竹林中纤维素降解菌的筛选及其产酶条件优化_词汇网
竹林中纤维素降解菌的筛选及其产酶条件优化
责任编辑：词汇网 发表时间： 17:54:41
竹林中纤维素降解菌的筛选及其产酶条件优化
【摘要】：近年来,竹林覆盖增产技术的广泛应用,在竹笋生产上获得了巨大的经济效益,然而,竹林地中覆盖的有机物短期内难以腐烂降解,严重影响竹子地下鞭系的正常生长发育,并使得竹林土壤物化性质发生改变,已成为竹林退化的重要“元凶”之一。而利用高效纤维素降解菌制作菌剂能够加快竹林有机覆盖物的分解速度,最终减缓或消除竹林退化。另外,纤维素作为潜在能源资源广泛分布于自然界中,储存量巨大,但绝大多数纤维素资源未得到合理利用,甚至直接被废弃,不仅浪费资源,而且污染环境。而筛选出高效降解纤维素菌株是实现纤维素向能源转化较为关键环节。因此,本研究主要是从临安各地竹林土壤中筛选高效纤维素降解菌株,旨在为促纤维素降解菌制剂的制作和纤维素酶产业化生产提供目的菌株,主要研究内容如下:(1)从临安野外竹林地采集枯枝落叶、林地覆盖物、腐殖土壤等样品,通过富集培养、羧甲基纤维素钠平板分离纯化、刚果红染色初筛、滤纸降解试验、测定羧甲基纤维素酶活等方法,分离到87株具有纤维素降解能力菌株,初筛得到10株能分泌胞外纤维素酶菌株,最终筛选出1株高效纤维素降解菌J6-1,其Hc值为2.62,滤纸降解率为42.3%,CMC酶活力为6.87 IU/mL。(2)观察菌株J6-1在CMC-Na平板上的菌落形态特征和菌体显微结构,结果表明菌株J6-1与青霉(Penicilll)形态上较为接近,初步鉴别该菌株为青霉。结合18S rRNA基因片段序列进行分析,确定菌株J6-1与Penicillium oxalicum亲缘关系十分相近,确认J6-1属于草酸青霉(Penicillium oxalicum)。(3)通过对影响菌种J6-1产酶的主要因素(氮源种类、碳源种类、种子菌液接种量、初始pH值、培养温度、培养时间)进行单因素实验,并对碳源添加量、氮源添加量、培养温度、和培养时间四个因素进行4因素3水平的正交试验,最终确定在添加15 g/L稻草粉、3 g/L酵母膏作碳源和氮源,10%接种量,pH=5,40℃,150 r/min发酵培养5 d条件下,该菌株获得最佳CMC酶活和滤纸酶活,分别为41.82 IU/m L和17.26IU/mL,其滤纸酶活力高于可晓等从雷竹林土壤中筛选到的青霉菌2.1(FPA=11.19 IU/mL)。(4)对菌株J6-1进行连续5代传代培养,并测定其每代菌株CMC酶活力和滤纸酶活力,结果表明菌株J6-1各子代菌株均能延续原代菌株高酶活特性,菌株J6-1纤维素降解能力能稳定遗传。(5)通过进行40天竹林覆盖物降解试验结果表明:菌种J6-1对木质素最大降解率为26.73%、纤维素最大降解率为38.73%、40天共减重768.65g,相比未接种菌剂空白组,接种菌剂组能够明显提高竹林有机覆盖物降解速度,说明获得的纤维素降解菌株J6-1对竹林有机覆盖物有较好的降解效果。
【关键词】：纤维素 纤维素降解菌 筛选 发酵条件 优化 【学位授予单位】：浙江农林大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2015【分类号】：S714.3【目录】：
摘要4-6ABSTRACT6-15第一章 文献综述15-25 1.1 竹林概况15 1.2 纤维素15-17 1.2.1 纤维素的结构16 1.2.2 纤维素的性质16-17 1.2.3 纤维素的利用17 1.3 纤维素降解技术17-19 1.3.1 化学方法18 1.3.2 物理方法18 1.3.3 生物方法18-19 1.4 纤维素降解菌19-20 1.4.1 纤维素降解菌来源19 1.4.2 纤维素降解菌研究进展19-20 1.5 纤维素酶20-22 1.5.1 纤维素酶种类20 1.5.2 纤维素酶作用机制20-21 1.5.3 纤维素酶来源21 1.5.4 纤维素酶的应用21 1.5.5 纤维素酶活力测定21-22 1.6 本研究的意义与内容22-25 1.6.1 研究目的22-23 1.6.2 研究内容23-24 1.6.3 技术路线24-25第二章 纤维素降解菌的筛选25-39 2.1 试验材料和仪器设备25-27 2.1.1 样品来源25 2.1.2 培养基25-26 2.1.3 主要试剂26 