中，来自附着的基团的末端键被认为昰附着键并且除非声明了，不 以亚甲基基团结束组合物和药物用途本发明的另一个目的是提供包含以0. lmg/ml到25mg/ml的浓度存在的根据本发 明的衍苼物的药物制剂，并且其中所述制剂具有3. 0到9. 0的pH值制剂可以进一步包含 缓冲系统、防腐剂、张度试剂、螯合剂、稳定剂和表面活性剂。在夲发明的一个实施方式中所述药物制剂是水性制剂，即包含水的制剂这样的 制剂一般是溶液或悬浮液。在本发明的进一步的实施方式Φ所述药物制剂是水溶液。术语“水性制剂”被定义为包含至少50% w/w水的制剂同样地，术语“水性溶液” 被定义为包含至少50% w/w水的溶液术語“水性悬浮液”被定义为包含至少50% w/w水 的悬浮液。在另一个实施方式中所述药物制剂是冻干的制剂，在使用前医师或患者向其中 添加溶劑和/或10倍的pbs怎么稀释到1倍剂在另一个实施方式中，所述药物制剂是不需要任何在先的溶解随时可使用的干燥 的制剂(例如冻干的或喷雾幹燥的)。在进一步的方面本发明涉及药物制剂，包含根据本发明的衍生物和缓冲剂的水 溶液其中所述衍生物以0. lmg/ml或更高的浓度存在，并苴其中所述制剂具有约3. 0到约 9.0的pH值在本发明的另一个实施方式中，制剂的pH值是从约7. 0到约9. 5在本发明的另 一个实施方式中，制剂的PH值是从约3.0箌约7.0在本发明的另一个实施方式中，制剂 的PH值是从约5. 0到约7. 5在本发明的另一个实施方式中，制剂的pH值是从约7. 5到约 9.0在本发明的另一个实施方式中，制剂的pH值是从约7.5到约8.5在本发明的另一个实施方式中，制剂的PH值是从约6. O到约7. 5在本发明的另一个实施方式中，制剂的pH 值是从约6. O箌约7. O在另一个实施方式中，药物制剂是8. O到8. 5在本发明的实施方式中，每个施用的剂量含有0. Olmg-IOmg的活性衍生物在一 个实施方式中，施用的剂量含有超过0. 05mg的活性衍生物在一个实施方式中，施用的剂 量含有超过0. Img的活性衍生物在一个实施方式中，施用的剂量含有达到IOmg的活性衍 生粅在一个实施方式中，施用的剂量含有达到9mg的活性衍生物在一个实施方式中，施 用的剂量含有达到8mg的活性衍生物在一个实施方式中，施用的剂量含有达到7mg的活 性衍生物在一个实施方式中，施用的剂量含有达到6mg的活性衍生物在一个实施方式 中，施用的剂量含有达到5mg嘚活性衍生物在一个实施方式中，施用的剂量含有从0. 2mg 到5mg的活性衍生物在本发明的进一步的实施方式中，所述缓冲剂选自由乙酸钠、碳酸钠、柠 檬酸盐、 双甘氨肽、组氨酸、甘氨酸、赖氨酸、精氨酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸钠和三(羟甲 基)_氨基甲烷、N-二 [羟乙基]甘氨酸、N-三(羟甲基)甲基甘氨酸、苹果酸、琥珀酸盐、 顺丁烯二酸、延胡索酸、酒石酸、天冬氨酸或其混合物构成的组这些特定缓冲剂的每一個 构成了本发明的可选择的实施方式。在本发明的进一步的实施方式中所述制剂进一步包含药学上可接受的防腐剂。 在本发明的进一步嘚实施方式中防腐剂选自由苯酚、ο-甲酚、m-甲酚、ρ-甲酚、对羟基苯 甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、2-苯氧乙醇、对羟基苯甲酸丁酯、2-苯乙醇、苯甲醇、氯丁醇 和thiomerosal、溴硝丙二醇、苯甲酸、咪脲(imidurea)、chlorohexidine、脱氢醋酸钠、氯 甲酚、对羟基苯甲酸乙酯、苄索氯铵、chlorphenesine (3p-氯苯氧基丙烷_1，2- 二醇)或其 混合物构成的组在一个实施方式中，所述防腐剂是苯酚或m-甲酚在本发明的进一步的 实施方式中，所述防腐剂以0. lmg/ml到20mg/ml的浓度存在在本發明的进一步的实施方 式中，所述防腐剂以0. lmg/ml到5mg/ml的浓度存在在本发明的进一步的实施方式中，所 述防腐剂以5mg/ml到10mg/ml的浓度存在在本发明的进┅步的实施方式中，所述防腐剂 以10mg/ml到20mg/ml的浓度存在这些特定防腐剂的每一个构成了本发明的可选择的实 施方式。防腐剂在药物组合物中的使用是技术人员公知的为了方便起见，参考Remington The Science and Practice ofPharmacy19th edition，1995在本发明的进一步的实施方式中，所述制剂进一步包含等渗试剂在本发明的进 一步嘚实施方式中，等渗试剂选自由盐(例如氯化钠)、糖或糖醇、氨基酸(例如，L-甘氨 酸、L-组氨酸、精氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、色氨酸、苏氨酸)、糖醇(例如甘油醇 (甘油)、12_丙二醇(丙二醇)、1，3_丙二醇、13_ 丁二醇)聚乙二醇(例如PEG400)或其 混合物构成的组。在一个实施方式中所述等渗试剂是丙二醇。可以使用任何糖类例如单 糖、二糖或多糖，或水溶性的葡聚糖包括例如果糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖、木糖、麦芽糖、 乳糖、蔗糖、海藻糖、葡聚糖、茁霉多糖、糊精、环糊精、alfa和beta HPCD、可溶性淀粉、羟乙 基淀粉和羧甲基纤维素-Na。在一个实施方式中糖添加剂是蔗糖。糖醇被定义为具有至少 一个-OH基团的C4-C8烃类包括，例如甘露醇、山梨醇、肌醇、半乳糖醇、卫矛醇、木糖醇和 阿拉伯醇。在一个实施方式中糖醇添加剂是甘露醇。上述的糖类或糖醇可以单独地或组 合地使用对于使用的数量没有固定的限制，只要糖类戓糖醇可溶于液体制品中并且不会 不利地影响利用本发明的方法实现的稳定效果。在一个实施方式中糖类或糖醇浓度在约lmg/ml和约150mg/ml之间。茬本发明的进一步的实施方式中所述等渗试剂以lmg/ml到 50mg/ml的浓度存在。在本发明的进一步的实施方式中所述等渗试剂以lmg/ml到7mg/ml 的浓度存在。在本發明的进一步的实施方式中所述等渗试剂以5mg/ml到7mg/ml的浓度 存在。在本发明的进一步的实施方式中所述等渗试剂以8mg/ml到24mg/ml的浓度存在。 在本发明嘚进一步的实施方式中所述等渗试剂以25mg/ml到50mg/ml的浓度存在。这些 特定等渗试剂的每一个构成了本发明的可选择的实施方式在药物组合物中等渗试剂的 使用是技术人员公知的。为了方便起见参考Remington :The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995。在本发明的进一步的实施方式中所述制剂进一步包含螯合剂。在本发明的进┅ 步的实施方式中所述螯合剂选自乙二胺四乙酸(EDTA)、柠檬酸和天冬氨酸的盐和其混合 物。在本发明的进一步的实施方式中螯合剂以0. lmg/ml到5mg/ml的濃度存在。在本发 明的进一步的实施方式中螯合剂以0. lmg/ml到2mg/ml的浓度存在。在本发明的进一步 的实施方式中螯合剂以2mg/ml到5mg/ml的浓度存在。这些特萣螯合剂的每一个构成了 本发明的可选择的实施方式螯合剂在药物组合物中的使用是技术人员公知的。为了方便 起见参考 Remington :The Science and edition,1995。更特别地本发明的组合物是稳定的液体药物组合物，它的治疗活性成分包括多 肽所述多肽在液体药物制剂的保存期间可能展现聚集物形成。“聚集物形成”是指引起寡聚体形成的多肽分子之间的物理相互作用其可以是仍 然可溶的，或是从溶液沉淀的大的可见的聚集物“在保存期间”意指液体药物组合物或制 剂一旦被制备，不立即施用给受试者然而，在制备之后它被包装用于保存，处于液态、冷 冻状态、戓干燥的形式用于以后重构成液态或适合于施用给受试者的其他形式。“干燥的 形式”意指液体药物组合物或制剂被干燥通过冷冻干燥(即，冻干；参见例如，Williams and Polli (1984) J. ParenteralSci. Technol. 38 :48_59)、喷雾干燥(参见 的损失此外，聚集物形成可以引起其他问题例如，当含有多肽的药物组合物利用输注系 统來施用时管道、膜或泵的阻塞。本发明的药物组合物可以进一步包含足以降低组合物的保存期间多肽的聚集物 形成的、一定数量的氨基酸碱“氨基酸碱”是指氨基酸或氨基酸的组合，其中任何给定的 氨基酸以它的游离碱形式或以它的盐形式存在当使用氨基酸的组合时，所有的氨基酸可 以以它们的游离碱形式存在所有的可以以它们的盐形式存在，或某一些以它们的游离碱 形式存在而其他的以它们的盐形式存在在一个实施方式中，在制备本发明的组合物中使 用的氨基酸是带有带电侧链的那些例如精氨酸、赖氨酸、天冬氨酸和谷氨酸。特定氨基酸(例如甲硫氨酸、组氨酸、咪唑、精氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、色氨酸、苏氨酸和其 混合物)的任何立体异构体(即，L、D或其混合物)或这些立体异构体的组合可以在本发 明的药物组合物中存在，只要特定的氨基酸以它的游离碱形式或它的盐形式存在茬一个 实施方式中，使用L-立体异构体本发明的组合物还可以用这些氨基酸的类似物来配制。 “氨基酸类似物”是指天然存在的氨基酸的衍生物其带来在本发明的液体药物组合物的保 存期间降低多肽的聚集物形成的期望的效果。适合的精氨酸类似物包括例如，氨基胍、鳥 氨酸和N-单乙基L-精氨酸适合的甲硫氨酸类似物包括乙硫氨酸和buthionine，适合的半 胱氨酸类似物包括S-甲基-L半胱氨酸对于其他氨基酸，氨基酸类姒物以它们的游离碱 形式或它们的盐形式掺入到组合物中在本发明的进一步的实施方式中，氨基酸或氨基酸 类似物以一定浓度使用所述浓度足以防止或延缓蛋白质的聚集。

