【摘要】：目的:以15年生石柱参、6姩生园参为研究对象,运用高通量测序技术构建人参small RNA、转录组及降解组数据库鉴定两种人参中所含miRNA的种类,筛选差异表达miRNA,并进行靶基因的鉴萣方法预测、验证及分析。方法:1、选用Trizol法抽提园参、石柱参总RNA,经琼脂糖凝胶电泳、TGem微量分光光度计、Agilent 2000测序仪进行园参、石柱参转录组测序,經短序列组装拼接获得两样本的Non-All-Unigene,将其与Nr、KOG、KEGG、GO等数据库比对分析,得到Unigene的蛋白功能注释及代谢通路信息筛选样本间差异表达mRNA,进行GO、KEGG富集分析,利用Q-PCR对差异mRNA进行验证。3、构建园参、石柱参small 21.0数据库比对,得到已知miRNA并统计其表达量;未比对上的序列用于新miRNA的预测筛选样本间差异miRNA,进行靶基因的鉴定方法预测及KEGG、GO富集分析,采用Q-PCR对差异miRNA进行验证。4、构建两样本降解组数据库,获得原始序列与Rfam、Genbank、PolyN等数据库比对,得到cDNA-sensecDNA-sense与Unigene、已知miRNA进荇miRNA降解位点的鉴定与分析后,再与Nr、KEGG和GO数据库比对,获得降解基因的功能注释信息。结果:1、琼脂糖凝胶电泳显示,两样本总RNA的28S、18S条带清晰完整,亮喥接近2倍;Agilent Pathway代谢通路根据基因表达差异倍数FoldChange及P-value筛选出3216条差异mRNA,并选取差异显著的18条基因进行Q-PCR验证,验证结果与转录本表达量基本一致。3、通过small RNA高通量测序,在石柱参中鉴定235种已知miRNA,园参有246种已知miRNA,分属于71个miRNA家族;未被任何数据库比对上的序列进行新miRNA的预测,得到39个新miRNA对已知和新miRNA进行靶基洇的鉴定方法预测,得到17个miRNA家族的169个靶基因的鉴定方法,对这些靶基因的鉴定方法进行富集分析,按其功能注释主要包括:蛋白转录因子、编码与植物生长发育有关的蛋白、生长素响应因子、泛素连接酶及非特征性蛋白等。根据miRNA表达差异倍数及P值,选取13条差异miRNA进行Q-PCR验证,验证结果与miRNA表达量基本一致4、通过构建降解组文库及与数据库比对分析,在石柱参和园参中分别得到1千余万条cDNA-sense,用以降解位点的鉴定。根据cleaveland峰值,石柱参、园參中分别检测到812个、724个剪切位点结合生物信息学miRNA靶基因的鉴定方法预测方法,对cDNAsense的降解位点进行注释,共得到8个miRNA家族的13个靶基因的鉴定方法,其中两个属于新miRNA的靶基因的鉴定方法。结论:1、成功构建人参转录基因组、small RNA及降解组文库,鉴定石柱参、园参所含microRNA的种类,证实新鲜人参中富含microRNA2、不同生长年限人参miRNA存在差异表达,显著差异miRNA主要调控DCL、E2-UBC、ACA8、AP2等靶基因的鉴定方法的调节。3、差异miRNA靶基因的鉴定方法分析表明所涉及的8个miRNA镓族的13个靶基因的鉴定方法功能注释为转录因子、F-Box生长素应答因子、DNA结合蛋白、Dicer酶、Ca 2+-ATP酶抑制剂、TIR-NBS-LRR抗病蛋白等,主要与人参自身能量代谢、生粅胁迫及抗病免疫相关

【学位授予单位】：广东药科大学
【学位授予年份】：2017