2.1.4 实验主要溶液配置26 2.1.5 仪器设备26-27 2.2 方法27-29 2.2.1 富集培养27 2.2.2 纤维素降解菌的分离纯化27 2.2.3 纤维素降解菌初筛27 2.2.4 滤纸降解试验27 2.2.5 粗酶液的制备27 2.2.6 标准曲线绘制27-28 2.2.7 羧甲基纤维酶（CMCase）活力测定28 2.2.8 滤纸酶（FPase）活力测定28-29 2.3 结果与分析29-37 2.3.1 菌株的分离29-31 2.3.2 纤维素降解菌的初筛31-36 2.3.3 初筛菌株对滤纸的降解效果36-37 2.3.4 酶活力测定结果37 2.4 小结与讨论37-39第三章 菌株形态学分析及分子鉴定39-43 3.1 试验材料和仪器设备39 3.1.1 主要试剂39 3.1.2 仪器设备39 3.2 方法39-41 3.2.1 菌株J6-1 形态特征观察39 3.2.2 基因组DNA提取39-40 3.2.3 ITS rDNA扩增与测序40-41 3.3 结果与分析41-42 3.3.1 菌株J6-1 形态学特征41 3.3.2 菌株J6-1 分子鉴定41-42 3.4 小结与讨论42-43第四章 菌株J6-1 产酶条件优化43-51 4.1 试验材料和仪器设备43-44 4.1.1 实验原料43 4.1.2 菌种43 4.1.3 培养基43-44 4.1.4 主要试剂44 4.1.5 仪器设备44 4.2 方法44-45 4.2.1 氮源对菌株产酶活力的影响44 4.2.2 碳源对菌株产酶活力的影响44 4.2.3 接种量对菌株产酶活力的影响44-45 4.2.4 pH值对菌株产酶活力的影响45 4.2.5 培养温度对菌株产酶活力的影响45 4.2.6 培养时间对菌株产酶活力的影响45 4.2.7 正交优化菌株J6-1 产酶条件45 4.2.8 菌株J6-1 酶活稳定性研究45 4.3 结果与分析45-50 4.3.1 氮源对菌株产酶活力的影响45-46 4.3.2 碳源对菌株产酶活力的影响46 4.3.3 接种量对菌株产酶活力的影响46-47 4.3.4 pH值对菌株产酶活力的影响47 4.3.5 培养温度对菌株产酶活力的影响47-48 4.3.6 培养时间对菌株产酶活力的影响48-49 4.3.7 正交优化结果49 4.3.8 菌株J6-1 酶活稳定性研究结果49-50 4.4 小结与讨论50-51第五章 菌种J6-1 对竹林覆盖物降解效果研究51-58 5.1 试验材料和仪器设备51 5.1.1 原料51 5.1.2 实验药品51 5.1.3 仪器设备51 5.2 方法51-53 5.2.1 竹林覆盖物降解试验51-52 5.2.2 木质素分析方法52 5.2.3 纤维素分析方法52-53 5.2.4 质量分析53 5.3 结果与分析53-57 5.3.1 覆盖物性状变化53-54 5.3.2 木质素变化54-55 5.3.3 纤维素变化55-56 5.3.4 质量变化56-57 5.4 小结与讨论57-58第六章 实验结论与展望58-59 6.1 实验结论58 6.2 展望58-59参考文献59-64附录64
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某实验小组欲从豆油污染的土壤中筛选出能高效降解脂肪的菌株。请回答：（1）在筛选过程中，应将土壤样品稀释液接种于以
为唯一碳源的固体培养基上，从功能上讲，该培养基属于
培养基。（2）为避免培养皿污染，需将培养皿呈
状态放置。为避免培养液中菌体浓度过高，需将培养液进行
处理。为了排除
，需设置接种等量无菌水的培养基作为空白对照。（3）为了筛选出菌株，可将适量的
试剂滴加在平板中的菌落周围，洗去浮色后，如果菌落周围的现象是
,则说明此种菌能够分泌脂肪酶。（4）纯化菌种时，为了得到单菌落，可采用
法接种于新的培养基平板上。 
（1）豆油 选择
（2）倒置 系列稀释（或“梯度稀释”） 实验组中非测试因素对实验结果的影响 （培养基被污染）
（3）苏丹Ⅲ（或苏丹Ⅳ） 出现透明圈（不出现红色圈或橘黄色圈）
（4）平板划线
试题分析：（1）依题意可知：欲从豆油污染的土壤中筛选出能高效降解脂肪的菌株应将土壤样品稀释液接种于以豆油为唯一碳源的固体培养基上，从功能上讲，该培养基属于选择培养基。
...
