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【求助】各样本内参Cp值相差大怎么办？
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这个帖子发布于4年零71天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
从细胞中提取RNA，多功能酶标仪测浓度后，用Takara逆转录试剂盒，10ul逆转录反应体系中将每个样本RNA量均达最大500ng来进行逆转录，该逆转录试剂盒说明书上标明的是每10ul反应体系RNA量最大到500ng.使用罗氏LightCycler& 480 SYBR Green I Master 进行荧光定量PCR，结果发现样本间内参Cp值相差很大，超过3了，内参我用的B-actin,其Cp值基本在20左右，像这种情况该怎么办呢？另外还想问下，像这种样本间内参Cp相关比较大的情况，做相对定量2-△△Ct计算法，得出的结果能用吗？
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RNA的纯度怎样啊？每个样本RNA量都确保取500ng反转吗？如果这些没问题的话，我建议多做几个内参，比如GAPDH/B2M...选做三个内参 再取平均值，得到的数据会可靠些
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换个内参试试，比如GAPDH
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样本B-actinGAPDH120.20.218.17.319.18.418.17.8008505521.21.619.18.这是我今天用两个内参所得出的各样本的内参Cp值，下一步我设想根据内参Cp值调整样本cDNA浓度，从以上数据来看，可将内参Cp值统一设定在21，那么稀释倍数＝（21－样本Cp值）的平方。不知这种方法是否可行？
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样本间内参的Cp相差大不是问题，并不影响结果啊，你没有发现这两个内参Cp的差值很相近吗？我们这样假设好了，我将GAPDH当成是目的基因，而B-actin当成内参，你会发现GAPDH在这6个标本的相对表达量差不多。用的样本量不同，内参和目的基因是等比例下降的，也就是Cp目的基因-Cp内参基因是个恒定的，无论你取多少量的标本逆转录，你稀释2倍后，Cp目的基因增加1，Cp内参基因也增加1，所以差值是不变的。因此你将内参Cp调整到一样是多此一举啊。
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seuzsl 样本间内参的Cp相差大不是问题，并不影响结果啊，你没有发现这两个内参Cp的差值很相近吗？我们这样假设好了，我将GAPDH当成是目的基因，而B-actin当成内参，你会发现GAPDH在这6个标本的相对表达量差不多。用的样本量不同，内参和目的基因是等比例下降的，也就是Cp目的基因-Cp内参基因是个恒定的，无论你取多少量的标本逆转录，你稀释2倍后，Cp目的基因增加1，Cp内参基因也增加1，所以差值是不变的。因此你将内参Cp调整到一样是多此一举啊。谢谢你的答复，只是我在网上看到的帖子上说样本之间内参Cp值要调齐，相差在1以内才行呀。像我做出来的这些数据内参Cp最大相差有3了，这样做出来的结果统计出来也是没有参考价值的。网上看到的贴子上说的。我不知道是不是这样。我快要郁闷死了，这两天一直在思考这个问题，而且吧将样本间内参调在相差1以内真的是件不好办的事。
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通过计算公式很容易得出没有必要调整，你可以利用一个标本做几次试下，分别用不同稀释倍数的模板、每次做三个复孔，然后计算目的基因的相对表达是否一致。我发现很多人都搞不清楚这个问题
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seuzsl 通过计算公式很容易得出没有必要调整，你可以利用一个标本做几次试下，分别用不同稀释倍数的模板、每次做三个复孔，然后计算目的基因的相对表达是否一致。我发现很多人都搞不清楚这个问题我明白，只是我用相似相对定量2-△△Ct来做计算，所以我不需要做扩增曲线。谢谢你的回答，这样我就放心了。
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稀释6倍稀释4倍
GAPDHGAPDH 样本120.1313720. 样本218.17. 样本320.18. 样本418.17.8008505 样本518.992657121. 样本619.120721418.
B-actinB-actin 样本120.20. 样本219.18. 样本322.19. 样本419.18. 样本518.21. 样本619.19.