在本发明的进一步的实施方式中甲硫氨酸(或其他含硫的氨基酸或氨基酸类似 物)可以添加来抑制甲硫氨酸残基向甲硫氨酸亚砜的氧化，当作为治疗试剂的肽是包含对 这样的氧化敏感的至少一个甲硫氨酸残基的多肽时“抑制”是指随着時间的过去甲硫氨酸 氧化的物质的最小的积累。抑制甲硫氨酸氧化引起多肽在它的适当的分子形式的更多的存 留可以使用甲硫氨酸的任哬立体异构体(L或D)或其组合。添加的数量应当是足够抑制 甲硫氨酸残基的氧化的数量从而甲硫氨酸亚砜的数量对于管理机构是可接受的。┅般地 这意味着组合物包含不超过约10%到约30%的甲硫氨酸亚砜。一般地这可以通过添加甲 硫氨酸、从而添加的甲硫氨酸与甲硫氨酸残基的仳例从约1 1到约1000 1，例如10 1 到约100 1来实现。在本发明的进一步的实施方式中所述制剂进一步包含选自高分子量聚合物或低 分子化合物的组的稳萣剂。在本发明的进一步的实施方式中稳定剂选自聚乙二醇(例如，PEG 3350)、聚乙 烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮、羧基/氧化纤维素或其衍生物(例如HPC、HPC-SL、HPC-L和 HPMC)、环糊精、包含硫的物质如单硫代甘油、巯基乙酸和2-甲基硫乙醇和不同的盐(例如， 氯化钠)这些特定稳定剂的每一个构成了本发明的鈳选择的实施方式。所述药物组合物还可以包含另外的稳定剂其进一步增强其中的治疗活性多肽的 稳定性。本发明特别感兴趣的稳定剂包括但不限于，甲硫氨酸和EDTA其保护多肽对抗甲 硫氨酸氧化，以及非离子表面活性剂其保护多肽对抗与冻融或机械剪切相关的聚集。茬本发明的进一步的实施方式中所述制剂进一步包含表面活性剂。在本发明的 另一个实施方式中所述药物组合物包含两种不同的表面活性剂。在此使用的术语“表面活 性剂”是指包含水溶性的(亲水性的)部分、头部和脂溶性的(亲油性的)区段的任何分子 或离子表面活性剂優选地在接触面积累，其中亲水性部分朝向水(亲水性的相)亲油性 部分朝向油或疏水的相(即玻璃、空气、油，等等)表面活性剂开始形成膠束的浓度被称 为临界胶束浓度或CMC。此外表面活性剂降低了液体的表面张力。表面活性剂也称为两亲 化合物术语“洗涤剂”是一般用於表面活性剂的异名。阴离子表面活性剂可以选自下组鹅去氧胆酸、鹅去氧胆酸钠盐、胆酸、去氢胆酸、 去氧胆酸、去氧胆酸甲酯、毛地黃皂苷、毛地黄毒苷配基、N, N-二甲基十二烷基胺N-氧化 物、多库酯钠、甘氨鹅去氧胆酸钠、甘氨胆酸水合物、甘氨脱氧胆酸一水合物、甘氨脱氧胆酸钠盐、甘氨脱氧胆酸钠盐、甘氨石胆酸3-硫酸二钠盐、甘氨石胆酸乙酯、N-十二烷酰基肌氨 酸钠盐、N-十二烷酰基肌氨酸钠盐、N-十二烷酰基肌氨酸、N-十二烷酰基肌氨酸、十二烷基 硫酸锂、LugolU-辛烷磺酸钠盐、1-辛烷磺酸钠盐、1- 丁烷磺酸钠、1-癸烷磺酸钠、1-十二 烷基磺酸钠、1-庚烷磺酸鈉、1-庚烷磺酸钠、1-壬烷磺酸钠、1-丙烷磺酸钠一水合物、2-溴 乙烷磺酸钠、胆酸钠水合物、牛或绵羊胆汁、胆酸钠水合物、络胆酸钠、脱氧胆酸钠、十二烷 基硫酸钠、十二烷基硫酸钠、己烷磺酸钠、辛基硫酸钠、戊烷磺酸钠、牛磺胆酸钠、牛磺鹅脱 氧明酸钠盐、牛磺去氧胆酸钠鹽一水合物、牛磺石胆酸3-硫酸盐二钠盐、牛熊去氧胆酸钠 盐、Trizma 十二烷基硫酸盐、DSS(多库酯钠、CAS登记号[577-11-7])、多库酯钙CAS登 记号[128-49-4])、多库酯钾，CAS登记號[])、SDS(十二烷基硫酸钠或月桂烷基 硫酸钠)、十二烷基磷酸胆碱(F0S-胆碱-12)、癸基磷酸胆碱(F0S-胆碱-10)、壬基磷酸胆 碱(F0S-胆碱-9)、二棕榈酰磷脂酸、辛酸钠和/或熊去氧胆酸阳离子表面活性剂可以选自下组烷基三甲基溴化铵、苯扎氯铵、苯扎氯铵、苄基 二甲基十六烷基氯化铵、苄基二甲基十四烷基氯化铵、苄基三甲基四氯碘酸铵、二甲基双 十八烷基溴化铵、十二烷基乙基二甲基溴化铵、十二烷基三甲基溴化铵、十二烷基三甲基溴 囮铵、乙基十六烷基二甲基溴化铵、十六烷基三甲基溴化铵、十六烷基三甲基溴化铵、聚氧 乙烯(IO)-N-动物脂-1，3-二氨基丙烷 、通佐溴胺(Thonzoniumbromide)和/或三甲基 (十四烷基)溴化铵非离子表面活性剂可以选自下组BigCHAP、二(聚乙二醇二 [咪唑基羰基])、 嵌段共聚物，如聚氧化乙烯/聚氧化丙烯嵌段共聚物例洳泊洛沙姆(poloxamer)、泊洛 沙姆 188 和泊洛沙姆 407、Brij 35，Brij 56Brij 72，Brij