考点分析：
考点1：微生物的利用
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下面是与高中生物实验有关的内容，请回答相关问题：组别实验材料实验试剂实验目的A杨树根的永久装片--------高倍镜的使用B新鲜的菠菜叶片无水乙醇（丙酮）、SiO2、层析液观察叶绿体中的色素C糖尿病人的尿液斐林试剂观察特定颜色D洋葱根尖解离液、龙胆紫溶液等观察细胞的有丝分裂（1）A组实验中用同一个显微镜观察了同一装片四次，每次仅调整目镜或物镜、细准焦螺旋，结果如下图所示。其中视野最暗的是
。 （2）B组实验中还需要加入的试剂是
。上面表示B组实验新鲜菠菜叶中四种色素在滤纸条上的分离结果示意图。其中色素带c呈现为
色，主要吸收
。请指出该结果的错误之处
。（3）C组实验观察到特定的颜色是
，用正常人的尿液重复实验观察到的颜色是
。（4）做D实验时，主要观察根尖分生区细胞，呈
形；某同学绘制了细胞分裂期的四个时期模式图，下列四图出现的先后顺序为
（用字母表示）。B时期染色体的特点
。   
辣椒素是辣椒属植物中的一种含量很少的活性碱，它斥水亲脂，具有镇痛消炎作用，能够起到降血压和降胆固醇的功效。请回答：（1）根据辣椒素的性质，我们可以用萃取的方法提取。萃取的效率主要取决于
，同时还受到原料颗粒的大小、紧密程度、含水量等条件的影响。萃取剂可选用
（填“乙醇”或“石油醚”）,萃取加热时需安装冷凝回流装置，其目的是
。萃取液的浓缩可直接使用
装置，在浓缩之前，还要进行
。（2）为培育具有优良性状的辣椒，科学家对辣椒种子诱变后播种，取其花粉进行组织培养, 以获得优良性状的纯合子。诱导花粉植株能否成功的主要影响因素有
炭疽杆菌能引起人畜患炭疽病。对炭疽病疑似患者，可通过甲图所示鉴定炭疽杆菌的实验进行确诊。下表是培养炭疽杆菌的某培养基成分，其中实验组中的噬菌体能特异性地侵染炭疽杆菌。（1）据表分析“某培养基”属于
。（多选）①固体培养基
②液体培养基
③通用培养基
④选择培养基（2）若要从炭疽病疑似患者体内分离炭疽杆菌，可将患者皮肤脓胞渗出物稀释后滴于培养基表面，用无菌玻璃刮铲涂匀，该接种方法称为
。乙图所示的四种菌落分布图，由该接种方法得到的是
。（多选）（3）制备甲图中的液体培养基时需釆取
方法灭菌，目的是
。接种可疑菌后，经35℃培养24小时，液体培养基变浑浊，原因是
。（4）甲图中，对照组试管中应加入
后与实验组同时培养。6小时后，若实验组液体培养基的浑浊度比对照组
（高/低），则可明确疑似患者被炭疽杆菌感染；反之则排除。此实验依据的原理是
纤维素是自然界分布最广、含量最多的一种多糖,马、牛等食草动物具有消化纤维素的能力,请回答有关问题。（1）与培养土壤中分离的纤维素分解菌相比,培养马胃中分离出的纤维素分解菌要调整培养基的pH,还要保证
条件。配制好的培养基培养前应采用
法进行灭菌处理。从功能上看,该培养基是
培养基。（2）给锥形瓶内的培养液接种时应在酒精灯火焰附近进行,防止
污染培养基。对无菌操作时用到的玻璃器皿要用
的方法彻底灭菌。（3）某同学使用划线法分离纯化菌株,经一段时间培养,发现有的线上长满了菌,有的线上无菌落；造成这种情况的原因可能是划线操作时
。（4）将筛选培养的纤维素分解菌破碎后,用
的方法可将纤维素酶溶液与其他细胞成分分离开。纤维素酶能催化纤维素分解为还原性的葡萄糖,根据这一特性,可用
试剂判断提取物是否起到了降解纤维素的作用。 
我国现己成为世界上第三大生物乙醇生产国和应用国。根据原料不同，生物乙醇可分为以淀粉类物质为原料的第1代生物乙醇和以秸秆等纤维素为原料的第2代生物乙醇。两者的生产过程都需要多种微生物参与，且在较高温度下反应能提高产率。（1）生产第1代生物乙醇时，首先利用微生物或酶将淀粉材料彻底水解为
