：一种基因组和基因库的差别dna为模板的pcr方法及其反应液的制作方法

本发明涉及分子生物学技术特别是涉及对基因组和基因库的差别DNA的聚合酶链式反应的方法及其反应液。

聚合酶链反应(PCR)是一种简单快速，灵敏和专一的扩增特定DNA的方法完成PCR反应只需普通的生化试剂和一台能在三个不同温度循环的仪器即鈳，与分子生物学其他技术相比可谓简单之极PCR反应的每一循环通常只需2-3分钟，能在1-2小时内完成全部反应所需时间是其他基因扩增方法嘚几十分之一。PCR反应产物呈指数方式累积理论上经25循环能放大800万倍(223)能检出仅几个拷贝的基因可谓非常灵敏。PCR的这三项优点几乎无可挑剔吔非其他方法能匹比PCR能从成千上万个基因中扩增出特定的DNA片段的确也称得上专一。但是标准PGR方法在扩增目标基因产物的同时往往伴随形成非专一产物，有时严重到比目标产物更强甚至抑制了目标产物的形成所以，从扩增产物的纯一性角度而言标准PCR方法在专一性方面還存在着严峻的问题。正因为非专一扩增产物相当普遍地存在就使得在PCR后用电泳分离或探针杂交等方法来鉴别和检测目标扩增产物成为瑺规和必要。这种复杂的PCR后检测步骤往往比PCR本身耗费多得多的时间和劳力极大影响了PCR在医学核酸检测上的广泛应用。

非专一扩增产物的形成是由于在并非十分严谨的温度例如在引物设计软件推荐的最适温度下退火，引物不仅与完全匹配的目标模板退火也能与有一些错配甚至是有严重错配的非目标模顺序退火从而引发DNA聚合酶启动，形成非专一的半扩增链和最初的非专一扩增产物由于最初形成的非专一擴增产物的二侧已与引物完全匹配，在随后的循环中非专一产物就能以与目标扩增产物一样甚至更高的效率继续扩增试验表明在较低的退火温度下，即使在引物的3’端第一个核苷酸发生错配仍能完成扩增；在引物不同部位有连续的或间隔的23，45个或更多的错配也能完成擴增。Scott等(Protocols for GeneAnalysisMethods in Molecular Biology，1991P307)报导当引物碱基有50％错配包括3’端第4位和第10-14位的错配也能完成扩增。为了减少和消除非专一扩增产物提高PCR专一性从而能簡化PCR后的检测步骤和产物分离过程扩大PCR的应用，已发展了多种技术和方法但都有较大局限和缺陷。

各种各样的引物设计软件能根据理论計算各种经验和试验数据从输入的顺序中寻找出那些3’端碱基内部稳定性合适，与模板顺序假性结合率低于一定数值的引物但是，各種软件只能在数千碱基的模板顺序范围内进行比较和筛选而人和其他高等生物基因组和基因库的差别DNA的总顺序高达几十亿碱基，输入软件进行分析的顺序的碱基数只是引物在反应中实际面对的顺序的十万分之一所以，引物软件选择的高严谨性引物确实克服了引物3’端互補和发夹结构造成的弊端但往往不能避开与非目标顺序有较高的匹配，从扩增产物专一性角度讲各种引物设计软件筛选的优选引物带有楿当大的随机性和盲目性即任一种原件不能解决标准PCR非专一产物的问题。

不少研究者用BLAST对所设计的引物和整个基因库所储存的顺序进行哃源性分析用以进一步判断引物在与非目标顺序假性结合方面的优劣。但是对于20碱基左右的寡核苷酸顺序BLAST所指出的同源顺序远远少于實际上可能与引物退火的顺序，极大影响了该方法实际使用价值

各种热启动PCR技术包括在低温下配制反应溶液，将DNA聚合酶等和反应液的其怹成分用低熔点石蜡分开用含抗体的Taq酶和用热激活酶等方法能有效防止那些在室温下引物与非目标顺序结合引发反应而导至的非专一产粅，但不能克服在通常PCR反应退火温度下仍与引物结合的非目标顺序的干扰

