与缓冲液相关的词条
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百科词条：摘要：缓冲溶液作用原理和pH值当往某些溶液中加入一定量的酸和碱时，有阻碍溶液pH变化的作用，称为缓冲作用，这样的溶液叫做缓冲溶液。弱酸及其盐的混合溶液（如HAc与NaAc），弱碱及其盐的混合溶液（如NH3·H2O与NH4Cl）等都是缓冲溶液。由弱酸HA及其盐NaA所组成的缓冲溶液对酸的缓冲作用，是由于溶液中存在足够量的碱A-的缘故。当向这种溶液中加入一定量的强酸时，H离子基本上被A-离子消耗：所以溶液的pH值几乎不变；当加入一定量强碱时，溶液中存在的弱酸HA消耗OH-离子而阻碍pH的变化。缓冲溶液的缓冲能力在缓冲溶液中加入少量强酸或强碱，其溶液pH值变化不大，但若加入酸，碱的量多时，缓冲溶液就失去了它的缓冲作用。这说明它的缓冲能力是有一定限度的。缓冲溶液的缓冲能力与组成缓冲溶液的组分浓度有关。0.1mol·L-1HAc和0.1mol·L-1NaAc组成的缓冲溶液，比0.01mol·L-1HAc和0.01mol·L-1NaAc的缓冲溶液缓冲能力大。关于这一点通过计算便可证实。但缓冲溶液组分的浓度不能太大，否则，不能忽视离子间的作用。组成缓冲溶液的两组分的比值不为1∶1时，缓冲作用减小，缓冲能力 [ 最后修订于 23:53:59 1790字 ]
相关词条：《中华人民共和国药典》（2010年版）三部附录Ⅷ附录ⅧA免疫印迹法：本法系以供试品与特异性抗体结合后，抗体再与酶标抗体特异性结合，通过酶学反应的显色，对供试品的抗原特异性进行检查。试剂：（1）TG缓冲液称取三羟甲基氨基甲烷15.12g与甘氨酸72g，加水溶解并稀释至500ml。4℃保存。（2）EBM缓冲液量取TG缓冲液20ml、甲醇40ml，加水稀释至200ml。4℃保存。（3）TTBS缓冲液称拼音：pHzhícèdìngfǎ除另有规定外，水溶液的pH值应以玻璃电极为指示电极，用酸度计进行测定。酸度计应定期检定，使精密度和准确度符合要求。一、仪器校准（定位）用的标准缓冲液应使用标准缓冲物质配制，配制方法如下。(1)草酸三氢钾标准缓冲液精密称取在54±3℃干燥4～5小时的草酸三氢钾[KH3(C2O4)2·2H2O]12.61g，加水使溶解并稀释至1000ml。(2)邻苯二甲酸氢钾标准缓冲拼音：xuèhóngdànbáidiànyǒng英文：HE;hemoglobinelectrophoresis概述：各种血红蛋白具有不同的等电点，在一定pH值的缓冲液中可带不同电荷。在碱性缓冲液中带负电荷，反之带正电。在一定的电场中带有不同电荷的Hb分子可分别向正极或负极移动，其移动速度随Hb分子所带电荷的强弱而不同，结果形成各种区带——电泳图谱。从电泳图谱中可初步鉴别出各种异常血红蛋白，经光电反应需在碱性溶液中进行，但碱性太强，可能生成白色Mg（OH）2沉淀，所以反应的pH值需控制在一定范围内，因此利用NH3·H2O和NH4Cl组成的缓冲溶液，保持溶液的pH值条件下，进行上述反应。常用缓冲液配制枸橼酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH4.0)甲液:取枸橼酸21g或无水枸橼酸19.2g,加水使溶解成1000ml，置冰箱内保存。乙液：取磷酸氢二钠71.63g，加水使溶解成1000ml。取上述甲液6orEyeUse滴眼用利福平药典标准：品名：中文名：滴眼用利福平汉语拼音：DiyanyongLifuping英文名：RifampicinforEyeUse来源含量：本品包括利福平片、或滴丸或颗粒及缓冲液两部分，临用时配制成滴眼液。含利福平（C43H58N4O12）应为标示量的90.0%～110.0%。性状：本品为暗红色至橙红色的片、滴丸或颗粒，缓冲液为无色澄明的液体。鉴别：（1）取本品的细粉适量相中分配系数的不同使组分分离，其中一相被涂布或键合在固体载体上，称为固定相，另一相为液体或气体，称为流动相；常用的载体有硅胶、硅藻土、硅镁型吸附剂与纤维素粉等。离子交换色谱法是利用被分离物质在离子交换树脂上交换能力的不同使组分分离；常用的树脂有不同强度的阳离子交换树脂、阴离子交换树脂，流动相为水或含有机溶剂的缓冲液。分子排阻色谱法又称凝胶色谱法，是利用被分离物质分子大小的不同导致在填料上渗透程度不值定义为水溶液中氢离子活度的负对数，即pH=-lgaH+。但氢离子活度却难以由实验准确测定。为实用方便，溶液的pH值规定为由下式测定：式中E为含有待测溶液（pH）的原电池电动势，V;Es为含有标准缓冲液（pHs）的原电池电动势，V;k为与温度（t，℃）有关的常数。k=0.198（t-25）由于待测物的电离常数、介质的介电常数和液接界电位等诸多因素均可影响pH值的准确测量，所槽中取出；两侧电泳槽A内的铂电极D经隔离导线穿过槽壁与外接电泳仪电源相连。电源为具有稳压器的直流电源，常压电泳一般在100～500V，高压电泳一般在500～10000V。2.操作法(1)电泳缓冲液枸橼酸盐缓冲液(pH3.0)取枸橼酸(C6H8O7·H2O)39.04g与枸橼酸钠(C6H5Na3O7·2H2O)4.12g，加水4000ml，使溶解。(2)滤纸取色谱滤纸置1mol/L甲酸溶液中浸泡过夜9)-99拉丁文或英文：SerrapeptaseTablets主要活性成分：本品含舍雷肽酶性状：本品为白色或类白色肠溶薄膜衣片，除去薄膜衣后显灰白色至淡褐色。鉴别：称取本品细粉适量，用盐酸-硼酸盐缓冲液（注）配制成每1ml中含有30～50单位的舍雷肽酶液。照[效价测定]项下的方法测定，溶液应呈蓝色。