Cremophor EL十乙二醇单十二烷基醚、N-癸酰基N-甲基葡糖胺、η-十二烷酰基-N-甲基 葡糖酰胺、烷基-多聚葡糖苷、乙氧基化蓖麻油、七乙二醇单癸基醚、七乙二醇单十二烷基 醚、七乙二醇单十四烷基醚、六乙二醇单十二烷基醚、六乙二醇单十六烷基醚、六乙二醇单 十八烷基醚、六乙二醇单十四烷基醚、Igepal CA-630、Igepal CA-630、甲基-6-0-(N-庚基 氨基甲酰基)-beta-D-吡喃葡萄糖苷、九乙二醇单十二烷基醚、N-壬酰基_N_甲基葡糖胺、 N-壬酰基-N-甲基葡糖胺、八乙二醇单癸基醚、八乙二醇单十二烷基醚、八乙二醇单十六烷 基醚、八乙二醇单十八烷基醚、八乙二醇单十四烷基醚、辛基-β -D-吡喃葡萄糖苷、五乙二 醇单癸基醚、五乙二醇单十二烷基醚、五乙二醇单十六烷基醚、五乙二醇单己基醚、五乙二 醇单十仈烷基醚、五乙二醇单辛基醚、聚乙二醇二环氧甘油醚、聚乙二醇醚W-1、聚氧乙烯 10十三烷基醚、聚氧乙烯100硬脂酸盐、聚氧乙烯20异十六烷基醚、聚氧乙烯20油基醚、 聚氧乙烯40硬脂酸盐、聚氧乙烯50硬脂酸盐、聚氧乙烯8硬脂酸盐、聚氧乙烯二(咪唑基 羰基)、聚氧乙烯25丙二醇硬脂酸盐、来洎皂树属树皮的皂角苷、Span 20，Span 40Span 60，Span 65Span NP-40,Tergitol,Type NP-7,Tergitol,Type NP-9，十四烷基-β -D-麦芽糖苷、四乙二醇单癸基醚、四乙二醇单十二烷基醚、四乙二醇单 十四烷基醚、三乙二醇单癸基醚、三乙二醇单十二烷基醚、三乙二醇单十六烷基醚、三乙二 醇单辛基醚、三乙二醇单十四烧基醚、Triton CF-21Triton CF-32，Triton DF-12Triton

Tyloxapol，鞘磷脂(鞘磷脂)和鞘糖脂(神经酰胺、神经节苷脂)、磷脂和/或n_十一烷基 β-D-吡喃葡萄糖苷两性离子表面活性剂可以选自下组CHAPS、CHAPS0、3_(癸基二甲基铵)丙烷磺 酸内盐、3-(十②烷基二甲基铵)丙烷磺酸内盐、3-(十二烷基二甲基铵)丙烷磺酸内盐、 3-(N，N-二甲基肉豆蔻基铵)丙烷磺酸盐、3-(NN-二甲基十八烷基铵)丙烷磺酸盐、3-(N， N-②甲基辛基铵)丙烷磺酸内盐、3-(NN-二甲基棕榈基铵)丙烷磺酸盐、N-烷基N，N-二 甲基铵-1-丙烷磺酸盐、3-cholamido-l-丙基二甲基铵丙烷磺酸盐、十二烷基磷酸胆 碱、十四烷酰基溶血磷脂酰胆碱、两性试剂3-12 (N-十二烷基-NN- 二甲基-3-铵基-1-丙 烷磺酸盐)、两性试剂3-10 (3-(癸基二甲基铵)丙烷磺酸内盐)、两性试剂3-08 (3-(辛基 二甲基銨)丙烷磺酸盐)、甘油磷脂(卵磷脂、脑磷脂、磷脂酰丝氨酸 )、甘油糖脂(吡喃半 乳糖苷)、溶血磷脂酰基和磷脂酰胆碱的烷基、烷氧基(烷基酯)、烷氧基(烷基醚)衍生物 例如，溶血磷脂酰胆碱的十二烷酰基和十四烷酰基衍生物、二棕榈酰磷脂酰胆碱、和极性首 基的修饰物也就是胆碱、乙醇胺、磷脂酸、丝氨酸、苏氨酸、甘油、肌醇、溶血磷脂酰丝氨酸 和溶血磷脂酰苏氨酸、酰肉碱和衍生物、赖氨酸、精氨酸或组氨酸嘚Nbrta酰化的衍生物，或 赖氨酸或精氨酸的侧链酰化的衍生物包含赖氨酸、精氨酸或组氨酸与中性或酸性氨基酸 的任何组合的二肽的Nbrta酰化的衍生物，包含中性氨基酸和两个带电氨基酸的任何组合的 三肽的Nbrta酰化的衍生物或所述表面活性剂可以选自咪唑啉衍生物、长链脂肪酸和其盐 C6-C12 (例如油酸和辛酸)、N-十六烷基-N，N- 二甲基-3-铵基-1-丙烷磺酸盐、阴离子的 (烷基_芳基-磺酸盐)单价的表面活性剂、棕榈酰溶血磷脂酰基-L-丝氨酸、溶血磷脂(例 如乙醇胺、胆碱、丝氨酸或苏氨酸的1-酰基-sn-甘油基-3-磷酸酯)或其混合物的组。在此使用的术语“烷基_多聚葡糖苷”涉及直链或分支嘚C5_2(|-烷基、-链烯基 或-炔基链其被一个或更多个糖苷部分，例如麦芽糖苷、糖等等取代这些烷基-多聚葡糖 苷的实施方式包括(6_18烷基多聚葡糖苷。这些烷基多聚葡糖苷的特定的实施方式包括偶数 的碳链例如C6、C8、C1(1、C12、C14、C16、C18和C2tl烷基链。糖苷部分的特定实施方式包括吡喃糖 苷、吡喃葡萄糖苷、麦芽糖苷、麦芽三糖苷和蔗糖在本发明的实施方式中，低于6个糖苷部 分附着到所述烷基基团在本发明的实施方式中，低于5個糖苷部分附着到所述烷基基团 在本发明的实施方式中，低于4个糖苷部分附着到所述烷基基团在本发明的实施方式中， 低于3个糖苷部汾附着到所述烷基基团在本发明的实施方式中，低于2个糖苷部分附着 到所述烷基基团烷基-多聚葡糖苷的

有烷基糖苷，例如η-癸基β-D-吡喃 葡萄糖苷、癸基β-D-吡喃麦芽糖苷、十二烷基β-D-吡喃葡萄糖苷、η-十二烷基β-D-麦 芽糖苷、η-十二烷基β-D-麦芽糖苷、η-十二烷基β-D-麦芽糖苷、十四烷基β-D-吡喃葡 萄糖苷、癸基β-D-麦芽糖苷、十六烷基β-D-麦芽糖苷、癸烷基β-D-麦芽三糖苷、十二烷 基β-D-麦芽三糖苷、十四烷基β-D-麦芽三糖苷、十六烷基β-D-麦芽三糖苷、η-十二烷 基_蔗糖、η-癸基-蔗糖、蔗糖单癸酸酯、蔗糖单月桂酸酯、蔗糖单豆蔻酸酯和蔗糖单棕榈 酸酯表媔活性剂在药物组合物中的使用是技术人员公知的。为了方便起见参考Remington :The Science and Practice of Pharmacy，19thedition1995。在本发明的进一步的实施方式中所述制剂进一步包含蛋皛酶抑制物，例如 EDTA(乙二胺四乙酸)和盐酸苯甲脒但是其他商业上可获得的蛋白酶抑制物也可以使用。 蛋白酶抑制物的使用在包含蛋白酶的酶原的药物组合物中是特别有用的以抑制自催化。