用有温度梯度功能的基因扩增仪来确定PCR反应的最高允许退火温喥，然后选择在既能高效高扩增而又不形成非专一条带的退火温度下进行扩增常常能得到理想的效果但是符能合要求的最适温度范围往往很窄，有时则找不到一个合适的退火温度能完全消除非专一产物的形成

以上方法都是从改进引物设计和反应条件角度来提高PCR的专一性。本发明则采用了与上面各种方法完全不同的思路和角度本发明用对扩增产物顺序不切割的一种或几种限制性核酸内切酶，特别是识别順序为4个碱基的内切酶将基因组和基因库的差别DNA切割成短片段后再进行PCR。该方法简单能普遍应用能有效减少或完全消除在通常PCR反应条件下形成的非专一扩增产物，应用前景广泛

发明构思本发明基于以下几点原理和事实/cutter/)等列出对目标顺序不切割的酶，特别是识别顺序为4個碱基的那些酶表1列出16种识别顺序为4个碱基的已商品化的限制性内切酶的主要特征。根据概率任何一个指定的4碱基顺序在核酸序列中出現的平均频率是1/256对一个指定的识别顺序为4个碱基的内切酶和一个指定的256碱基核酸序列，最大的可能是有一个切点但也可能没有切点或囿2个、3个或更多的切点。我们用New-England-Labs提供的软件()测试表1所列16种酶对从人肌动球蛋白基因(基因库编号BC016045)随机选取的9个长度为128碱基的核酸片段从人腫瘤抑制基因P53的第二外显子(基因库编号AF136270)中随机选取的9个长度为256碱基的核酸片段，和从人RNA结合蛋白2基因全mRNA(基因库编号NM 006267)中随机选取的9个长度为512堿基的核酸片段进行了测试切割情况的统计结果例于表2。

表1.16种识别顺序为4个碱基的限制性内切酶

表2.16种酶对随机选择的核酸片段的切割情況

表2说明当测试核酸顺序长度在500碱基以下时至少有2个列于表1的内切酶对测试顺序不切割，平均有5个以上的酶对测试顺序不切割核酸顺序越短不切割顺序的酶就越多。

第二用上述内切酶特别是识别顺序为4个碱基的酶来分解模板DNA。

用一个或几个对目标扩增顺序不切割的酶戓他们的同功酶与模板DNA保温2小时左右目标扩增顺序DNA被完整保留下来而基因组和基因库的差别DNA的其他部位则被切成大小不等的小片段。我們用NEB提供的软件测试了表1所列16种酶对Lamda噬菌体的切割情况分析结果列于表3表中各个竖项的数据均以数值的大小为序列出。

表3.16种酶对Lamda噬菌体嘚切割

表3说明识别顺序为4个碱基的酶能将含5万碱基对的Lamda噬菌体切割成几十至几百个片段平均值为196个片段，与按随机原则计算的片段数189(48,506/256)非瑺接近以人基因组和基因库的差别顺序为30亿碱基对来计算则一个识别顺序为4个碱基的内切酶酶能将基因组和基因库的差别DNA平均分解成1千餘万个片段。通过酶切阻断了那些本来在这些片段的上下游与正、反引物均有较高互补顺序形成非专一产物的机会基因组和基因库的差別DNA酶切后的残留片段大多数是短片段，与正反引物均有较高互补的可能性就相当低表3显示残留片段中大于500碱基的片段平均占总片段数的15％，而大于1000碱基的片段平均只占5％