这是我前后两次做的，将样本cDNA分别稀释4倍及6倍后得到的各样本的2个内参Cp值，发现样本1和样本5变化与浓度不相符，说明什么问题呢？我还有必要用这些样本做重复试验吗？非常感谢！请看到后回复我呀，我等着各位专家的意见。
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seuzsl 样本间内参的Cp相差大不是问题，并不影响结果啊，你没有发现这两个内参Cp的差值很相近吗？我们这样假设好了，我将GAPDH当成是目的基因，而B-actin当成内参，你会发现GAPDH在这6个标本的相对表达量差不多。用的样本量不同，内参和目的基因是等比例下降的，也就是Cp目的基因-Cp内参基因是个恒定的，无论你取多少量的标本逆转录，你稀释2倍后，Cp目的基因增加1，Cp内参基因也增加1，所以差值是不变的。因此你将内参Cp调整到一样是多此一举啊。那您觉得同一浓度的样品间内参CT值差多少可以呢？内参的概念不就是样品在这个基因上表达相对恒定吗？
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tiantian 那您觉得同一浓度的样品间内参CT值差多少可以呢？内参的概念不就是样品在这个基因上表达相对恒定吗？看来你真的是不懂，或者是整个计算原理或过程没有吃透，建议自己去查下资料
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我查了，和我说的一样
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tiantian 我查了，和我说的一样你说的什么？我看之前的内容没有什么呀
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anchorlhh 你说的什么？我看之前的内容没有什么呀是对说的
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【求助】QPCR内参太高，什么原因，怎么解决
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这个帖子发布于2年零15天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
问题已关闭悬赏丁当:2
求大神指导，组织提RNA后逆转录跑PCR，同时提实验组和对照组，PCR发现实验组内参值都很高，到了28-32，但是对照组比较正常，18-22.个人感觉提RNA过程没什么问题，就是实验组浓度比对照稍低，可这也不会影响PCR内参的CT值吧？换过GAPDH和actin（溶解曲线什么的都是好的），都试了，效果差不多，实验组比对照的内参CT值高出很多，目的基因上看不出有什么大的差异，就是内参高，找不到原因了，求大神帮忙分析一下解决办法。没有组织再重提了该怎么解决？谢谢！！！
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我也遇到了类似的问题。提取组织RNA反转录后做Q-PCR，选18S做内参基因。以前做一般都10个循环左右，最近这一批组织却22个循环。溶解曲线也是好的，反转录体系也没有问题（用以往的RNA同时反转录做Q-PCR，18S的CT值还是10左右）。提取RNA好像也没有问题。我是分离了脂肪组织中的成熟脂肪细胞部分，确实不好提RNA，但是浓度也有300ng/ul左右，260/280是1.8-2.0。可为什么内参基因就是这么低表达量啊？
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同感啊 不晓得什么原因 还不知道怎么解决
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因为你的PCR反应体系已经在别的样本上得到证实，因此造成Ct值高的直接原因就是，模板量低。导致模板量低的原因，1. RT反应不成功，PCR体系中含有不多的ｃDNA；当然你若是同二楼一样做了对照反应，那么也可以排除此因素　２.　RNA总量不够。虽然通过紫外检测了RNA量，但是不要太相信这个结果。你可以跑个变性RNA电泳看看。以上两个考虑是普通的针对Ct　value与RNA量，或者说模板量的关系问题。但是关于内参很高，而目标基因确基本正常，水平相当这个矛盾现象。我建议你检查一下目标基因的PCR体系是否有污染（模板污染）
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还有没有可能是干预实验影响了内参的表达呢？
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目的基因ct值大于35，怎么办？
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目前在做细胞基因表达的QPCR，但是总是重复不了实验结果，而且目的基因的CT值偏高大于35，内参为GAPDH，CT为24.想降低目的基因的CT值，到32左右。可是在体系里面加了2ul的模板，并且模板没有经过稀释，也就是说我已经按照最大浓度加的cDNA，可是CT值还是大于35，这该怎么办啊？
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听说在逆转的时候用Oligd(T)和随机引物的混合液可以使得cDNA含量比较高？这是对的吗？
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dong66ling 听说在逆转的时候用Oligd(T)和随机引物的混合液可以使得cDNA含量比较高？这是对的吗？不能沉啊，自己顶小白地问一句，相同RNA，用不同试剂盒逆转，得到的cDNA会有含量差别吗？
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个人觉得会有些差别
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我也是一样的，后面你怎么处理了，，可以分享一下吗，最近实验卡在这里了
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dong66ling 不能沉啊，自己顶小白地问一句，相同RNA，用不同试剂盒逆转，得到的cDNA会有含量差别吗？应该会有，可能逆转录的效率不同
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你的是动物组织么？ 1.样本如何保存，RNA是否有降解 2.跑琼脂糖电泳看RNA完整性
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楼主问题解决了吗？我的结果也是这样的， 这样结果一定不能用吗
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我重新设计了引物普通PCR验证引物特异性时，在24cycle后跑胶能看出条带来的引物一般没问题
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【求助】荧光定量的Ct值和Cp值的区别在哪里
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我做荧光定量用的是罗氏480的机子，出结果的时候没有Ct值，只有Cp值，请问为什么，这两个数值有什么区别，可以换算吗？
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你好，你用的是lightcycler480么？我用的是这个
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我们用的也是这台机器，就是用这个做相对定量的
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同问，我也是用罗氏LC480的仪器，不明白
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楼主知道答案了吗
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这其实是一样的
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Ct值就是Cp值吗？？最近也疑惑了
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是一样的，现在的仪器都叫Cq值了
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RT-qPCR，Ct值（有时也称Cp值）关乎整个实验的最终定论。Ct值的大小与目的RNA含量有关。Ct值越大说明目的RNA含量越小，反之亦然。Ct值的大小还和定量PCR仪有关，有的定量PCR仪敏感性很好，即使加进去的模板很少，只要循环次数足够多，最终还是能检测出来。有的定量PCR仪敏感性不好，最终的Ct值就不是很好。总体来说，Ct值范围在15-25之间比较好。但是只要复孔之间Ct值重复性比较好，不管Ct值或大或小，这组数据就可信。
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