检查：溶出度取本品，照溶出度测定法（中国药典1995年版二部附录XC第二法），以盐酸溶液（9?10已知量的胰岛素标准品或血浆样品相混合，使之发生特异性结合。然后用葡聚糖炭粉分离游离胰岛素和结合的胰岛素，测定葡聚糖炭粉的放射性。葡聚糖炭粉吸附的放射性随标本中胰岛素含量增加而增加。试剂：（1）标记缓冲液（0.5mol/L磷酸钾缓冲液，pH值7.5）。（2）测定缓冲液（0.05mol/L磷酸钾缓冲液，pH值7.5，含0.1%牛血清白蛋白和0.1%叠氮钠）。（3）柱饱和缓冲液（0.05mol/L磷酸拼音：bōlísuānméicèdìngfǎ试剂(1)醋酸－醋酸钾缓冲液取醋酸钾14g与冰醋酸20.5ml,加水使成1000ml。(2)磷酸盐缓冲液取磷酸二氢钠2.5g、无水磷酸氢二钠1.0g与氯化钠8.2g，加水使成1000ml。(3)水解明胶取明胶50g，加水1000ml，在121℃加热90分钟，然后冷冻干燥。(4)水解明胶稀释液取磷酸盐缓冲液与水各250ml，加水解明胶330mg，摇匀，在灭活工艺。性状：本品为白色或类白色粉末；无臭。本品在水中易溶，在乙醇或乙醚中几乎不溶。鉴别：（1）取已测得效价的本品适量，精密称定，加纯度项下的磷酸盐缓冲液溶解并定量稀释制成每1ml中含10单位的溶液。精密量取4ml，置10ml量瓶中，用上述缓冲液稀释至刻度，作为供试品溶液。取效价测定项下的底物溶液2.9ml，在30℃±0.5℃预热5分钟，置1cm比色池中，精密加入供试品溶液0.1ml，混匀，立灭活工艺。性状：本品为白色或类白色粉末；无臭。本品在水中易溶，在乙醇或乙醚中几乎不溶。鉴别：（1）取已测得效价的本品适量，精密称定，加纯度项下的磷酸盐缓冲液溶解并定量稀释制成每1ml中含10单位的溶液。精密量取4ml，置10ml量瓶中，用上述缓冲液稀释至刻度，作为供试品溶液。取效价测定项下的底物溶液2.9ml，在30℃±0.5℃预热5分钟，置1cm比色池中，精密加入供试品溶液0.1ml，混匀，立度向极性相反的电极方向进行泳动，使组分分离成狭窄的区带，用适宜的检测方法记录其电泳区带图谱或计算其含量的方法。除另有规定外，各电泳法照下述方法操作。附录ⅣA醋酸纤维素薄膜电泳法：试剂：（1）巴比妥缓冲液（pH8.6）称取巴比妥2.76g、巴比妥钠15.45g，加水溶解使成1000ml。（2）氨基黑染色液称取氨基黑10B0.5g，溶于甲醇50ml、冰醋酸10ml及水40ml的混合液中。（3）漂洗液值定义为水溶液中氢离子活度的负对数，即pH=-lgaH+。但氢离子活度却难以由实验准确测定。为实用方便，溶液的pH值规定为由下式测定：式中E为含有待测溶液（pH）的原电池电动势，V;ES为含有标准缓冲液（pHS）的原电池电动势，V；k为与温度（t，℃）有关的常数。k=0.198（t-25）由于待测物的电离常数、介质的介电常数和液接界电位等诸多因素均可影响pH值的准确测量，所清麝香草酚浊度试验（TTT）。分类：血液生化检查蛋白质测定化验取材：血液化验方法：肝功能检查原理：肝脏疾病时，血清蛋白的质与量有所改变，当血清和麝香草酚巴比妥液试剂作用时，麝香草酚可减低血清内脂类物质的分散力，而血清经低离子强度的巴比妥缓冲液稀释后，球蛋白的部分溶解度降低而产生沉淀，这种沉淀是球蛋白、脂类和麝香草酚复合体，使溶液变浊，其浑浊程度与沉淀的多少与肝病的严重程度有一定的关系。试剂：麝香草抑制絮浊的作用有差异，目前临床常用的有TTT试验。检查名称：麝香草酚浊度试验分类：血液生化检查蛋白质测定取材：血液麝香草酚浊度试验的原理：肝脏疾病时，血清蛋白的质与量有所改变，当血清和麝香草酚巴比巴比妥液试剂作用时，麝香草酚可减低血清内脂类物质的分散力，而血清经低离子强度的巴比妥缓冲液稀释后，球蛋白的部分溶解度降低而产生沉淀，这种沉淀是球蛋白、脂类和麝香草酚复合体，使溶液变浊，其浑浊程度与沉淀的拼音：xuèqīngdànbáidiànyǒng英文：serumprSPE;SPEP概述：蛋白质等生物分子在缓冲液中带负电荷或正电荷，在电场中向阳极或阴极运动，称为电泳（electmphomsis）。由于其等电点不同，分子大小、形状和荷质比的不同，使不同蛋白质分子具有不同的电泳迁移率，在一定的支持介质中可借以分离各种蛋白质。常用的电泳技术有：醋酸纤维素薄概述：蛋白质等生物分子在缓冲液中带负电荷或正电荷，在电场中向阳极或阴极运动，称为电泳（electmphomsis）。由于其等电点不同，分子大小、形状和荷质比的不同，使不同蛋白质分子具有不同的电泳迁移率，在一定的支持介质中可借以分离各种蛋白质。常用的电泳技术有：醋酸纤维素薄膜电泳、琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、免疫电泳等。血清蛋白电泳以醋酸纤维素薄膜应用最为普遍。别名：SPE血清蛋白电泳的医剂外，一般常用的化学试剂分为基准试剂、优级纯、分析纯与化学纯四个等级，选用时可参考下列原则：（1）标定滴定液用基准试剂；（2）制备滴定液可采用分析纯或化学纯试剂，但不经标定直接按称重计算浓度者，则应采用基准试剂；（3）制备杂质限度检查用的标准溶液，采用优级纯或分析纯试剂；（4）制备试液与缓冲液等可采用分析纯或化学纯试剂。一水合碳酸钠SodiumCarbonateMonohydrate[Na2CO3d别名：FFA,非脂化脂肪酸血清游离脂肪酸医学检查：化验取材：血液化验方法：脂类测定化验类别：血液生化检查脂类测定取材：血液原理：酶法测定血清游离脂肪酸分三步反应，反应式如下：（1）（2）（3）试剂：以Boehringermannheim游离脂肪酸测定试剂盒为例：（1）缓冲液Ⅰ：0.2mol/LpH7.5KH2PO4（用5mol/LKOH调pH）。