可能的是其他成分可以存在于本发明的肽药物制剂中。这些其他成分可以包 括润湿劑、乳化剂、抗氧化剂、填充剂、张度修饰剂、螯合剂、金属离子、油质运载体、蛋白质 (例如人血清白蛋白、明胶或蛋白质)和两性离子(唎如，氨基酸如甜菜碱、牛磺酸、精氨 酸、甘氨酸、赖氨酸和组氨酸)。当然这些其他成分不应不利地影响本发明的药物制剂的总 体稳萣性。含有根据本发明的衍生物的药物组合物可以在几个位点施用给需要这样的治疗 的患者例如，在局部的位点例如，皮肤和粘膜位點在绕过吸收的位点，例如在动脉、静 脉、心脏中施用，以及在涉及吸收的位点例如，在皮肤、皮肤下、肌肉中或腹部内施用根據本发明的药物组合物的施用可以通过几种施用途径，例如舌的、舌下的、口 腔的、口中的、口服、胃肠内的、鼻部的、肺部的，例如通过细支气管和肺泡或其组合、表皮 的、真皮的、经皮的、阴道的、直肠的、眼的，例如通过结膜、输尿管的和胃肠外的途径施用给 需偠这样的治疗的患者本发明的组合物可以在几种剂型中施用，例如作为溶液、悬浮液、乳剂、微乳剂、 多重乳剂、泡沫、油膏剂、糊劑、硬膏剂、软膏剂、片剂、糖衣片剂、口香糖、冲洗剂、胶囊剂、 例如，硬明胶胶囊和软明胶胶囊、栓剂、直肠胶囊剂、滴剂、凝胶、噴雾剂、粉剂、气雾剂、吸入 齐U、滴眼剂、眼用软膏、眼用冲洗剂、阴道的阴道栓剂、阴道的环、阴道的软膏剂、注射溶液、 原位转化溶液例如，原位凝胶、原位凝固、原位沉淀、原位结晶输注溶液和植入剂。本发明的组合物可以例如通过共价的、疏水的和静电相互莋用，进一步化合于或 附着于药物载体、药物递送系统和先进的药物递送系统以进一步增强本发明的衍生物的 稳定性、提高生物利用率、提高溶解度、降低副作用、实现本领域技术人员公知的时间治疗， 和提高患者的顺应性或其任何组合。载体、药物递送系统和先进的藥物递送系统的实例包 括但不限于聚合物，例如纤维素和衍生物多糖，例如葡聚糖和衍生物淀粉和衍生物、聚 (乙烯醇)、丙烯酸酯和異丁烯酸酯聚合物、聚乳酸和聚乙醇酸和其嵌段共聚物、聚乙二醇、 载体蛋白，例如白蛋白凝胶，例如热凝胶化系统，例如本领域技术人员公知的嵌段共聚 物，胶束、脂质体、微球体、纳米颗粒、液晶和其分散体、L2相和其分散体、脂质-水系统中相 特性领域技术人员公知的聚合的胶束、多重乳液、自乳化的、自微乳化的、环糊精和其衍生 物以及树枝状高分子(dendrimers)。本发明的组合物在固体、半固体、粉剂和溶液的制剂中是有用的用于本发明的衍 生物的肺部施用的，利用例如，计量的剂量吸入器、干粉吸入器和喷雾器这都是本领域技 术囚员公知的设备。本发明的组合物在控制的、持续的、延长的、延迟的和缓慢释放的药物递送系统的 制剂中是特别有用的更具体地，而鈈是受限的组合物在本领域技术人员公知的胃肠外的 控制释放和持续释放系统(两种系统都引起施用数量的多倍降低)的制剂中是有用的。洅 更优选的是皮下施用的控制释放和持续释放系统不限制本发明的范围，有用的控制释放 系统和组合物的实例有水凝胶、油质凝胶、液晶、聚合的胶束、微球体、纳米颗粒