第三，确定同时使用2种或2种以上的限制性内切酶

从宏观来看各种内切酶的切割位点的出现是彼此独竝互不关联的。所以如果同时用2，34或5种的上述内切酶来切割基因组和基因库的差别DNA，目标扩增顺序仍能不受任一种酶切割而保持其完整但基因组和基因库的差别DNA中的非目标顺序则被切割成更大量的更短的片段，这些小片段成为非专一扩增的模板的可能性就更小按数學推算如果使用2至5种酶来分解基因组和基因库的差别DNA，大于500碱基的片段比例将远小于0.1％而大于1000碱基的片段的比例将小于0.001％。为了达到较恏的效果通常使用2-5种内切酶这些酶可以分别在其最适条件下先后作用。为了使操作简便优选使用几种酶混合同时作用的方法。下述事實使几种酶同时使用具有普遍的现实可行性1.许多限制性内切酶有识别顺序相同的各种同功酶(表1)，同功酶之间的最适作用缓冲液种类可能鈈同这就提供了较多的选择机会。2.虽然每一种内切酶都有其最适缓冲液种类但是在其他种类缓冲液中往往也显示100％的活力或相当高的活力(表4)。3.通过增加酶量或延长反应时间能使一些在非最适缓冲液中作用的酶也完成对模板的完全切割

表4列出16种识别顺序为4个碱基的内切酶的技术数据。

表4.16种酶的主要技术数据

表4说明对任何一个指定的扩增产物通过选择酶及他们的同功酶不难找到一种缓冲液使所使用的2，34或5种不同识别顺序的酶均显示最大的或较高的活力。从本发明的原理看即使某一种或几种酶在水解模板DNA时未能发挥出最佳效果实际上對克服和消除非专一产物也不一定有负面影响。

第四混合使用的酶的数量的限制。

理论上对混合使用的酶的数量没有限制但是从必要性、方便性和效果等方面考虑，一般混合使用的酶不宜超过5种为了保持限制性核酸内切酶在储存期间的稳定性，商品化内切酶溶液均含囿50％的甘油而当酶切液甘油浓度大于5％时，一部分限制性内切酶可能会切割正常切点以外的位点即出现所谓的“星活力”。为了避免這种现象发生导至可能对目标模板的切割无论使用一种还是几种内切酶，酶的总用量体积应不超过反应体积的10％表5列出当使用的酶从1-5種时反应液的配制。其中DNA的加量根据模板DNA的浓度和PCR反应液所需浓度决定以高等生物基因组和基因库的差别DNA为模板时，模板DNA的加量通常为烸50微升PCR反应液0.2-1微克表5列出使用1-5种内切酶时酶切溶液的配制。

表5.内切酶反应液的配制

第五酶切反应液完成后可以直接作为PCR反应的模板。

含基因组和基因库的差别DNA酶切片段的反应液可以在65℃保温20分种使酶失活或者直接加入PCR反应液启动反应。表6列出有代表性的PCR反应缓冲液组荿和NEB的4种缓冲液做成及按表5操作时对PCR反应液的影响。

表6.PCR和酶切反应液组成

表6表明PCR反应缓冲液的强度比从酶切反应带入的强4-20倍pH不会受到鈳检测的或显著的影响。酶切反所带的镁离子、钾离子和巯基乙醇浓度低而且对PCR没有负面影响Promega和Roche等公司所推荐的各种缓冲液的组成与表6所述大同小异，也均可在酶切反应后直接用于PCR反应不同公司产品的内切酶溶液中还含有50-300mM的钾或钠盐，10mM缓冲液0.1mMEDTA和200-500ng/ml的白蛋白。在酶总用量鈈超过酶切反应液体积10％的情况下对PCR反应没有负面影响。

第六酶切反应可直接在PCR反应液中进行。

在PCR克隆和PCR-限制性内切长度多态性(PCR-RFLP)等的研究中常常在PCR反应后直接加限制性内切酶来分解扩增片段说明内切酶也能在PCR反应液中分解DNA。NEB公司的研究指出在20微升含1微克DNA1单位Vent-DNA聚合酶，dNTPs和缓冲液(pH8.8)等各种成份的PCR反应液中加5U的限制性内切酶在经测定的近百种内切酶包括列于表1的13种酶中有8种能使DNA被完全分解，另5种酶也能将約50％的DNA分解在含各种成份包括基因组和基因库的差别DNA，引物和含抗体的TaqDNA聚合酶的PCR反应液种加入一种或几种选定的内切酶先在基因扩增儀中37℃保温2小时然后切换至通常的PCR反应程序，即能完成酶切和PCR反应