（2）81mol/LATP溶液：125mgATPlígānyóu英文：概述：血中脂肪酸的45%与甘油以酯化形成存在。血清游离甘油医学检查：分类：血液生化检查脂类测定取材：血液原理：酶法测定血清游离脂肪酸分三步反应，反应式如下：（1）（2）（3）试剂：以Boehringermannheim游离甘油测定试剂盒为例：（1）缓冲液Ⅰ：0.2mol/LpH7.5KH2PO4（用5mol/LKOH调pH）。（2）81mol/LATP溶液：125mgATP溶脂肪酸分类：血液生化检查脂类测定长碳链脂肪酸的测定原理：酶法测定血清游离脂肪酸分三步反应，反应式如下：（1）（2）（3）试剂：以Boehringermannheim游离脂肪酸测定试剂盒为例：（1）缓冲液Ⅰ：0.2mol/LpH7.5KH2PO4（用5mol/LKOH调pH）。（2）81mol/LATP溶液：125mgATP溶于2.5ml缓冲液Ⅰ中。（3）10mmol/LMgCl2溶液。（4）10的混悬液，依法测定（2010年版药典二部附录ⅥH），pH值应为2.5～4.0。溶液的澄清度与颜色：取本品5份，各0.55g，分别加2%碳酸钠溶液5ml溶解后，溶液应澄清无色；如显浑浊，与1号浊度标准液（2010年版药典二部附录ⅨB）比较，均不得更浓；如显色，与黄色或黄绿色7号标准比色液（2010年版药典二部附录ⅨA第一法）比较，均不得更深。有关物质：临用现配。取本品约20mg，精密称定，加上述p量，加0.05mol/L三羟甲基氨基甲烷缓冲液（用1mol/L盐酸溶液调节pH值至7.5）溶解并制成每1ml中含重组人生长激素2mg的溶液，作为供试品溶液；另取重组人生长激素对照品适量，同法制备，作为对照品溶液。照相关蛋白质检查项下的色谱条件试验，供试品溶液主峰的保留时间应与对照品溶液主峰的保留时间一致。（2）取重组人生长激素对照品，加鉴别（1）项下的缓冲液溶解并制成每1ml中含2mg的溶液，取此量，加0.05mol/L三羟甲基氨基甲烷缓冲液（用1mol/L盐酸溶液调节pH值至7.5）溶解并制成每1ml中含重组人生长激素2mg的溶液，作为供试品溶液；另取重组人生长激素对照品适量，同法制备，作为对照品溶液。照相关蛋白质检查项下的色谱条件试验，供试品溶液主峰的保留时间应与对照品溶液主峰的保留时间一致。（2）取重组人生长激素对照品，加鉴别（1）项下的缓冲液溶解并制成每1ml中含2mg的溶液，取此量，加0.05mol/L三羟甲基氨基甲烷缓冲液（用1mol/L盐酸溶液调节pH值至7.5）溶解并制成每1ml中含重组人生长激素2mg的溶液，作为供试品溶液；另取重组人生长激素对照品适量，同法制备，作为对照品溶液。照相关蛋白质检查项下的色谱条件试验，供试品溶液主峰的保留时间应与对照品溶液主峰的保留时间一致。（2）取重组人生长激素对照品，加鉴别（1）项下的缓冲液溶解并制成每1ml中含2mg的溶液，取此物4-甲基伞形酮N-乙酰β-D-氨基葡萄糖苷水解，释放出游离的4-甲基伞形酮（4-MU），后者在碱性条件下变构，受激发产生荧光，其荧光强度可反试剂：（1）对硝基酚比色法：①50mmol/L枸橼酸盐缓冲液（pH4.6）：称枸橼酸（C6H3O7·H2O）5.4g，枸橼酸三钠（Na3C6H5O7·2H2O）10g，用蒸馏水溶解后稀释至1000ml。②10mmol/L底物缓冲液：称对硝基苯N-乙酰-β-下引起血浆甲状腺结合球蛋白结合力和浓度改变时，也能较准确反映甲状腺的功能。别名：FT4游离甲状腺素的医学检查：检查名称：游离甲状腺素分类：激素类测定/甲状腺激素测定取材：血液游离甲状腺素的测定原理：血清中的FT4经透析至缓冲液中，而和蛋白质结合的T4仍留在透析袋内。取透析缓冲液和125I-T4混合，再加抗体。反应平衡后加入分离剂将125I-T4和125I-T4-抗体复合物分离。测量125I-T4PO是带有阳离子的蛋白质，在层析时会吸附在柱材料上，而杂蛋白会洗下。后用NaCl梯度洗脱PPO，（NaCl为强离子交换剂，能将弱吸附在柱材料上的PPO置换下来）。粗酶液从而得到纯化。材料与试剂：试剂：0.02MTris-HCL缓冲液Ph7.4（内含0.001MEDTA）配制时配×10倍浓缩液1000NaCL;聚已二醇；DEAE-纤维素DE52；葡聚糖凝胶SephadexG-200;兰葡萄糖化物酶标记的t-PA单克隆抗体起抗原抗体结合反应，形成t-PA-POD复合物。后者可使邻苯二胺基质液呈棕色反应，其反应颜色深浅与标本中t-PA含量呈正比关系。试剂：（1）抗体：抗t-PAF（2b＇）2。（2）过氧化物酶抗体复合物抗：t-PA-peroxidase。（3）基质：邻苯二胺。（4）基质缓冲液：0.2mol/L柠檬酸，0.2mol/L柠檬酸钠缓冲液。（5）稀释缓冲液：白蛋白-磷酸盐缓冲液（灭活工艺。性状：本品为白色或类白色粉末；无臭。本品在水中易溶，在乙醇或乙醚中几乎不溶。鉴别：（1）取已测得效价的本品适量，精密称定，加纯度项下的磷酸盐缓冲液溶解并定量稀释制成每1ml中含10单位的溶液。精密量取4ml，置10ml量瓶中，用上述缓冲液稀释至刻度，作为供试品溶液。取效价测定项下的底物溶液2.9ml，在30℃±0.5℃预热5分钟，置1cm比色池中，精密加入供试品溶液0.1ml，混匀，立口服药物在规定溶剂中，按要求缓慢地恒速或接近恒速释放，且每日用药次数与相应的普通制剂比较至少减少一次或用药的间隔时间有所延长的制剂。肠溶制剂系指口服药物在规定的酸性介质中，不释放或几乎不释放，而在缓冲液中大部分或全部释放的制剂。仪器装置除另有规定处，按溶出度测定法项下所示。