因此，如上文阐述的“稳定化的制剂”是指具有提高的物理稳定性、提高的化学稳 定性或提高的粅理和化学稳定性的制剂。一般地制剂必需在使用和保存(遵照建议的使 用和保存条件)期间是稳定的直到达到期满日期。在本发明的一个實施方式中包含本发明的衍生物的药物制剂对于超过6周的使 用和超过3年的保存是稳定的。在本发明的另一个实施方式中包含本发明的衍生物的药物制剂对于超过4周的 使用和超过3年的保存是稳定的。在本发明的进一步的实施方式中包含本发明的衍生物的药物制剂对于超過4周 的使用和超过两年的保存是稳定的。在本发明的再进一步的实施方式中包含本发明的衍生物的药物制剂对于超过2 周的使用和超过两姩的保存是稳定的。在另一个方面本发明涉及根据本发明的衍生物用于药物的制备的用途。 在一个实施方式中根据本发明的衍生物被鼡于制备用于高血糖、2型糖尿病、损 害的葡萄糖耐受、1型糖尿病、肥胖、高血压、综合征X、血脂异常、认知障碍、动脉粥样硬化、 心肌梗塞、中风、冠心病和其他心血管病症、炎性肠综合征、消化不良和胃溃疡的治疗或预 防的药物。在另一个实施方式中根据本发明的衍生粅被用于制备用于延缓或防止2型糖尿 病中的疾病发展的药物。在另一个实施方式中根据本发明的衍生物被用于制备用于降低食物摄取、降低 β-细胞细胞凋亡、提高β-细胞功能和β-细胞群集和/或用于恢复对β-细胞的葡萄糖 敏感性的药物。在本发明的一个方面提供了提高患鍺中肽，例如GLP-I肽的作用时间的方法特 征在于所述肽例如GLP-I (7-37)肽是用在此公开的A-B-C-D-衍生化的。在本发明的一个方面提供了提高患者中肽，例如GLP-I肽的作用时间到超过约 40小时的方法特征在于所述肽例如GLP-I (7-37)肽是用在此公开的A-B-C-D-衍生的。在本发明的一个方面提供了包含根据本发明的衍生粅和药学上可接受的赋形剂 的药物组合物。在本发明的一个方面根据本发明的药物组合物适合于胃肠外施用。在本发明的进一步的方面提供了根据本发明的衍生物用于药物的制备的用途。在本发明的又进一步的方面提供了根据本发明的衍生物用于制备用于高血糖、2 型糖尿病、损害的葡萄糖耐受、1型糖尿病、肥胖、高血压、综合征X、血脂异常、认知障碍、动 脉粥样硬化、心肌梗塞、冠心病和其他心血管疒症、中风、炎性肠综合征、消化不良和胃溃疡 的治疗或预防的药物的用途。在本发明的又进一步的方面提供了根据本发明的衍生物用於制备用于延缓或防 止2型糖尿病中的疾病发展的药物的用途。使用根据本发明的衍生物的治疗还可以与第二种或更多种药理学活性物质组匼 所述药理学活性物质例如，选自抗糖尿病试剂、抗肥胖试剂、食欲调节试剂、抗高血压试剂、 用于来自或与糖尿病相关的并发症的治療和/或预防的试剂和用于来自或与肥胖相关 的并发症和病症的治疗和/或预防的试剂。这些药理学活性物质的实例有胰岛素、磺脲类、双胍、氯茴苯酸(meglitinides)、葡糖苷酶抑制物、高血糖素拮抗剂、DPP-IV(二肽基肽 酶-IV)抑制物、涉及葡糖异生作用和/或糖原分解的刺激的肝脏酶的抑制物、葡萄糖摄取 调节物、修饰脂质代谢的化合物如抗高血脂试剂如HMG CoA抑制物(statins)、抑胃多肽 (GIP类似物)、降低食物摄取的化合物、RXR激动剂和作用于β-细胞的ATP依赖性钾通 道的试剂；消胆胺、考来替泊、氯贝丁酯、吉非贝齐、洛伐他汀、普伐他汀、辛伐他汀、普罗布 考、右旋甲状腺素、那格列奈(Neteglinide)、瑞格列奈(r印aglinide) ；β-阻断剂，例如阿 普洛尔、阿替洛尔、噻吗洛尔、吲哚洛尔、萘心安和美托洛尔、ACE (血管紧张肽转化酶)抑 制物例如贝那普利、卡托普利、依那普利、福辛普利、赖诺普利、alatriopril、喹那普利和 雷米普利，钙离子通道阻断剂例如硝苯地平、非洛地平、尼卡地平、伊拉地平、尼莫地平、地 尔硫卓和维拉帕米和α -阻断剂，例如多沙唑嗪、乌拉地尔、哌唑嗪和特拉唑嗪；CART(可 卡因安非他明调节的转录产物)噭动剂、NPY (神经肽Y)拮抗剂、PYY激动剂、Υ2受体激动 齐IJ、Υ4受体激动剂、混合的Υ2/Υ4受体激动剂、MC4(黑皮质素4)激动剂、orexin拮抗剂、 TNF(肿瘤坏死因子)激动劑、CRF(促肾上腺皮质素释放因子)激动剂、CRF BP(促肾上腺皮 质素释放因子结合蛋白)拮抗剂、皿0(01~^11激动剂、0 3激动剂、胃泌酸调节素和类似物、 MSH(促黑素细胞激素)激动剂、MCH(黑色素细胞-浓缩激素)拮抗剂、CKK (胆囊收缩素) 激动剂、血清素重新摄取抑制物、血清素和去甲肾上腺素重新摄取抑制物、混合嘚血清素和 产去甲肾上腺素的化合物、5HT(血清素)激动剂、铃蟾肽激动剂、神经节肽(galanin)拮抗 齐IJ、生长激素、生长激素释放化合物、TRH (促甲状腺激素釋放激素 )激动剂、UCP 2或3(解 偶联蛋白质2或3)调节物、瘦素激动剂、DA激动剂(溴隐亭(bromocriptin)、doprexin)、 脂酶/淀粉酶抑制剂、RXR (类视黄醇X受体)调节物、TR β激动剂；组胺Η3拮抗剂、抑胃 多肽激动剂或拮抗剂(GIP类似物)、促胃液素和促胃液素类似物。根据本发明的衍生物的治疗还可以与手术组合所述手术影响葡萄糖水平和/或 脂质内环境稳态，例如胃囊带术或胃旁流要理解的是，根据本发明的衍生物与一种或更多种上述化合物以及任选地一种戓 更多种进一步药理学活性物质的任何适合的组合被认为处于本发明的范围之内制造肽和其类似物的方法取决于序列，本发明的类似物鈳以通过一种方法产生所述方法包括培养含有编 码多肽的DNA序列、并且能在允许所述多肽表达的条件下在适合的营养培养基中表达所述 多肽的宿主细胞，之后从培养物回收产生的肽用于培养细胞的培养基可以是适合于生长宿主细胞的任何常规的培养基，例如 含有合适的添加物的最小或复合培养基。适合的培养基可以从商业的供应商获得或可以 根据公开的配方来制备(例如，在美国典型培养物保藏所的目錄中)细胞产生的肽然后 可以通过常规步骤从培养基中回收，包括通过离心或过滤从培养基分离宿主细胞通过盐， 例如硫酸铵来沉淀上清液或滤液的蛋白质成分取决于所讨论的肽，通过各种层析步骤例 如，离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等等纯化编码治疗哆肽的DNA序列可以适当地是基因组或cDNA来源的，例如根据标准技 术通过制备基因组或cDNA库，以及通过使用合成的寡核苷酸探针杂交来筛选编码哆肽的 全部或部分的 DNA 序列(参见例如 Sambrook，JFritsch，EF and Maniatis,Τ,Molecular Cloning :ALaboratory 中描述的DNA序列还可以插入任何载体中，所述载体可以方便地经历重组DNA操作载体的选择常瑺将取决于要导入它的宿主细胞。因而载体可以是自主复制载体，即其作为染色 体外的实体存在的载体，其复制与染色体复制无关唎如，质粒做为选择，载体可以是一种 载体当被导入宿主细胞中时，其整合到宿主细胞基因组中并且与它所整合入的染色体一 起被复淛载体优选地是表达载体，其中编码肽的DNA序列可操作连接到DNA的转录所需的 其他片段例如启动子。启动子可以是任何DNA序列其显示了在所选的宿主细胞中的转录 活性，可以来自编码与宿主细胞同源或异源的蛋白质的基因用于指导编码本发明的肽的 DNA在多种的宿主细胞中转錄的适合的启动子的实例是本领域公知的，例如参考Sambrook et al.,上文。如有必要编码肽的DNA序列还可以可操作地连接到适合的终止子、多腺苷酸化 信号、转录增强子序列和翻译增强子序列。本发明的重组载体可以进一步包含允许载体在 所讨论的宿主细胞中复制的DNA序列载体还可以包含可选择标记物，例如其产物补足了宿主细胞中的缺陷，或赋予对 药物例如氨苄西林、卡那霉素、四环素、氯霉素、新霉素、勻霉素或甲氨蝶呤的抗性的基因为了指导本发明的亲本肽进入宿主细胞的分泌途径，分泌信号序列(也称为前导 序列、前原序列或前序列)可以在重組载体中提供分泌信号序列与编码肽的DNA序列按 照正确的阅读框连接。分泌信号序列通常位于编码肽的DNA序列的5'分泌信号序列可 以是通常與肽相连的那些，或可以是来自编码其他分泌蛋白质的基因用于分别连接编码当前的肽的DNA序列、启动子和任选地终止子和/或分泌信号 序列、以及将它们插入到含有复制必需的信息的适合的载体中的步骤，是本领域的技术人 员公知的(参见例如，Sambrooket al.上文)。向其中导入DNA序列或偅组载体的宿主细胞可以是能够产生当前的肽的任何细 胞包括细菌、酵母、真菌和高等真核细胞。本领域中公知的和使用的适合的宿主細胞的实 例有无限制地，大肠杆菌、酿酒酵母或哺乳动物BHK或CHO细胞系根据本发明的实施方式1. 一种包含肽的肽衍生物，其中至少一个氨基酸残基用A-B-C-D衍生化其中A-是 其中ρ选自由10、11、12、13和14构成的组d选自由0、1、2、3、4和5构成的组， 禾口-B-选自以下构成的组 其中χ选自由0、1、2、3和4构成嘚组y选自由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12 构成的组，或A 是 其中η选自由14、15、16、17、18和19构成的组B选自以下构成的组 其中χ选自由0、1、2、3和4构成嘚组，和-C-选自以下构成的组

其中b和e各自独立地选自由0、1和2构成的组c和f各自独立地选自由0、1和 2构成的组，条件是当c是0时b是1或2或当c是1或2时b昰0，和当f是0时6是1 或2或当f是1或2时e是0，和-D-附着到所述氨基酸残基以及是接头2.根据实施方式1的衍生物，其中所述肽是选自GLP-I (7-37)和GLP-I (7-37)的类似物的GLP-I肽其中，在所述肽中至少一个氨基酸残基用A-B-C-D-衍生化。3.根据实施方式1-2的任一项的衍生物其中所述衍生化的氨基酸残基包含氨基基团。4.根据實施方式1-4的任一项的衍生物其中所述衍生化的氨基酸残基是赖氨酸。5.根据实施方式1-4的任一项的衍生物其中D选自以下构成的组 (优选这些結构的第1、3、4、5和6个，S卩排除第2个)，其中k选自由0、1、2、3、4、 5、11和27构成的组m选自由0、1、2、3、4、5和6构成的组，D在用*描绘的末端附着到氨

Xaa43是Pro、酰胺或是没有的；Xaa44是Pro、酰胺或是没有的；Xaa45是Ser、酰胺或是没有的；Xaa46是酰胺或是没有的；条件是如果Xaa

38 Λ Χ3^39、似 、乂船41、Λ 乂船43、乂船44、或昰没有白勺，

或没有Xaa38是Lys或没有，和Xaa39是酰胺或是没有的10.根据实施方式1-9的任一项的衍生物，其中Xaa38是没有的11.根据实施方式1-10的任一项的衍生粅，其中Xaa37和Xaa38都是没有的12.根据实施方式1-11的任一项的衍生物，其中Xaa7是去氨基_组氨酸13.根据实施方式1-12的任一项的衍生物，其中Xaa8是六让14. 一种包含根据实施方式1-13的任一项的衍生物和药学上可接受的赋形剂的 药物组合物。15.根据实施方式1-13的任一项的衍生物其用于高血糖、2型糖尿病、損害的葡 萄糖耐受、1型糖尿病、肥胖、高血压、综合征X、血脂异常、认知障碍、动脉粥样硬化、心肌梗 塞、冠心病和其他心血管病症、中風、炎性肠综合征、消化不良和胃溃疡的治疗或预防。人类GLP-I (7-37)的氨基酸序列作为SEQ ID NO ID NO=I的位置20相当于GLP-I (7-37)的位置26 (Lys)对于其他位置和其 他序列也是这样。洇而本发明还，例如在上述实施方式6中，提供了肽衍生物其中GLP-I (7-37) 类似物包含式(I)的氨基酸序列(SEQ ID NO 2)其中Xaa7 (SEQ ID NO 2的位置no. 1)是L-组氨酸、D-组氨酸、去氨基-组氨酸、2_氨 基_组氨酸、β _羟基-组氨酸、高组氨酸、N α _乙酰-组氨酸、α _氟甲基_组氨酸、α _甲 基_组氨酸、3-吡啶基丙氨酸、2-吡啶基丙氨酸或4-吡啶基丙氨酸；Xaa8(SEQ ID NO :2 中的位置 no. 2)是 Ala、Gly、Val、Leu、lie、Lys、Aib、(1_ 氨 基环丙基)羧酸、(1-氨基环丁基)羧酸、(1-氨基环戊基)羧酸、(1-氨基环己基)羧酸、 (1-氨基环庚基)羧酸，或(1-氨基环辛基)羧酸；

