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HE染色与免疫组织化学染色实验报告(DOC)
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DXY All Rights Reserved.猪肺静脉肌袖PGP9.5免疫组织化学和组织学特点研究
作者：[1]&[1]&单位：中国人民解放军总医院（301医院）[1]&&
文章号：W<font color=#3293&&
15:37:54&&
文字大小：
业已发现，90%以上的局灶性房颤起源于肺静脉，但目前肺静脉源性房颤的发病机制尚不十分明确。以往研究证实，肺静脉处存在由左心房延伸到肺静脉的“心肌袖”，且具有独立的电活动。而且，肺静脉肌袖组织在发育过程中有与心脏传导系统有相同的抗原表达。神经元特异性抗原-PGP9.5是一种古老而保守的蛋白质, 已发现多种动物心脏的窦房结、房室结、希氏束、左右束支和浦肯野纤维中PGP9.5表达阳性率显著高于邻近的心肌细胞。本实验应用HE染色和免疫组化染色的方法，观察猪肺静脉肌袖组织神经特异性抗原PGP9.5表达的情况，探讨肺静脉源性局灶性房颤发病的组织学基础。
关键词： 肺静脉，局灶性房颤，PGP9.5，苍白样细胞365医学网 转载请注明&摘&& 要： 目的： 检测猪肺静脉肌袖的PGP9.5抗原表达和组织学特点，初步探讨肺静脉源性房颤的发病机制。方法 健康家猪11只，取其肺静脉，10％中性福尔马林固定，石蜡切片行HE染色及S-P免疫组化染色。结果 (1) HE染色显示，4个左上肺静脉的肌袖组织中观察到染色浅淡的单个苍白样细胞；2个肺静脉内膜下层见条索状聚集分布的苍白样细胞群。(2)免疫组化显示，6个左上肺静脉、2个右上肺静脉的肌袖组织中存在PGP9.5（Protein Gene Product 9.5）免疫组化染色阳性的细胞和神经纤维。结论 通过HE染色方法，观察到肺静脉肌袖组织中存在与窦房结P细胞形态相似的苍白样细胞，以及与心室内膜下束支形态相似的苍白样细胞群。应用免疫组织化学方法，证明这些细胞与心脏传导系统有相同的PGP9.5抗原表达。&&&&& 业已发现，90％以上的局灶性房颤起源于肺静脉，但目前肺静脉源性房颤的发病机制尚不十分明确。以往研究证实，肺静脉处存在由左心房延伸到肺静脉的“心肌袖”，且具有独立的电活动。而且，肺静脉肌袖组织在发育过程中有与心脏传导系统有相同的抗原表达。神经元特异性抗原-PGP9.5是一种古老而保守的蛋白质, 已发现多种动物心脏的窦房结、房室结、希氏束、左右束支和浦肯野纤维中PGP9.5表达阳性率显著高于邻近的心肌细胞。本实验应用HE染色和免疫组化染色的方法，观察猪肺静脉肌袖组织神经特异性抗原PGP9.5表达的情况，探讨肺静脉源性局灶性房颤发病的组织学基础。&&&&& 1、材 料 和 方 法365医学网 转载请注明&&&&& 1.1标本的取材和制备365医学网 转载请注明健康家猪11只，雌雄不拘，年龄5个月，体重90kg。电击致死后迅速开胸取出心脏及肺组织，切去心尖部，用4％多聚甲醛磷酸盐缓冲液灌注心脏以排出残血。去除肺组织、心室、右心房和左心房大部分，保留完整的与左心房相连的肺静脉至远端分叉处。将组织块固定于10％中性福尔马林溶液中24h后，常规脱水、透明、浸蜡、包埋，沿血管走行作纵向和横向连续切片，厚5um，每隔5张取1张做HE染色，其间隔的5张做PGP9.5免疫组织化学染色。