，才能利用。酵母菌在
条件下将其转化为乙醇。（2）生产第2代生物乙醇时需要纤维素分解菌，为此，小明同学设计了两种培养基。甲培养基含纤维素粉5g、酵母膏0．5g、水解酪素0．5g、无机盐适量；乙培养基含CMC-NalOg、 酵母膏1g、琼脂15g、土豆汁]00mL、无机盐适量。①在上述
（填“甲”或“乙”）种培养基上能够筛选出纤维素分解菌的单菌落，另外一种培养基的作用是
。②为防止杂菌污染，除要对培养基进行
灭菌，还需要对操作者的双手进行清洁和
。③筛选符合生产要求的高产率菌种还需要提供
条件。 
题型：综合题
难度：中等
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官方公共微信() 苯酚是工业生产排放的有毒污染物质.自然界中存在着降解苯酚的微生物.某工厂产生的废水中含有苯酚.为了降解废水中的苯酚.研究人员从土壤中筛选获得了只能降解利用苯酚的细菌菌株.筛选的主要步骤如图所示.①为土壤样品.请回答下列问题: (1)②中培养目的菌株的选择培养基中应加入 作为碳源.②中不同浓度碳源的培养基 细菌的数量.如果要测定 题目和参考答案——精英家教网——
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（《生物技术实践》）
苯酚是工业生产排放的有毒污染物质，自然界中存在着降解苯酚的微生物。某工厂产生的废水中含有苯酚，为了降解废水中的苯酚，研究人员从土壤中筛选获得了只能降解利用苯酚的细菌菌株，筛选的主要步骤如图所示，①为土壤样品。请回答下列问题：
（1）②中培养目的菌株的选择培养基中应加入________作为碳源，②中不同浓度碳源的培养基________（A．影响；B．不影响）细菌的数量，如果要测定②中活细菌数量，常采用________法。
（2）④为对照，微生物在④中不生长，在⑤中生长，④与⑤培养基的主要区别在于________；使用________法可以在⑥上获得单菌落。采用固体平板培养细菌时为什么进行倒置培养？
（3）如何比较不同菌株降解苯酚能力的大小？
答案：解析：
　　（1）苯酚　A　稀释涂布平板法
　　（2）④与⑤培养基的主要区别在于④的培养基没有加入苯酚作为碳源，⑤培养基的中加入苯酚作为碳源。使用释涂布平板法或平板划线法可以在（6）上获得单菌落。
　　采用固体平板培养细菌时要倒置培养，以防止冷凝后形成的水珠滴落在培养基上污染培养基。
　　（3）5支洁净培养瓶→分别加入相同培养基（加等量的苯酚，用pH试纸检测这5支瓶内培养基的pH，用苯酚调试使之相等，苯酚是唯一的碳源）→分别接种5种等量的来自不同菌株的菌种→在相同的适宜条件下培养相同的时间→再用pH试纸检测这5支瓶内培养基的pH。
　　苯酚显酸性，不同菌株的菌种降解苯酚的能力不同，5支瓶内培养基中的苯酚被分解的量不同，所以pH不同。用pH试纸检测这5支瓶内培养基的pH，从而比较不同菌株降解苯酚能力的大小。
请在这里输入关键词：
科目：高中生物
来源：2011――2012学年云南省会泽县茚旺高级中学高二9月月考生物试卷
题型：综合题