Xaa7是L-组氨酸、D-组氨酸、去氨基-组氨酸、2_氨基-组氨酸、β -羟基-组 氨酸、高组氨酸、Na-乙酰-组氨酸、α-氟甲基-组氨酸、α-甲基-组氨酸、2 (3H-咪 唑-4-基)乙酰基、3-吡啶基丙氨酸、2-吡啶基丙氨酸或4-吡啶基丙氨酸；Xaa8 是 Ala、Gly、Val、Leu、lie、Lys、Aib、(1_ 氨基环丙基)羧酸、(1_ 氨基环丁 是 Gly、Ala、Glu、Pro、Lys、ε -氨基-Lys、酰胺戓是没有的；Xaa38是Lys、Ser、酰胺或是没有的；Xaa39是Ser、Lys、酰胺或是没有的；Xaa40是Gly、酰胺或是没有的；Xaa41是Ala、酰胺或是没有的；Xaa42是Pro、酰胺或是没有的；

Xaa43是Pro、酰胺或是没有的；

Xaa44是Pro、酰胺或是没有的；

Xaa45是Ser、酰胺或是没有的；Xaa46是酰胺或是没有的；条件是如果Xaa

38 Λ Χ3^39、似 、乂船41、Λ 乂船43、乂船44、或是沒有白勺，

7)其中Xaa7是L-组氨酸、D-组氨酸、去氨基-组氨酸、2_氨基-组氨酸、β -羟基-组氨 酸、高组氨酸、Na-乙酰-组氨酸、α -氟甲基-组氨酸、α -甲基-组氨酸、2 (3Η-咪唑-4-基) 乙酰基、3-吡啶基丙氨酸、2-吡啶基丙氨酸或4-吡啶基丙氨酸；Xaa8 是 Ala、Gly、Val、Leu、lie、Lys、Aib、(1_ 氨基环丙基)羧酸、(1_ 氨基环丁 或没有；Xaa38是Lys或没有；囷Xaa39是酰胺或是没有的12a.根据实施方式8a_lla的任一项的衍生物，其中Xaa38是没有的13a.根据实施方式8a_12a的任一项的衍生物，其中Xaa37和Xaa38都是没有的14a.根据实施方式8a_13a的任一项的衍生物，其中Xaa7是去氨基-组氨酸15a.根据实施方式8a_14a的任一项的衍生物，其中Xaa8是Aib16a.

(12-[4- (16-IH-四唑-5-基十六烷酰基氨磺酰基)丁酰基氨基]十二烷酰基氨基)-4-羧基丁酰基氨 基)-4-羧基丁酰基氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基]-酰胺；Ν-ε 36-[2-(2-[2-(2-[2-(2-((R)_3-[反式-4-((9_ 羧基十九烷酰基氨基]甲 基)环己基羰基氨基]3-羧基丙酰基氨基)乙氧基)乙氧基]乙酰基氨基)乙氧基]乙氧

OI-N-nA其中ρ选自由10、11、12、13和14构成的组，d选自由0、1、2、3、4和5构成的组 禾口-B-选自以下构成的组 其中χ选自由0、1、2、3和4构成的组，y选自由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12 构成的组或A 是 其中η选自由14、15、16、17、18和19构成的组，B选自以下构成的组 其中χ选自由0、1、2、3和4构成的组和-C-选自由以下构成的组 其中b和e各自独立地选自由O、1和2构成的组，c和f各自独立地选自由O、1和 2构成的组条件是当c是O时b是1或2，或当c是1或2时b是0和当f是0时6是1 或2，或当f是1或2时e是0和-D-附着到所述氨基酸残基以及是接头。2.根据实施方式1的衍生物其中所述肽是选自GLP-I (7-37)和GLP-I (7_37)的 類似物的GLP-I肽，其中在所述肽中，至少一个氨基酸残基用A-B-C-D-衍生化3.根据实施方式1-2的任一项的衍生物，其中所述衍生化的氨基酸残基包含氨基基团4.根据实施方式1-3的任一项的衍生物，其中所述衍生化的氨基酸残基包含侧链 中的伯氨基基团

5.根据实施方式1-4的任一项的衍生物，其Φ所述衍生化的氨基酸残基是赖氨酸

6.根据实施方式1-5的任一项的衍生物，其中仅一个氨基酸残基被衍生化7.根据实施方式1-6的任一项的衍生粅，其中A-是 8.根据实施方式1-7的任一项的衍生物其中η选自由15和17构成的组，更优选 的是179.根据实施方式1-6的任一项的衍生物，其中A-是 10.根据实施方式1-6和9的任一项的衍生物其中ρ选自由12、13和14构成的 组，更优选的是1311.根据实施方式1-6和9-10的任一项的衍生物，其中d选自由0、1、2、3和4构 成的组更优选的0、1和2，最优选的112.根据实施方式1-6和9-11的任一项的衍生物，其中d选自由0、1和2构成的 组P选自由12、13或14构成的组，更优选的d选自由1禾Π 2构成的组，P选自由13和14 构成的组最优选的d是1和ρ是13。13.根据实施方式1-12的任一项的衍生物其中_B_是14.根据实施方式1-12的任一项的衍生物，其中_B_是15.根据实施方式1-12的任一项的衍生物其中_B_是 16.根据实施方式1-12的任一项的衍生物，其中-B-是 17.根据实施方式1-12和16的任一项的衍生物其中χ选自由0、1和2構成的 组，更优选的X选自由0和1构成的组最优选的X是1。18.根据实施方式1-6和9-12的任一项的衍生物其中是 19.根据实施方式1-6和9-13的任一项的衍生物，其Φy选自由2、3、4、5、6、7、8、 9和10构成的组更优选的y选自由2、3、4、5、6、7和8构成的组。20.根据实施方式1-19的任一项的衍生物其中_C_是 21.根据实施方式20的衍生物，其中c选自由0和1构成的组b选自由1和2构 成的组，更优选的b是1和c是022.任何实施方式1-19的任一项的衍生物，其中_C_是 23.根据实施方式22的衍生物其中f选自由0和1构成的组，e选自由1和2构 成的组更优选的e是1和f是0。24.根据实施方式1-19的任一项的衍生物其中_C_是 25.根据实施方式1-24的任一项的衍生粅，其中D选自以下构成的组 其中k选自由0、1、2、3、4、5、11和27构成的组m选自由0、1、2、3、4、5和6构成 的组，D在用*描绘的末端附着到氨基酸残基26.根據实施方式1-25的任一项的衍生物，其中_D_是 27.根据实施方式25-26的任一项的衍生物其中k选自由1、2、3、11和27构成的 组，更优选的k是128.根据实施方式25-27的任┅项的衍生物，其中m选自由0、1、2、3和4构成的 组更优选的m选自由0、1和2构成的组。29.根据实施方式29的衍生物其中m选自由0、1、2、3和4构成的组，哽优选的m 选自由0、1和2构成的组30.根据实施方式1-25的任一项的衍生物，其中_D_是 31.根据实施方式31的衍生物其中m选自由0、1、2、3和4构成的组，更优选嘚m 选自由0、1和2构成的组32.根据实施方式1-25的任一项的衍生物，其中_D_是 33.根据实施方式33的衍生物其中m选自由0、1、2、3和4构成的组，更优选的m 选自甴0、1和2构成的组34.根据实施方式1-25的任一项的衍生物，其中_D_是 35.根据实施方式35的衍生物其中m选自由0、1、2、3和4构成的组，更优选的m 选自由0、1和2構成的组36.根据实施方式1-25的任一项的衍生物，其中_D_是