第一法用于缓释制剂或控释制剂测定法照溶出度测定法项下进行，但一般采用三个时间取样，在规定时间、规定取样点，吸取溶液适量，立即d别名：FFA,非脂化脂肪酸血清游离脂肪酸医学检查：化验取材：血液化验方法：脂类测定化验类别：血液生化检查脂类测定取材：血液原理：酶法测定血清游离脂肪酸分三步反应，反应式如下：（1）（2）（3）试剂：以Boehringermannheim游离脂肪酸测定试剂盒为例：（1）缓冲液Ⅰ：0.2mol/LpH7.5KH2PO4（用5mol/LKOH调pH）。（2）81mol/LATP溶液：125mgATPP：取[3H]-cAMP（中国原子能研究院产品）92.5kBq（2.5μCi）至瓶中，加琥珀酸酐5mg，去离子水0.1ml，三乙胺10μl，即刻混合，用力摇45s，加50mmol/LpH6.2醋酸缓冲液至10ml，临用前配制。（3）50mmol/LpH6.2醋酸盐缓冲液：取AR级无水醋酸钠4.1g于800ml蒸馏水中，加茶硷1.44g，溶解后用2mol/L醋酸调至pH6.2，加蒸馏水至1000m酸淋洗，收集258nm流出液。合并，冷冻干燥，产物为ScAMP。②取ScAMP：经偶联剂作用和BSA结合，作为免疫原，注射山羊或家兔，制备抗血清。（2）[3H]-ScAMP：取[3H]-cAMP（中国原子能研究院产品）92.5kBq（2.5μCi）至瓶中，加琥珀酸酐5mg，去离子水0.1ml，三乙胺10μl，即刻混合，用力摇45s，加50mmol/LpH6.2醋酸缓冲液至10ml，临用前配制。（速的发展。高效毛细管电泳的基本原理粒子在电场的作用下，以不没的速度向电荷反方向迁移和现象，是一种在空芯、微小内径的毛细管（内径10~200um）中进行的大、小分子的高效分离技术，毛细管两端分别浸入缓冲液中分别插入连有高压电源的电极，该电压使得分析样品沿毛细管迁移，根据被分离物之间电荷和体积的不同，各种分子在高电压下被分离，在自由区带毛细管电泳中，电泳的移动（带电荷分子朝相反极性的电极方向移动）和别：（1）取本品，用水制成每1ml中含1000单位的溶液，取0.5ml，加5%苯酚溶液0.5ml，摇匀，加硫酸2.5ml，摇匀，溶液显橙黄色。（2）取本品，用效价测定项下的0.2mol/L三乙醇胺缓冲液（pH7.8）制成每1ml中含200单位的溶液，作为供试品溶液。取试管1支，加上述缓冲液1.6ml、供试品溶液0.2ml与效价测定项下的胰蛋白酶溶液0.2ml，摇匀，置25℃水浴保温5分钟，加效价率可从标准曲线上查得其AFP浓度。试剂：（1）AFP标准冻干品6瓶。（2）125I-AFP冻干品2瓶，每瓶4.44×105Bq。（3）AFP抗血清冻干品2瓶。（4）聚乙二醇1包，7g。（5）巴比妥缓冲液1瓶。（6）试剂盒的溶解。①缓冲液：将巴比妥缓冲液加40ml蒸馏水稀释。②AFP标准每瓶用1ml缓冲液溶解，则分别成为25，50，100，200，400，800μg/L。③125I-AFP每瓶用6原理：血浆优球蛋白组分中含有纤维蛋白原、纤溶酶原（血浆素原）及其激活物，而不含有抗纤溶酶。用水稀释血浆，降低环境中的离子浓度，且在pH值4.5时使优球蛋白沉淀，经过离心除去抗纤溶酶，并将此沉淀溶于缓冲液中，再加钙或加凝血酶使其凝固。在37℃条件下，观察凝块完全溶解所需要的时间，简称ELT。试剂：（1）0.129mol/L枸橼酸钠溶液。（2）0.025mol/L氯化钙溶液。（3）0.166mol/原理：血浆优球蛋白组分中含有纤维蛋白原、纤溶酶原（血浆素原）及其激活物，而不含有抗纤溶酶。用水稀释血浆，降低环境中的离子浓度，且在pH值4.5时使优球蛋白沉淀，经过离心除去抗纤溶酶，并将此沉淀溶于缓冲液中，再加钙或加凝血酶使其凝固。在37℃条件下，观察凝块完全溶解所需要的时间，简称ELT。试剂：（1）0.129mol/L枸橼酸钠溶液。（2）0.025mol/L氯化钙溶液。（3）0.166mol/精液LDH-X精液乳酸脱氢酶-X的医学检查：检查名称：精液乳酸脱氢酶-X分类：体液和排泄物检查精液和前列腺液检查精液乳酸脱氢酶-X的测定原理：正常精液内含有6种乳酸脱氢酶同工酶，其中LDH-X为精子特异性酶。利用LDH-X的特异底物2-酮基己酸，可测定出LDH-X活性，再用丙酮酸作为总LDH的底物，测定出总的LDH活性，即可求出LDH-X的相对比值和绝对比值。试剂：（1）pH8.6巴比妥缓冲液（，依法测定（2010年版药典二部附录ⅥH），pH值应为3.0～4.0。溶液的澄清度与颜色：取本品5份，各0.6g，分别加碳酸钠溶液（1→100）5ml使溶解，溶液应澄清无色；如显浑浊，与1号浊度标准液（2010年版药典二部附录ⅨB）比较，均不得更浓；如显色，与黄色或黄绿色6号标准比色液（2010年版药典二部附录ⅨA第一法）比较，均不得更深。有关物质：取本品，加流动相A-流动相B（7：93）溶解并，依法测定（2010年版药典二部附录ⅥH），pH值应为3.0～4.0。溶液的澄清度与颜色：取本品5份，各0.6g，分别加碳酸钠溶液（1→100）5ml使溶解，溶液应澄清无色；如显浑浊，与1号浊度标准液（2010年版药典二部附录ⅨB）比较，均不得更浓；如显色，与黄色或黄绿色6号标准比色液（2010年版药典二部附录ⅨA第一法）比较，均不得更深。有关物质：取本品，加流动相A-流动相B（7：93）溶解并，依法测定（2010年版药典二部附录ⅥH），pH值应为3.0～4.0。溶液的澄清度与颜色：取本品5份，各0.6g，分别加碳酸钠溶液（1→100）5ml使溶解，溶液应澄清无色；如显浑浊，与1号浊度标准液（2010年版药典二部附录ⅨB）比较，均不得更浓；如显色，与黄色或黄绿色6号标准比色液（2010年版药典二部附录ⅨA第一法）比较，均不得更深。