(8分)请分析回答下列有关生物技术实践方面的问题：(1)在制作腐乳、果醋、泡菜的过程中需要氧气的是__________________。(2)无菌技术主要通过消毒和灭菌来避免杂菌的污染。常用的灭菌方法有________灭菌、干热灭菌和________灭菌。(3)植物组织培养技术基本操作的正确顺序是__&&&&&&&&&&__。①外植物消毒　②制备MS培养基　③接种　　④培养　⑤栽培　⑥移栽A．①→②→③→④→⑤→⑥&&&& B．②→①→③→④→⑤→⑥C．②→①→③→④→⑥→⑤&&&& D．①→②→③→④→⑥→⑤(4) 在植物组织培养过程中，需要使用植物激素______________和_______________。(5)根据果胶酶在果汁生产中的作用，在原材料有限的情况下，能正确表示相同时间内果胶 酶的用量对果汁产量影响的曲线是________。(6)稀释涂布平板法分离纯化土壤中微生物的正确操作步骤是(　　)①土壤取样　②称取10g土壤加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中制备土壤提取液　③吸取0.1mL进行平板涂布　④依次稀释至101、102、103、104、105、106、107稀释度A．①②③④　　& B．①③②④&&&&&& C．①②④③&&&&&&D．①④②③
科目：高中生物
来源：2010年宁夏银川一中高三上学期第二次月考（理综）生物部分
题型：综合题
[生物———选修I生物技术实践]以下是制作果醋和果酒的流程示意图，回答下列有关问题：（1）图1中方框内所示流程为________________，通常在______________℃进行。（2）冲洗的主要目的是&&&&&&&&&&&&&&&，冲洗时应特别注意不能&&&&&&&&&&&&&&&，以防止菌种的流失。（3）某同学设计了图2所示的装置。充气口的主要作用是在醋酸发酵阶段___________；排气口排出的主要是由&&&&&&&&&&&&&产生的______；排气口通过一个长而弯曲的胶管与瓶身连接是为了&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&；出料口的作用是&&&&&&&&&&&&&。（4）在酒精发酵阶段主要发生的化学反应是_____________________（总反应式）。果酒所呈现出的颜色，来自&&&&&&&&&&&&&&，果酒中是否有酒精，可以用&&&&&&&&&检验。（5）在用玻璃瓶进行酒精发酵生产时，必须对玻璃瓶用&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&进行消毒，然后再加入葡萄汁，加入的葡萄汁不应超过玻璃瓶体积的&&&&&&&&&&&&。
科目：高中生物
来源：学年河北衡水中学高三下期期中考试生物卷（解析版）
题型：综合题
请回答下列在生物技术实践过程中，对某些实验步骤的操作中的相关问题：(1)在腐乳的制作时，用来腌制腐乳的玻璃瓶，洗刷干净后要用????????? 消毒；在提取植物细胞的DNA时，需要先用洗涤剂溶解???????? 。(2)葡萄皮、籽中含有原花青素、葡萄皮红素和大量葡萄风味物质等，这些物质易溶于乙醇、乙酸乙酯中，因此常采用______法来分离提取，还可以用???????????? 和?????????? 等提取植物芳香油的方法。(3)为了检测某致病菌对于抗生素的敏感性，取该单菌落适当稀释，接种于固体培养基表面，在37℃培养箱中培养24h，使其均匀生长，布满平板。将分别含有A，B，C三种抗生素的滤纸片均匀置于该平板上的不同位置，培养一段时间后，含A的滤纸片周围出现透明圈，说明该致病菌对抗生素A_______（填“敏感”或“不敏感”）；含B的滤纸片周围没有出现透明圈，说明该致病菌对抗生素B_____（填“敏感”或“不敏感”）；含C滤纸片周围的透明圈比含A的小，且透明圈中出现了一个菌落，在排除杂菌污染的情况下，此菌落很可能是____________________________。(4)用来判断某选择培养基是否起到了选择分解纤维素的细菌作用，要设置的对照是（?? ）A．未接种的选择培养基B．未接种的牛肉膏蛋白胨培养基C．接种了的牛肉膏蛋白胨培养基D．接种了的选择培养基 