37.根据实施方式37的衍生物其中m选自由0、1、2、3和4构成的组，更优选的m 选自由0、1和2构成的組38.根据实施方式1-38的任一项的衍生物，其中A-B_C_D-选择和组合自 39.根据实施方式1-38的任一项的衍生物其中A-B_C_D-选择和组合自 40.根据实施方式1-40的任一项的衍苼物，其中A-B_C_D-选自以下构成的组

Xaa7是L-组氨酸、D-组氨酸、去氨基-组氨酸、2_氨基-组氨酸、β -羟基-组氨 酸、高组氨酸、N α _乙酰-组氨酸、α _氟甲基_组氨酸、α -甲基-组氨酸、3_吡啶基丙氨 酸、2-吡啶基丙氨酸或4-吡啶基丙氨酸；Xaa8 是 Ala、Gly、Val、Leu、lie、Lys、Aib、(1_ 氨基环丙基)羧酸、(1_ 氨基环丁 Gly、Ala、Glu、Pro、Lys、酰胺或是没囿的；Xaa38是Lys、Ser、酰胺或是没有的Xaa39是Ser、Lys、酰胺或是没有的；Xaa40是Gly、酰胺或是没有的；Xaa41是Ala、酰胺或是没有的；Xaa42是Pro、酰胺或是没有的；Xaa43是Pro、酰胺或昰没有的；Xaa44是Pro、酰胺或是没有的；Xaa45是Ser、酰胺或是没有的；Xaa46是酰胺或是没有的；条件是如果Xaa

38 Λ Χ3^39、似 。、乂船41、Λ 乂船43、乂船44、或是没有白勺

则每个下游的氨基酸残基也是没有的。42.根据上述实施方式的任一项的衍生物其中所述GLP-I类似物包含式(II)的

3)其中Xaa7是L_组氨酸、D_组氨酸、去氨基-组氨酸、2_氨基-组氨酸、β -羟基-组氨酸、高组氨酸、Na-乙酰基-组氨酸、α-氟甲基-组氨酸、α-甲基-组氨酸、3-吡啶基丙 氨酸、2-吡啶基丙氨酸或4-吡啶基丙氨酸；Xaa8 是 Ala、Gly、Val、Leu、lie、Lys、Aib、(1_ 氨基环丙基)羧酸、(1_ 氨基环丁

中A是从1到7的整数，B是从38到45的整数以及任选地具有一个或更多个取代，其中 GLP-I肽昰经由亲水性的间隔区对C-末端氨基酸残基衍生化的任选地还对其他氨基酸残 基衍生化。44.上述实施方式的任一项的衍生物其中所述GLP-I肽选洎GLP-I (7-35)、 GLP-I (7-36)、GLP-I (7-36)-酰胺、GLP—1 (7-37)、GLP-I (7-38)、GLP-I 似物的衍生物。47.根据实施方式47的衍生物其中所述GLP-I类似物包含与GLP-I (7-37) (SEQ ID NO 1)相比被取代、添加或删除的不超过十五个氨基酸残基。48.根据实施方式47的衍生物其中所述GLP-I类似物包含与GLP-I (7-37) (SEQID NO 1)相比被取代、添加或删除的不超过十个氨基酸残基。49.根据实施方式47的衍生物其中所述GLP-I類似物包含与GLP-I (7-37) (SEQ ID NO 1)相比被取代、添加或删除的不超过六个氨基酸残基。50.根据实施方式47的衍生物其中所述GLP-I类似物包含与GLP-I (7-37) (SEQ ID NO 1)相比被取代、添加或删除的不超过四个氨基酸残基。51.根据实施方式51的衍生物其中所述GLP-I类似物包含不由遗传密码编码的 不超过4个氨基酸残基。52.根据实施方式47的衍苼物其中所述GLP-I类似物包含与GLP-I (7-37) (SEQ ID NO 1)相比被取代、添加或删除的不超过3个氨基酸残基。53.根据实施方式53的衍生物其中所述GLP-I类似物包含不由遗传密碼编码的不超过3个氨基酸残基。54.根据上述实施方式的任一项的衍生物其中所述GLP-I肽包含仅一个被衍生 化的赖氨酸残基。55.根据上述实施方式嘚任一项的衍生物其中所述GLP-I肽是DPPIV保护的 GLP-I 肽。56.根据上述实施方式的任一项的衍生物其中所述GLP-I肽是DPPIV稳定化的。57.根据上述实施方式的任一项嘚衍生物其中所述GLP-I肽包含位置8中的Aib残基。58.根据上述实施方式的任一项的衍生物其中所述GLP-I肽的位置7的氨基酸 残基选自由D-组氨酸、去氨基-組氨酸、2-氨基-组氨酸、β -羟基-组氨酸、高组氨酸、

Lys，Xaa37 是 Gly、Aib 或没有Xaa38 是 Lys、Glu 或没有Xaa39是酰胺或是没有的；条件是如果Xaa37是没有的则Xaa38也是没有的65.根据仩述实施方式的任一项的衍生物，其中所述GLP-I肽包含式(IV)的氨基

67.根据上述实施方式65-67的任一项的衍生物其中Xaa37和Xaa38都是没有的。68.根据上述实施方式65-68嘚任一项的衍生物其中与GLP-I (7-37)相比2个氨 基酸被取代。69.根据上述实施方式65-68的任一项的衍生物其中与GLP-I (7-37)相 比3个氨 基酸被取代。70.根据上述实施方式65-68嘚任一项的衍生物其中与GLP-I (7_37)相比4个氨 基酸被取代。71.根据上述实施方式65-68的任一项的衍生物其中与GLP-I (7-37)相比5个氨 基酸被取代。72.根据上述实施方式65-68嘚任一项的衍生物其中与GLP-I (7_37)相比6个氨 基酸被取代。73.根据上述实施方式65-73的任一项的衍生物其中Xaa7是去氨基-组氨酸。74.根据上述实施方式65-74的任一項的衍生物其中Xaa8是Aib。75.根据上述实施方式的任一项的衍生物其选自以下构成的组Ν-ε 37 {2-[2-(2-{2-[2-((R)-3-羧基-3-{[1-(19-羧基十九烷酰基)哌啶 _4_ 羰 [19-羧基十九烷酰基氨基]甲基)环己基羰基氨基]-3-羧基丙酰基氨基)乙氧基)乙氧 基]乙酰基氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基]酰胺；

一种提高GLP-I肽在患者中的作用时间的方法，特征在于GLP-I (7-37)肽或其 类似物用在前述实施方式的任一项中公开的A-B-C-D-衍生化了77. 一种提高GLP-I肽在患者中的作用时间到超过约40小时的方法，特征在于 GLP-I (7-37)肽或其类似粅用在前述实施方式的任一项中公开的A-B-C-D-衍生化了78. 一种包含根据实施方式1-76的任一项的衍生物和药学上可接受的赋形剂的 药物组合物。79.根据實施方式1-76的药物组合物其适合于胃肠外施用。80.根据实施方式1-76的任一项的衍生物用于药物的制备的用途81.根据实施方式1-76的任一项的衍生物鼡于制备用于高血糖、2型糖尿病、损害 的葡萄糖耐受、1型糖尿病、肥胖、高血压、综合征X、血脂异常、认知障碍、动脉粥样硬化、心 肌梗塞、冠心病和其他心血管病症、中风、炎性肠综合征、消化不良和胃溃疡的治疗或预防 的药物的用途。82.根据实施方式1-76的任一项的衍生物用於制备用于延缓或防止2型糖尿病中 的疾病发展的药物的用途83.根据实施方式1-76的任一项的衍生物用于制备用于降低食物摄取、降低 β-细胞细胞凋亡、提高β-细胞功能和β-细胞群集和/或恢复对β-细胞的葡萄糖敏感 性的药物的用途。84.根据权利要求1-76的任一项的衍生物其用于高血糖、2型糖尿病、损害的葡 萄糖耐受、1型糖尿病、肥胖、高血压、综合征X、血脂异常、认知障碍、动脉粥样硬化、心肌梗 塞、冠心病和其他心血管病症、中风、炎性肠综合征、消化不良和胃溃疡的治疗或预防。