有关物质：取本品，加流动相A-流动相B（7：93）溶解并，依法测定（2010年版药典二部附录ⅥH），pH值应为3.0～4.0。溶液的澄清度与颜色：取本品5份，各0.6g，分别加碳酸钠溶液（1→100）5ml使溶解，溶液应澄清无色；如显浑浊，与1号浊度标准液（2010年版药典二部附录ⅨB）比较，均不得更浓；如显色，与黄色或黄绿色6号标准比色液（2010年版药典二部附录ⅨA第一法）比较，均不得更深。有关物质：取本品，加流动相A-流动相B（7：93）溶解并，依法测定（2010年版药典二部附录ⅥH），pH值应为3.0～4.0。溶液的澄清度与颜色：取本品5份，各0.6g，分别加碳酸钠溶液（1→100）5ml使溶解，溶液应澄清无色；如显浑浊，与1号浊度标准液（2010年版药典二部附录ⅨB）比较，均不得更浓；如显色，与黄色或黄绿色6号标准比色液（2010年版药典二部附录ⅨA第一法）比较，均不得更深。有关物质：取本品，加流动相A-流动相B（7：93）溶解并，依法测定（2010年版药典二部附录ⅥH），pH值应为3.0～4.0。溶液的澄清度与颜色：取本品5份，各0.6g，分别加碳酸钠溶液（1→100）5ml使溶解，溶液应澄清无色；如显浑浊，与1号浊度标准液（2010年版药典二部附录ⅨB）比较，均不得更浓；如显色，与黄色或黄绿色6号标准比色液（2010年版药典二部附录ⅨA第一法）比较，均不得更深。有关物质：取本品，加流动相A-流动相B（7：93）溶解并，依法测定（2010年版药典二部附录ⅥH），pH值应为3.0～4.0。溶液的澄清度与颜色：取本品5份，各0.6g，分别加碳酸钠溶液（1→100）5ml使溶解，溶液应澄清无色；如显浑浊，与1号浊度标准液（2010年版药典二部附录ⅨB）比较，均不得更浓；如显色，与黄色或黄绿色6号标准比色液（2010年版药典二部附录ⅨA第一法）比较，均不得更深。有关物质：取本品，加流动相A-流动相B（7：93）溶解并，依法测定（2010年版药典二部附录ⅥH），pH值应为3.0～4.0。溶液的澄清度与颜色：取本品5份，各0.6g，分别加碳酸钠溶液（1→100）5ml使溶解，溶液应澄清无色；如显浑浊，与1号浊度标准液（2010年版药典二部附录ⅨB）比较，均不得更浓；如显色，与黄色或黄绿色6号标准比色液（2010年版药典二部附录ⅨA第一法）比较，均不得更深。有关物质：取本品，加流动相A-流动相B（7：93）溶解并下引起血浆甲状腺结合球蛋白结合力和浓度改变时，也能较准确反映甲状腺的功能。别名：FT4游离甲状腺素的医学检查：检查名称：游离甲状腺素分类：激素类测定/甲状腺激素测定取材：血液游离甲状腺素的测定原理：血清中的FT4经透析至缓冲液中，而和蛋白质结合的T4仍留在透析袋内。取透析缓冲液和125I-T4混合，再加抗体。反应平衡后加入分离剂将125I-T4和125I-T4-抗体复合物分离。测量125I-T4
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蛋白质纯度的微乳液毛细管电动色谱分析法
来源：青年人()&更新时间： 17:12:43 &【字体： 】
摘　要　目的：为克服毛细管壁对蛋白质的吸附，探索一种用毛细管电泳分离蛋白质的新模式。方法：在毛细管中，以SDS-正丁醇-正己烷组成的微乳液为分离介质，对蛋白质混合物进行分离，研究温度、pH值、电压、离子强度、SDS浓度、烷烃链长等对蛋白质分离的影响，探索微乳液毛细管电动色谱分离蛋白质的机理。同时，还与毛细管区带电泳和胶束毛细管电动色谱进行比较。结果：微乳液毛细管电动色谱在分离蛋白质时，分离度受温度、电压和SDS浓度影响较大，受pH值和离子强度的影响较小，并用本法成功地分析了重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和重组人肿瘤坏死因子半成品的纯度。结论：本文建立的方法，可有效地用于同时分析酸性和碱性蛋白质混合物。　　关键词　微乳液毛细管电动色谱；蛋白质混合物　　中图分类号　R914.1
CHARACTERIZATION OF PROTEIN PURITIES BY CAPILLARY MICROEMULSION ELECTROKINETIC CHROMATOGRAPHY
Zhou Guohua(Institute for Drug Control of Nanjing Command, Nanjing 210002Luo Guoan，Zhang Xiaodan(Department of Chemistry, Tsinghua University, Beijing 100084)
　　Abstract　AIM In order to develop a new model of capillary electrophoresis to overcome the absorption of proteins in capillary wall.METHODS Microemulsion consisted of 80mmol.L-1 heptane,120mmol.L-1 SDS and 900mmol.L-1 butanol was employed as the protein separation media in the capillary electrophoresis.In addition, the effects of running voltage, temperature, pH and the composition of microemulsion on the separation were studied.The mechanism of