&&&&& 1.2免疫组化操作步骤365医学网 转载请注明采用S-P免疫组化染色方法检测PGP9.5抗原表达情况，严格按照试剂盒（美国Zymed HistostainTM 兔SP Kit免疫组化检测试剂盒，产品编号SP-9001）步骤操作。一抗，即兔多克隆抗体PGP9.5(英国 AFFINITI, 产品编号PG9500, 稀释度1：1000)。 365医学网 转载请注明&&&&& 用已知PGP9.5含量较高的正常猪脑组织作为阳性对照片，阴性对照用0.01mmol/L PBS代替一抗，其他步骤相同。&&&&& 2、结&&& 果365医学网 转载请注明&&&&& 2.1猪肺静脉的解剖特点365医学网 转载请注明&&&&& 11只健康家猪心脏，自左心房开口处纵行切开肺静脉，血管内壁光滑，淡红色肌袖组织自左心房向肺静脉呈指状延伸6-18mm，逐渐变薄透明如纸，其终止末端界限清晰（图1）。肌袖组织在左肺静脉，尤左上肺静脉延伸较长且较明显。&&&&&&&&&2.2猪肺静脉肌袖的组织学特点365医学网 转载请注明光镜下观察，左心房心肌直接延伸进入肺静脉，向肺静脉远端走行时逐渐变薄至消失（图1）。上肺静脉的下壁和下肺静脉的上壁与左心房连接处的心肌袖最厚（图2）。肺静脉组织分为内膜层、中层和外膜层，内膜层由血管内皮细胞、结缔组织和血管平滑肌组成；中层即通常所指的肌袖组织，由横纹清晰的心肌细胞组成，心肌细胞集合成束，呈环形、纵行和斜行排列，主要以纵行排列为主（图3）。在这些肌束间可见大小和形态不规则的间隙，间隙内可见纤维结缔组织、脂肪组织、丰富的毛细血管和滋养小动脉；外膜由纤维结缔组织和脂肪垫组成。&&&&&&&&&&& 图3肺静脉肌袖组织分为内膜层、中层和外膜层，中层较厚，心肌细胞&&&&&&&&&&&&&&& 集合成束，呈纵行 环形和斜行排列& HE×40365医学网 转载请注明&&&&& 在4个左上肺静脉的肌袖组织中，观察到单个染色浅淡的苍白样细胞（pale cells），形态与窦房结P细胞相似（图4）。在内膜下层还见呈条索状聚集分布的苍白样细胞群，其形态与心室内膜下的束支相似。苍白样细胞的形态不规则，呈圆形、椭圆形或多边形，胞浆染色浅淡，细胞核呈圆形或椭圆形位于细胞中央，染色质和核仁染色不明显（图5）。&&&&&&&&&&&&&&&&&图4染色浅淡的苍白样细胞单个出现（箭头所示）HE×200&&&&&&&&&&&&&& 图5位于内膜下层的染色浅淡、聚集出现的苍白细胞群（箭头所示）HE×400&&&& 2.3猪肺静脉的神经特异性抗原表达特点365医学网 转载请注明&&& 在6个左上肺静脉、2个右上肺静脉标本的肌袖细胞中，发现PGP9.5免疫组化染色阳性的细胞，PGP9.5反应阳性颗粒主要分布于胞浆中，经苏木素复染的细胞核呈圆形或椭圆形位于细胞中央，染色质和核仁不明显。这些细胞单个或聚集分布（图6，7）。同时观察到神经纤维和神经节呈PGP9.5免疫组化染色强阳性（图8）。&&&&&&&&&&&&&&& 图6 PGP9.5免疫组化染色阳性细胞孤立存在（箭头所示）免疫组化×400&&&&&&&&&&&&&& 图7 PGP9.5免疫组化阳性细胞聚集出现（箭头所示）免疫组化×400&&&&&&& 图8↓所指为神经纤维，▲是神经纤维附近PGP9.5染色阳性的细胞 免疫组化×200&&&&&& 讨&&&& 论365医学网 转载请注明&&& 房颤的发病机制研究是近年来心律失常领域的热点之一。四十年前，Moe等提出的多源子波折返学说成为房颤发病机制的主导理论。