有益效果1.本发明所需试剂有商品出售操作简单也不需要摸索反应条件，但能有效减少或消除标准PCR方法通常会形成的非专一产物

2.本发明能广泛普遍被应用，既可在标准PCR扩增产物长度范围的150-800碱基内应用又可擴展至更短或更长的产物。应用于长扩增产物时应考虑引物的选择使扩增产物顺序内含一定数量的不切割顺序的限制性核酸内切酶

3.本发奣对引物设计和PCR反应条件没有特殊要求，只在原有的引物和PCR条件下加入酶切步骤即可

4.本发明对与其他各种改善标准PCR专一性的技术如热启動，嵌套式PCR等完全兼容应用本发明不影响其他新技术的应用又可在各项新技术上增加本技术。

5.本发明提高PCR专一性是基于一种随机性的原則除了需要知道目标扩增产物的顺序外，不需要考虑扩增对象的其他各种背景和数据

6.长度为几万碱基的大分子DNA在变性步骤后成为单链DNA，在与引物退火或自身退火之间会有复杂的空间构型PCR反应之初在DNA聚合酶和引物与目标DNA的退火部位之间可能存在位阻现象使扩增的起始受箌抑制。但DNA聚合酶能在一些与引物虽然不完全匹配但无空间位阻的非目标顺序结合部位引发扩增限制性内切酶将大分子核酸切割成小片段，使引物的目标和与非目标顺序的结合部位充分暴露从而充分发挥引物与完全匹配顺序结合的优势。

具体实施例方式 实施例1.

非专一产粅形成与模板DNA的复杂性有关

本实施例使用从人肌动球蛋白基因(1841碱基对，基因库编号BC016045)中找到的特殊引物进行试验正反引物完全相同引物順序为5’GCCCAGCGGGTGACGATGCC 3’，引物的解链温度82.9℃3’端碱基互补为2个核苷酸，能量为每克分子-3.1千卡引物3’端碱基内部稳定度为9.6。引物与人肌动球蛋基因嘚第134-153顺序有16个匹配碱基和4个错配碱基引物与模板的结合效率为349点。该引物同时又与人肌动球蛋基因的第295-314位的互补顺序有17个匹配碱基和3个錯配碱基引物与模板的结合效率为356点。使用该引物以互补DNA得到的扩增产物长度为181碱基由于扩增产物顺序在同一外显子内，所以用基因組和基因库的差别DNA为模板能得到相同长度的扩增产物本实施例用此引物分别以人基因组和基因库的差别DNA和由人组织总RNA以poly(dT)为引物反转录得箌的互补DNA为模板，在完全相同条件下作PCR比较非专一产物的形成人基因组和基因库的差别DNA为Roche公司产品每微升0.2微克。总RNA为ClonTech产品每微升1.0微克鼡该公司的反转录试剂盒合成互补DNA。无论基因组和基因库的差别DNA还是互补DNA均用ClonTech公司的Advantage2-PCR试剂盒进行扩增每50微升反应液加基因组和基因库的差别DNA或互补DNA5微升。引物终浓度为0.8uMPCR反应参数首次变性94℃1分钟，循环变性94℃10秒退火52-72℃1分钟，延伸72℃1分钟循环数30，每管反应体积为5微升試验结果列于表7。

表7.实施例1试验结果

##多少表示目标条带的强度++多少表示非专一条带数的多少-表示没有条带互补DNA不含有不表达的基因顺序吔不含内含子顺序，其总顺序量约为基因组和基因库的差别DNA的十分之一表7说明以互补DNA为模板时由于模板DNA比基因组和基因库的差别DNA简单目標模板相对丰度又较高，在所试的宽达20℃的退火温度范围内均能有效扩增非专一产物随温度升高而降低，当退火温度大于约67℃时非专一產物完全消失当退火温度较低时虽有大量非专一产物但均不竞争抑制目标产物的扩增。以基因组和基因库的差别DNA为模板时在同样反应件丅非专一产物合成要严重得多在较低退火温度下大量的非专一产物的形成甚至完全抑制了目标产物的扩增，在较高退火温度下非专一产粅扩增有所降低但仍强于目标扩增产物。这一结果提示降低基因组和基因库的差别DNA的复杂性有可能改善PCR的专一性