科目：高中生物
来源：学年湖南省高三10月联考生物试卷（解析版）
题型：综合题
以下两道题任选一道，答两题只记第一题的得分。Ⅰ【生物——选修模块1：生物技术实践】请分析回答下列问题：(1)无菌技术主要通过消毒和灭菌来避免杂菌的污染。常用的灭菌方法有____________灭菌、干热灭菌和________灭菌。(2)稀释涂布平板法分离纯化土壤中微生物的正确操作步骤是&&&&&&&&&&&&&&&&&& (&)①土壤取样& ②称取10 g土壤加入盛有90 mL无菌水的锥形瓶中制备土壤提取液& ③吸取0.1 mL溶液进行平板涂布 &④依次稀释至101、102、103、104、105、106、107稀释度A．①②③④&&&&&&&& B．①③②④&&&& C．①②④③&&&&&&&& D．①④②③(3)利用酵母菌将葡萄汁发酵后是否有酒精产生，可以用重铬酸钾来检验，在酸性条件下，重铬酸钾与酒精反应呈______色。在发酵过程中，随着酒精度的提高，发酵液逐渐呈现深红色，原因是______________________．(4)从野生酵母菌群中分离纯化酵母菌，最常使用的接种方法是____________和________________两种。酵母菌适合生活在偏酸性环境，而放线菌则适合生活在偏碱性环境中，分离二者所用的培养基称为____________。(5)在腐乳制作的过程中，起主要作用的微生物是____________。(6)腐乳制作过程中影响其风味和品质的因素有哪些&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& (&)①盐的用量& ②酒的种类和用量③发酵温度& ④发酵时间& ⑤香辛料的用量A．①②③④⑤&& B．①②③&& C．①②⑤&&&&&& D．③④&
科目：高中生物
来源：学年湖北省襄阳市高三3月调研考试理科综合试卷（生物部分）
题型：综合题
【生物——选修1：生物技术实践】（15分）低度的果酒、果醋具有一定的保健养生功能。右图是两位同学制果酒和果醋时使用的装置。同学甲用A（带盖的瓶子）装置制葡萄酒，在瓶中加入适量葡萄汁，发酵温度控制在18℃～25℃，每隔12 h左右将瓶盖拧松一次（注意不是打开瓶盖），之后再将瓶盖拧紧。当发酵产生酒精后，再将瓶盖打开，盖上一层纱布，温度控制在30℃～35℃，进行制果醋的发酵。同学乙用B装置，温度控制与甲相同，不同的是制果酒阶段充气口用夹子夹紧外，排气的橡胶管也用夹子夹住，并且每隔12 h左右松一松夹子放出多余的气体。制果醋阶段适时向充气口充气。经过20天左右，两位同学先后完成了自己的发酵制作。据此回答有关问题：（1）酵母菌与醋酸杆菌在结构上的最大区别是后者&&&&&。（2）同学甲在制酒阶段，每隔12 h左右就要将瓶盖拧松一次，但又不打开，这样做的目的是&&&&&。（3）用反应式表示出同学甲利用A装置制酒过程刚开始时发生的主要化学变化&&&&& 。（4）B装置中排气口要通过一个长而弯曲的胶管与瓶身相连，这样做的原因是&&&&& 。（5）制果酒时要将温度控制在18℃～25℃，而制果醋时要将温度控制在30℃～35℃，目的是&&&&&。（6）制作过程一般不需要额外添加酵母菌和醋酸菌即可完成。为了提高果酒品质也可以在果汁中加入人工培养的酵母菌。利用&&&&& 培养基可分离获得较为纯净的酵母菌种。&
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