microemulsion electrokinetic chromatography (MEEKC) for protein separation was investigated.The results were also compared with those obtained in micellar electrokinetic chromatography and capillary zone electrophoresis.RESULTS The protein separation was affected significantly by temperature,running voltage and SDS concentrations, and affected slightly by pH and ion intensity of the buffer. The examined method was successfully applied in the analyses of the purity characterization of recombinant human granulocyte macrophage colony stimulating factor and recombinant human tumor nerosis factor bulk samples.CONCLUSION The approach developed in this article is practical and can be used to separate acidic and basic proteins simultaneously.　　Key words　Capillary microemulsion electroki protein mixture
1　引　言　　电动色谱必须由两相组成，分析物在这两相之间不断分配从而达到分离。其中一相被称为分离载体，具有与环境介质不同的淌度；另一相通常是水相，即分离载体的溶剂。载体必须与分析物作用，水相必须具有一定的电导率和无紫外吸收。　　在胶束电动色谱（MEKC）中，分离载体为离子胶束，它是由表面活性剂组成，不同的表面活性剂构成不同的胶束，因而具有不同的选择性。MEKC是毛细管电泳的一种重要分离模式，已得到广泛应用［1］。　　在毛细管电泳中，以水包油微乳组成的分离载体，称之为微乳液毛细管电动色谱（Microemulsion Electrokinetic Chromatography, MEEKC）［2～6］。微乳液由水、不溶于水的有机液体、表面活性剂和共表面活性剂组成。其中，水相为缓冲液，油相由烷烃组成。表面活性剂与MEKC中应用的表面活性剂相同，共表面活性剂由中等长度脂肪醇组成，通过不同的组成比例即可得到一热力学稳定和透明的液体。与胶束毛细管电动色谱相比较，MEEKC具有小的油滴内相，表面活性剂和共表面活性剂位于油滴表面，起到稳定油滴均相分散的作用。其组成示意图如图1。
图1　水包油型微乳液与胶束示意图
　　微乳液流出窗口的时间比胶束长，因此对于疏水性强的物质，其分离度比MEKC高。蛋白质类生物大分子是由疏水性不同的各种氨基酸组成，侧链为非极性的氨基酸有：丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸等8种，因此，蛋白质中如含有这些氨基酸，则就存在疏水性。采用MEEKC分离蛋白质，就是基于蛋白质与微乳液之间可产生疏水作用力，在电场作用下，带负电荷的微乳液滴与电渗流的方向相反，最终靠电渗流将其推出检测窗口。MEEKC是一种新型的分离技术，目前仅用于小分子中性物质的分离，但对生物大分子的分离未见报道。本文首次将其用于生物大分子的分离研究。
2　实验部分2.1　试剂与药品　甲醇、冰醋酸、氯化钠、浓氨水、硼砂、乙醇、盐酸、正戊烷、正己烷(南京化学试剂厂，AR)；正庚烷、正辛烷、正壬烷、正癸烷、正丙醇、异丙醇、正戊醇(上海光明化学试剂厂)；十二烷基硫酸钠(SDS)，99.99%(Boehringer Ingelheim公司)；水：Q-Miliplus纯水器制。　　重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(recombinant human granulocyte macrophage colony stimulating factor，简称rHuGM-CSF，批号 980511)和重组人肿瘤坏死因子(recombinant human tumor nerosis factor，简称rHuTNF)纯品（半成品，自制，批号 980504)；格拉诺赛特注射剂(GRANOCYTER Injection)，150μg(1.67×106U)，爱尔兰，先灵葆雅公司(Schering-Plough Co.批号 M5D31)；人血清白蛋白，20%(德国，宝灵曼公司，批号 )。2.2　毛细管电泳测定法　选择适当的毛细管柱，安装于Waters Quanta 4000E毛细管电泳仪上。采用50cm×50μm ID的未涂层石英毛细管柱（Waters随机配件），检测波长为214nm，温度为13℃，压差进样，其余具体条件分别列于图表下。　　所有缓冲液均经0.22μm滤膜滤过，并超声脱气。样品于测定前，经10 000r/min离心脱气2min。新毛细管在使用前，均经0.1mol.L-1NaOH冲洗60 min，水10min，分离缓冲液5min，每两次分离之间采用0.1mol.L-1 NaOH冲洗2min，分离缓冲液5min。用Waters “BASELINE 810”收集和处理数据。