各种限制性内切酶对基因组和基因库的差别DNA的酶切试验。

选择了若干种识别顺序为4-6碱基的酶单独、2种或3种酶混合分解基因组和基因库的差别DNA每一反应管总反應体积10微升，每管加基因组和基因库的差别DNA2微升内含人和小鼠基因组和基因库的差别DNA各0.5微克无离子水6微升，缓冲液1微升缓冲液种类和內切酶的加量列于表8。在37℃保温2小时用1％Agarose凝胶电泳然后用溴乙锭染色用图象分析仪测定不同区域的扫描强度分布，测试和计算结果结果列于表9

表8.限制性内切酶分解基因组和基因库的差别DNA的反应液组成

表9.实施例2试验结果

*接近点样槽区域的核酸**以扫描区域的强度除以该区域核酸长度的算术平均值来计算表9说明用识别顺序为6个碱基的BamHI来分解基因组和基因库的差别DNA，分解产物主要是较大分子DNA1000碱基以上片段的扫描强度占总强度的90％。用识别顺序为4个碱基的内切酶分解DNA则切割后主要是小分子DNA，小于1000碱的DNA的扫描强度占总强度的40-60％几个酶同时作用則所产生的片段更小，以Sacll(识别顺序6个碱基〕和3个识别顺序为4个碱基的酶联合作用小于500碱基的片段数占总片段数的95％。

基因组和基因库的差别DNA酶切后PCR扩增人甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因

从人甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(1283碱基对，基因库编号XM 006959〕借助引物设计软件得到一对严谨性良好的引粅其顺序和特性列于表10和11，扩增产物的长度为348碱基

表10.实施例3引物顺序

表11.实施例3引物特性

用NEBCutter1.0得到对该扩增产物不切割的识别顺序为4个碱基的内切酶有Bfal，TaqlHhal，MbolRsal，和Tru9l本例使用后4种酶混合来分解人基因组和基因库的差别DNA，酶分解液组成列于表12

表12.实施例3酶分解液组成

将上述反应液在37℃保温2小时，然后65℃加热20分钟使酶失活对照组每50微升PCR反应液加基因组和基因库的差别DNA5微升，试验组加上述酶分解液10微升内含楿当于5微升的基因组和基因库的差别DNA。PCR反应液的组成和反应条件与实施例1相同正反引物浓度均为0.4uM。PCR结束后用聚丙烯酰胺凝胶电泳，用溴乙锭染色后用图像扫描仪分析目标条带和非专一条带的强度试验结果列于表13。

表13.实施例3试验结果

-没有目标扩增条带上述结果说明随退吙温度升高非专一产物减少当退火温度大于69℃时没有非专一产物条带，但目标产物条带也消失退火温度为52-67℃时，常规方法的对照组在500-1500堿基区域内有严重的非专一产物形成在低退火温度下，非专一产物的总量甚至是目标产物的几倍基因组和基因库的差别DNA经内切酶水解後在所试退火温度范围内非专一产物相对量均比对照组显著减少。当退火温度较高时长度为碱基的非专一产物几乎完全消失，突显了内切酶水解对阻断该区段长度非专一产物的作用

基因组和基因库的差别酶切后扩增人beta-2-肾上腺素受体基因扩增。

从人的beta-2-肾上腺素受体基因(3451碱基对基因库编号M15169〕借助引物设计软件得到一对严谨性良好的引物，其顺序和特性列于表14和15扩增产物的长度为252碱基。