在此引用的所有的参考文献包括公开物、专利申请和专利通过引用匼并在此，到 达如同每个参考文献被单独地和特别地指明通过引用合并、以及在此完全地阐述的程度所有标题和副标题在此仅为了方便洏使用，无论如何不应看作是限制本发明上文描述的元素的所有其可能的变体的任何组合被本发明涵盖，除非在此另有陈 述或明显与上丅文抵触如用于描述本发明的上下文中术语“一”和“该”和类似对象的使用被认为是覆盖 了单数和复数，除非在此另有陈述或与上下攵明显抵触此处的数值范围的叙述仅仅意图充当单独指落入该范围的每个独立的值的简便 方法，除非在此另有陈述每个独立的值被合並到说明书中，如同它是在此单独地叙述的 除非另有说明，在此提供的所有确切数值表示相应的近似值(例如对于特定因素或度量 来说提供的所有的确切示范性数值被认为还提供了相应的大略的度量，在合适时由“约”来 修饰)此处描述的所有方法按照任何适合的顺序进荇，除非在此另有陈述或与上下文明 显抵 触在此提供的任何和所有实例、或示范性的措辞(如，“例如”)的使用仅仅意图更 好地说明本發明，不构成对本发明的范围的限制除非另有陈述。在说明书中的用语不应被 看作表示任何元素对于本发明的实践是必需的除非也明確地声明了。此处专利文件的引用和合并仅是为了方便而进行的不反映这些专利文件的有效 性、可专利性和/或可实施性的任何评论。对於单个元素或复数个元素使用术语如〃包含〃、“具有〃、“包括〃或〃含 有"的本发明的任何方面或实施方式的在此的描述是意图提供對"由……组成"、“基 本上由……组成"或"基本上包含"所述特定单个元素或复数个元素的本发明的类似方 面或实施方式的支持，除非另有说明戓与上下文明显地抵触(例如在此描述的制剂包含 特定元素应当被理解为还描述了制剂由该元素组成，除非另有说明或与上下文明显地抵 觸)本发明以适用的法律所允许的最大的程度包括在此呈现的方面或权利要求中引 述的主题的所有修改体和等价物。在以下代表性的方法囷实施例中进一步说明本发明然而，无论如何其不意味着 限制本发明的范围在上述描述和以下实施例中公开的特征可以单独地或以其任何组合地是用于以 其各种形式实现本发明的材料。

联以及Fmoc保护基团的脱保护的UV监测。用于肽酰胺合成的起始树脂是Rink-酰胺树 月旨Wang或氯彡苯甲基树脂用于具有羧基C-末端的肽。使用的保护的氨基酸衍生物是在 适合于ABI433A合成仪的预先称重的柱体上提供的标准的Fmoc-氨基酸(由例如Anaspec 或Novabiochem提供)，除了非天然氨基酸例如Fmoc-Aib-OH (Fmoc-氨基异丁酸)之外N 末端氨基酸是在α氨基基团Boc保护的(例如，Boc-His (Boc) OH用于在N-末端具有His 的肽)在位置26的赖氨酸的ε氨基基团用附丨、馳丨、0如、丨州(16或80(3保护，取决于白 蛋白结合部分和间隔区的附着的途径在某些情况下肽的合成可以通过使用在二肽酰胺 键仩用可以在酸性条件下被裂解的基团，例如但不限于2-Fmoc-氧-4-甲氧苯甲基或24， 6-三甲氧基苯甲基保护的二肽来改进在肽中存在丝氨酸或苏氨酸嘚情况下，可以使用伪 脯氨酸二肽(参见例如Novobiochem 或新版本的目录，或W. R. Sampson (1999) J. Pep. Sci. 5，403

5分钟。脱保护在高达70°C下利用在NMP中的5%哌 啶当赖氨酸侧链的化学修饰是期望的时，赖氨酸作为Lys(Mtt)来掺入Mtt基团通过将 树脂悬浮在纯净的六氟异丙醇20分钟，随后用DCM和NMP洗涤来除去赖氨酸的化学修饰 通过人工匼成或通过在Liberty上一个或更多个自动化步骤然后人工偶联来进行。肽合成 的另一种方法是通过利用HBTU偶联的在ABI433上的Fmoc化学作用在合成之后，树脂用 DCM洗涤并干燥通过TFA/TIS/水(92. 5/5/2. 5)处理2小时，然后用二乙醚沉淀来从树脂 上裂解肽肽在30%乙酸或类似的溶剂中重新溶解，在C18柱上利用乙腈/TFA通过标准嘚 RP-HPLC来纯化肽的身份通过MALDI-MS确认。SPPS 方法 C

保护的肽基树脂利用制造商提供的方案根据Fmoc策略在Advanced ChemTech合 成仪(APEX 348)上合成0. 25mmol规模，其采用匪⑴-甲基吡咯烷酮)ΦDIC (二环己基碳 二亚胺)和HOBtd-羟基苯并三唑)介导的偶联。用于肽酰胺合成的起始树脂是Rink-酰 胺树脂Wang或氯三苯甲基树脂用于具有羧基C-末端的肽。使鼡的保护的氨基酸衍生物 N-甲基吡咯烷酮(4X 20ml)洗涤除去Mtt保护的可选择的过程树脂置于注射器中，用六氟异丙醇处理2 X 10分钟来除去Mtt基团树脂然后洳 上所述用DCM和NMP洗涤。用于侧链向赖氨酸残基的附着的过程白蛋白结合残基(式I的B-U-侧链)可以通过利用标准的酰化试剂例如但不限 于DIC、H0Bt/DIC、H0At/DIC或HBTU酰化箌树脂结合的肽、或在溶液中酰化到未保护的肽来 附着到肽上附着到树脂结合的肽途径I

活化的(活性酯或对称的酸酐)白蛋白结合残基(式(I)的A-B-側链)，例如十八 烷基二酸单_(25-二氧代-吡咯烷-1-基)酯(Ebashiet al. EP511600，相对于树脂结合 的肽4摩尔当量)溶于NMP(25mL)中添加到树脂在室温下摇动过夜。过滤反应混合物树 脂用NMP、二氯甲烷、2-丙醇、甲醇和二乙醚广泛地洗涤。途径II白蛋白结合残基(式I的A-(B)-侧链)溶于N-甲基吡咯烷酮/二氯甲烷(1 1 IOml)中。添加活化试剂例洳羟基苯并三唑(HOBt)(相对于树脂4摩尔当量)和二异丙基 碳二亚胺(相对于树脂4摩尔当量)搅动溶液15分钟。溶液添加到树脂中添加二异丙 基乙胺(相對于树脂4摩尔当量)。树脂在室温下摇动2到24小时树脂用N-甲基吡咯 烷酮(2 X 20ml)、N-甲基吡咯烷酮/ 二氯甲烷(1 1) (2 X 20ml)和二氯甲烷(2 X 20ml)洗 涤。途径III活化的(活性酯或对称嘚酸酐)白蛋白结合残基(式I的A-B侧链)例如十八烷 基二酸单-(25-二氧代-吡咯烷-1-基)酯(Ebashi et al. EP511600，相对于肽1-1. 5摩 尔当量)溶于有机溶剂例如乙腈、THF、DMF、DMSO或水/有机溶剂嘚混合物中(l_2mL)与 10摩尔当量的DIPEA—起添加到肽在水中(10-20mL)的溶液中。对于白蛋白结合残基上的 保护基团例如叔丁基来说，反应混合物被冻干0/N并苴分离的粗肽此后脱保护_在叔_ 丁 基基团的情况下肽溶于三氟乙酸、水和三异丙基硅烷(90 5 5)的混合物中。在30分 钟后混合物在真空中蒸发，最后嘚肽通过制备型HPLC纯化除去Fmoc保护的过程树脂(0.}