3　结果与讨论3.1　温度对分离的影响　格拉诺赛特注射剂是一种含有重组人粒细胞集落刺激因子(reeombinant human granulo cyte colony stimuiating factor 简称rHuG-CSF)和大量白蛋白的复杂混合物，本文以其为研究对象，用甲醇作测定电渗流的标记物，详细研究了测定条件对MEEKC分离蛋白质的影响。在MEEKC分析蛋白质时，温度对微乳液和蛋白质的构象会产生影响。不同温度下，MEEKC分离格拉诺赛特注射剂中各蛋白组分的结果如图2。
图2　不同温度下格拉诺赛特注射液的MEEKC图谱
分离条件　分离介质80mmol.L-1异辛烷-120mmol.L-1 SDS-900 mmol.L-1正丁醇-2.5mmol.L-1硼砂；pH 9.0；毛细管50cm×50μm ID(Ld=42.5cm)；电压20kV；压差进样15s；检测波长214nm；格拉诺赛特注射液含1mg人血白蛋白和250μg rHuG-CSF糖蛋白。*-rHuG-CSF；1,2,3-人血白蛋白组分
　　图2表明，随着温度的上升，人血白蛋白（HSA）和rHuG-CSF始终能基线分离，但HSA中的三个组分随着温度的上升而分离度下降。这是因为容量因子的对数与温度的倒数呈线形关系，当温度升高时容量因子下降；另外发现，电渗流淌度随着温度增加而增加，为此，进行了进一步研究。　　电渗流的淌度可表示为：
　　　　　　　　　　　　　　　　　(1)
　　而溶液粘度η与温度有关，即
η≈nheψ/κT　　　　　　　　　　　　　　　　　(2)
　　式中：ψ为分子在溶液中移动所需的能量，h为Planck常量，k为Boltzmann常量；n为分子密度。由式（2）可知，随着温度的上升，粘度减小，导致电渗流的淌度增加。由式（1）和式（2），可得如下关系式：
　　　　　　　　　　　　　　　　　(3)
　　　　　　　　　　(4)
　　式中：C1 和C2 在实验温度范围内视为常数。因为μeo=Ld.L/(E.tR ),所以μeo与1/ tR成正比，式（4）又可表达为
lntR=C3 / T+C4　　　　　　　　　　　　　　　　(5)
　　式中C3 和C4 为常数。温度T（绝对温度）与lntR的关系见图3。由图可知：在实验温度范围内，lntR与1/T的线性关系很好。因此可以通过改变温度控制电渗流。
图3　IntR　与1/T的关系
　　以上试验说明：温度上升，微乳液的物化性质发生变化，从而使蛋白的分离度发生改变；低温有利于蛋白的分离。3.2　电压对分离的影响　格拉诺赛特注射液在不同电压下的MEEKC分离结果见图4，当分离电压为20kV时，分离效果最好。
图4　不同电压下格拉诺赛特注射液的MEEKC图谱
　　在MEEKC中，溶质的迁移速度(Ux)可由下式表示：
　　　　　　　　　　　(6)
　　因为tR =Ls/Ux, 所以式6又可以改写为：
　　　　　　　　　　(7)
　　式中，k＇为溶质的容量因子，μme和μep分别为微乳液和溶质的电泳淌度，μeo为电渗流淌度, V为分离电压，Lt 和Ls 分别为毛细管柱总长和分离柱长。　　进一步试验表明当电压小于25kV时，各组分的1/tR 与电压具有良好的线性关系。但在高电压时稍偏离线性，这是由于高电压会产生较强焦耳热效应所致。3.3　pH值对分离的影响　为研究微乳液的酸碱度对MEEKC分离蛋白的影响，采用pH 8～9.5的缓冲液进行试验，结果见图5。
图5　pH值对格拉诺赛特注射液中各成分分离的影响　　分离条件：温度为13℃；其余条件同图2。
　　由图可知：pH值在8～9.5之间电渗流无显著影响，而在MEKC中，pH对电渗流影响较大。因此，可以认为是微乳液中的正丁醇或微乳液本身与管壁产生了某种作用，稳定了管壁的Zeta电位，使电渗流不受pH值的影响。　　另外，从图中还可观察到，随着pH值的增大，各组分的淌度差增大，分离度提高。实验表明：pH8.5～9.5为最佳pH值范围。这是因为pH值的改变会影响蛋白的疏水性，且对等电点不同的蛋白产生的影响不同，所以分离度发生了改变。3.4　微乳液离子强度对分离的影响　微乳液中，硼砂浓度对电渗流和各蛋白组分有效淌度的影响试验表明：当硼砂浓度在1～15mmol.L-1之间时，对电渗流几乎无影响，说明微乳液稳定了毛细管壁的 Zeta电位。同时还发现，硼砂浓度的改变对各蛋白组分有效淌度也几乎无影响，说明蛋白在微乳液中的分配不受硼砂浓度的影响。另外，电流受硼砂浓度的影响也很小，当硼砂浓度为1mmol.L-1时，电流为34.8μA；当硼砂浓度增大20倍(即20mmol.L-1)时，电流为45.7μA，仅增加了31.3%。说明电流的产生主要是由微乳液引起的。3.5　表面活性剂SDS浓度对分离的影响　要形成均一稳定的微乳液，表面活性剂和共表面活性剂（cosurfactant）的量至关重要。当微乳液中共表面活性剂正丁醇和有机液体正辛烷的浓度不变时，SDS的浓度超过CMC后，电渗流不随SDS浓度的改变而变化。同时还可观察到，各蛋白组分的淌度逐步减小，流出窗口的时间延长。进一步研究表明，SDS的浓度影响蛋白在微乳液中的分配，且SDS对疏水性不同的蛋白影响程度不同，存在最佳SDS浓度。3.6　微乳液中烷烃及脂肪醇的链长对分离的影响　　组成微乳液的烷烃的链长，对蛋白分离有一定影响。试验结果表明，随着烷烃链中碳原子数目的增加，电渗流淌度值变化很小。说明链长不同的烷烃油相，只要能形成稳定的微乳液，都能稳定Zeta电位，而蛋白的淌度逐步缓慢减小。实验中还发现，随着烷烃链长的增加，乳化逐步困难，需要增加正丁醇的量。当采用异辛烷和正辛烷对比试验时，发现对分离也无显著性差异，表明烷烃链的形状对分离的影响不大。由此可以认为，只要形成稳定的微乳液，即可完成分离。但对强疏水性蛋白而言，最好采用长链烷烃进行分离。　　少量脂肪醇的存在，能导致表面活性剂在水溶液中CMC很大变化，同时，也大大增加表面活性剂的表面活性，使溶液表面张力降低。在油/水界面上吸附后形成复合物，具有较高的强度，液滴不易集结，微乳液更稳定。本文采用正丙醇、正丁醇、正戊醇分别作为微乳液的共表面活性剂进行试验，发现正丁醇的分离效果最好。链长超过正己醇以上的脂肪醇已不能形成稳定的微乳液。因此，共表面活性剂的链长严重影响分离度，这可能是脂肪醇的链长对微乳液理化性质影响的结果。3.7　与胶束毛细管电动色谱法的比较　采用MEKC和MEEKC法在同样pH值、同样毛细管和分离电压下，分离格拉诺赛特注射液样品，结果见图6。