近年提出的大静脉尤其肺静脉起源的局灶性房颤理论进一步丰富和推动了房颤发病机制研究。现已证实，大静脉肌袖尤其是肺静脉肌袖的高频率激动（大于300次/分）在房颤的触发和维持中均有重要作用。即在早期，阵发性房颤的发生可能是肺静脉的高频率电活动反复触发心房所致，房颤频繁发作后，引起心房发生电重构、结构重构、收缩重构等继发性改变，即所谓房颤致房颤作用（atrial fibrillation begets atrial fibrillation）， 最终发展成慢性房颤。研究进一步发现，人类肺静脉与心脏传导系统的发育有相同的起源，而且胚胎期的肺静脉存在自律性。一部分肺静脉肌袖细胞在静息电位下可自发产生与起搏细胞相似的慢反应动作电位，具有缓慢的0期去极化和显著的4期去极化。其离子流特点与普通起搏细胞相似。但是，产生肺静脉肌袖细胞自律性电活动的组织细胞学基础尚不明确。365医学网 转载请注明&&&&& 猪的心脏结构和功能状态与人心脏非常相似，目前转基因猪心脏已开始应用于人心脏移植手术中，研究猪心脏可以为我们进一步研究人心脏提供很好的理论依据和实验经验。365医学网 转载请注明&&&&& PGP9.5是一种古老而保守的蛋白质，为标记心脏传导系统的特异性指标之一。它与任何神经递质转化酶和神经内分泌激素间无交叉反应，利用免疫组化定量分析的方法，已发现猪、牛、豚鼠等动物心脏的窦房结、房室结、希氏束、左右束支和浦肯野纤维中PGP9.5表达阳性率显著高于邻近的心肌细胞。365医学网 转载请注明&&&& 本实验首次应用PGP9.5免疫组化反应，发现猪肺静脉肌袖组织内存在的与心脏传导系统有相同抗原特性的特殊细胞。而且，PGP9.5阳性细胞常分布于滋养血管和PGP9.5组化染色呈强阳性的神经纤维和神经节附近（图8）。这些阳性细胞与心脏传导系统有相同的抗原表达，也许与心脏传导系统也有相同的电生理特性，可以产生自律性的电活动，从而构成了肺静脉源性房颤发病的组织细胞学基础。365医学网 转载请注明&&&&& 本实验观察到猪心脏上肺静脉肌袖组织的长度大于下肺静脉，上肺静脉的下壁和下肺静脉的上壁与左心房连接处的心肌袖最厚（图2）；心肌纤维集合成束，呈环行、纵行和斜行排列（图3），主要以纵行为主。同时在肌袖组织中，偶见两个核的心肌细胞，提示肺静脉肌袖组织中的心肌细胞较普通心肌细胞的电生理特点更加不稳定。365医学网 转载请注明&&&&& 常规HE染色中观察到的苍白样细胞（图4），形态与窦房结P细胞相似，胞浆染色浅，细胞核呈圆形或椭圆形位于细胞中央，染色质和核仁不明显，现多将这种苍白样细胞称为P样细胞。同时本实验观察到在肺静脉内膜下分布着与束支形态相似的苍白细胞群（图5）。束支细胞是快反应动作电位细胞，窦房结P细胞是慢反应动作电位细胞，而在电生理标测中记录到的是快速的肺静脉电位（大于300次/分）。故笔者推论当机体神经、内分泌等因素发生变化，或窦房结和心脏正常功能受到抑制时，P样细胞产生自律性电活动，由于肺静脉组织结构的特点，导致电活动在传导的过程中传导速度和方向的不均一性，容易形成微折返，表现为快速的肺静脉电位。快速肺静脉电位也有可能直接来自束支样的细胞。
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作者简介单位：中国人民解放军总医院（301医院）简介：王玉堂，男，日出生。解放军总医院南楼心血管一科主任兼心血管内科副主任、主任医师、教
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