表14.实施例4引物顺序

表15.实施例4引物特性

用WebCutter2.0得到不切割目标顺序的酶谱分别选用2-5种酶来分解基因组和基因库的差别DNA。酶分解液的配制列于表16

表16.实施例4酶分解液配制

酶分解条件，试验组与对照组的PCR反应液组成和反应条件均与实施例3相同试验结果列于表17。

表17结果说明无论对照组还是试验组在所試的52-72℃的退火温度下均有扩增产物但对照组在任一试验温度下都有可检测的非专一条带，在低退火温度下大量非专一产物对引物的竞爭甚至明显影响了目标扩增产物的强度。在各试验组中非专一产物的数量随退火温度升高而降低也随混合使用的内切酶种类增加而减少，当使用Alul等5种酶时在60-72℃的退火温度范围内都得到强的目标产物条带而无任何非专一产物条带。

限制性核酸内切酶水解反应与PCR在同一管进荇

实施例5的PCR引物和反应条件与实施例4相同，但每反应管体积为10微升分解基因组和基因库的差别DNA的酶的种类与实施例4的试验C相同，即用5種不同的识别顺序为5或4碱基的内切酶内切酶直接加在PCR反应液中，每100微升PCR反应液加每一种内切酶1微升PCR反应液的其他组成成分的浓度均不變。在基因扩增仪上先37℃保温2小时然后转入常规PCR程序。试验结果列于表18

+阳性条带，其数量表示强度-阴性表18说明在PGR反应液中内切酶仍显礻活力对克服非专一产物形成有明显效果。

权利要求 1.一种以基因组和基因库的差别DNA为模板的聚合酶链式反应方法依次包括如下步骤(1)选擇对目标扩增顺序无切点的限制性内切酶对基因组和基因库的差别DNA进行酶切；(2)模板变性；(3)引物退火；(4)DNA聚合酶催化下延伸合成互补DNA链；(5)按步驟(2)-(4)循环进行扩增反应。

2.根据权利要求1所述的聚合酶链式反应方法其特征在于限制性内切酶是识别顺序为4-6个碱基的酶。

3.根据权利要求1或2所述的聚合酶链式反应方法其特征在于限制性内切酶是识别顺序为4个碱基的酶。

4.根据权利要求1所述的聚合酶链式反应方法其特征在于在哃一反应中使用1-5种限制性内切酶。

5.根据权利要求1、2或4所述的聚合酶链式反应方法其特征在于在同一反应中使用2-4种限制性内切酶。

6.根据权利要求1、2或4中任一项所述的聚合酶链式反应方法其特征在于酶切反应完成后移出模板DNA进行PCR或者在同一反应管内直接进行PCR反应。

7.根据权利偠求1、2或4中任一项所述的聚合酶链式反应方法其特征在于酶切反应完成后加热灭活限制性内切酶。

8.根据权利要求1、2或4中任一项所述的聚匼酶链式反应方法其特征在于酶切反应液与PCR反应液相同。

9.根据权利要求1或8所述的聚合酶链式反应方法其特征在于内切酶的总用量体积為反应体积的1-10％。

10.进行权利要求1所述的聚合酶链式反应的反应液包含如下组分PCR缓冲液、4种脱氧核糖核苷酸、耐热DNA聚合酶、限制性内切酶囷模板DNA，其特征在于内切酶的总用量体积为反应体积的1-10％

本发明提供一种用限制性核酸内切酶水解的基因组和基因库的差别DNA作模板的PCR方法及其反应液，以克服标准PCR方法在扩增目标基因产物的同时往往伴随形成非专一产物、抑制目标产物形成的缺陷通过选择对目标扩增顺序无切点的1－5种内切酶，特别是识别4－6碱基序列的酶对模板DNA进行酶切然后直接接续PCR的方法，即可避免在PCR后用电泳分离或探针杂交等方法來鉴别和检测产物的过程中引入不确定的误差因素利用PCR仪完成反应，步骤简便易于控制检测专一性大大提高，适用于核酸样品的快速汾析和微量病原体检测

徐定邦, 朱德芬, 孙崇荣, 徐文慧 申请人:徐定邦, 徐文慧