图6　格拉诺赛特注射液的MEKC和MEEKC分离图谱
分离条件　分离电压　20kV；温度　13℃；压差进样　15s；缓冲液　a-MEKC：10mmol.L-1硼砂-50mmol.L-1SDS（pH8.5）；b-MEEKC：80mmol.L-1异辛烷-120mmol.L-1SDS-900mmol.L-1正丁醇-2.5mmol.L-1硼砂（pH8.5）
　　由图6可知：MEEKC的分离效果明显优于MEKC，说明MEEKC法中的油相对分离起了重要作用。为研究不同pH值对MEKC和MEEKC分离行为的影响是否相同，分别采用pH8.0～9.5的缓冲液分离格拉诺赛特注射液。结果表明，MEKC不能有效地分离人血白蛋白（HSA）中的多组分，而MEEKC则在pH8.5～9.5的范围内，均可使HSA中的三组分基线分离，再次展现了MEEKC分离蛋白的优越性。此外，蛋白在MEEKC中的柱效高于MEKC，并且更接近于高斯峰。3.8　MEEKC分离蛋白质机理的探讨　蛋白质在等电点以外的环境中带有净电荷，除疏水作用外，还有电泳作用。所以，蛋白质在MEEKC中的分离行为应是蛋白疏水性和酸碱性的结合。以等电点不同的四种蛋白混合物试验，结果表明，在CZE和MEEKC中流出窗口的次序不一样，说明两者的分离机理不同；但在MEEKC与MEKC中流出窗口的次序一样。通常蛋白质溶液属于胶体溶液，其分子在1～100nm之间，无法分配到胶束中，胶束仅能与蛋白分子表面结合完成分离。而MEEKC中的油相&100nm，使蛋白分子有可能在两相之间分配。所以，在MEEKC中存在三种分离机理：电泳作用、SDS键合作用和疏水作用。由于MEEKC分离蛋白的效果比MEKC好，所以，疏水作用在蛋白分离中起到了重要作用。3.9　应用　以上研究表明，MEEKC法可有效地分离蛋白质类生物大分子，采用上述优化的实验条件，对rHuGM-CSF和肿瘤坏死因子（rHuTNF）半成品的纯度进行了测定。结果见图7。
图7　rHuGM-CSF纯品的MEEKC图谱
分离条件　分离介质　80mmol.L-1异辛烷-120mmol.L-1SDS-900mmol.L-1正丁醇-2.5mmol.L-1硼砂（pH9.0）；毛细管　45cm×50μm ID(Ld=37.5cm)；分离电压　20kV；温度　a-18℃,b-21℃；检测波长　214nm；a-rHuTNF纯品；b-rHuGM-CSF纯品
　　由图可知：rHuTNF的纯度较好，而rHuGM-CSF存在一个杂质峰。
作者简介：周国华，男，理学博士，副主任药师，南京军区药品检验所所长。
作者单位：周国华（中国人民解放军南京军区药品检验所　南京　210002）　　　　　罗国安（清华大学化学系　北京　100084）
参考文献：1　Watarai H. Microemulsions in separation sciences. J Chromatogr, -2):932　Fukumoto T, Watarai H. Separation mechanism of pesticides by capillary electrophoresis using o/w microemulsions as a migrating solution.Bunseki Kagaku.):4393　Ishihama Y, Oda Y, Asakawa N. Hydrophobicity of cationic solutes measured by electrokinetic chromatography with cationic microemulsions.Anal Chem,):42814　Ishihama Y, Oda Y, Asakawa N. A hydrophobicity scale based on the migration index from microemulsion electrokinetic chromatography of anionic solutes. Anal Chem,):10285　Miksik I, Gabriel J, Deyl Z. Microemulsion electrokinetic chromatography of diphenylhydrazones of dicarbonyl sugars. J Chromatogr,-2):2976　Szucs R, Vanhove E, Sandra P. Micellar and microemulsion electrokinetic chromatography of hop bitter acids. J High Resolution Chromatogr,):189
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