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水稻内标准基因检测方法国际协同验证及四种转基因棉花品系特异性检测方法的研究.pdf 76页
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--------------------------Page1------------------------------上海交通大学硕士学位论文摘要水稻内标准基因检测方法的国际协同验证及四种转基因棉花品系特异性检测方法研究摘要为了保障全球各国转基因产品标识管理制度的顺利实施，针对转基因水稻检测方法中存在内标准基因检测方法不统一、转基因棉花品系特异性检测方法有待完善等问题，本文开展了相关针对性研究。1.适合转基因水稻定性定量PCR检测的内标准基因的国际协同验证：根据我们已经建立的水稻内标准基因SucrosePhosphateSynthase(SPS)定性定量PCR检测体系，优化定性定量PCR引物、探针浓度、序列和荧光标记位点，建立了稳定高效的SPS定性和定量PCR检测系统，并组织开展了在国际间实验室内标准基因检测方法的验证,该国际协同实验邀请国内外7个国家12个实验室分别对水稻内标准基因SPS进行验证。结果表明，SPS基因符合转基因产品检测需要的内标准基因的三个特征，即种间特异性，种内非特异性和恒定的低拷贝数。协同实验验证SPS定性PCR检测方法的检测下限能够到达0.1%。定量PCR检测方法的检测下限和定量下限至少为23个拷贝，并且具有良好的反应效率和线性相关系数。采用SPS定量PCR方法对8个水稻盲样分析的偏差在5.22%到26.52%之间。因此说明SPS适合作为水稻的内标准基因，适合用于对转基因水稻样品进行定性和定量PCR检测。I--------------------------Page2------------------------------上海交通大学硕士学位论文摘要2.根据我国已经批准商业化的转基因棉花Mon15985的5’端旁侧序列和正在批准商业化中的转基因棉花Mon88913的3’端旁侧序列，设计引物和探针，通过优化定性定量PCR检测方法的引物探针浓度，PCR检测体系，建立了转基因棉花Mon15985和Mon88913的品系特异性定性和定量PCR检测方法，结果证明了这两种转基因棉花品系特异性定性PCR检测方法具有高特异性，灵敏度达到0.05%，定量PCR检测方法的检测下限和定量下限分别约10和17个拷贝。在此基础上，我们在实验室内部组织了5人的协同实验验证，结果表明这两种转基因棉花的品系特异性定量PCR检测方法具有高PCR扩增效率，高线性相关系数的特点。并且对5个浓度梯度的转基因棉花混合样品的定量检测结果与其实际结果的偏差在25%范围内。结果表明所建立的两种转基因棉花品系特异性PCR检测方法完全适用于这两种转基因棉花及其衍生物的鉴定和定量分析。另外，我们根据已报道的两种转基因棉花Mon1445和Mon531的品系特异性检测方法和本研究建立的Mon15985和Mon88913品系特异性检测方法，建立四种转基因棉花（Mon88913，Mon15985，Mon1445和Mon531）复合品系特异性定性PCR检测方法。该复合定性PCR检测方法在转基因棉花检测中具有高特异性和低的检测下限（0.1%）等优点，提高了转基因棉花定性检测方法的效率。这些对于转基因产品标识管理制度的顺利实施提供了技术支撑。II--------------------------Page3------------------------------上海交通大学硕士学位论文摘要关键词:转基因生物，内标准基因，国际协同实验，水稻，棉花，品系特异性，定性PCR，定量PCR，复合PCRIII--------------------------Page4------------------------------上海交通大学硕士学位论文INTERNATIONALVALIDATIONOFRICEENDOGENOUSREFERENCEGENEDETECTIONSYSTEMSANDDEVELOPMENTOFPCRDETECTIONMETHODSOFFOURVARIETIESGENETICALLYMODIFIEDCOTTONSAbstractToensuretheimplementofgeneticallymodifiedorganisms(GMO)labelingregulationintheworldandperfectthedetectionmethodssystemforGMOs,twoaspectsthatrelatedtoGMOsidentificationandquantificationarecoveredinthisstudy.1.TheinternationalvalidationofSPSgeneasriceendogenousreferencegeneforqualitativeandquantitativePCRanalysis.End
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内标法与外标法的应用 [精华]
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meiler总结的很好，我主要用液相做西药的含量测定，都是用外标法，操作很简单，容易。去年还做了一个人体生物等效性试验，用液-质联用法，内标法。 试验中发现内标和外标的不同情况应用，感觉当仪器响应变化很大时，必须选用内标法，否则测定就没有意义了。cpuliuwei内标法是以前针对仪器的不稳定和进样的误差较大而设定的，其在克服仪器，环境因素方面有独到之处，但对于找到合适内标物仍是较大难题。这不用我多说.但对于现在仪器条件，有时内标不如外标，我从方法准确方面谈谈我的看法。在用外标法做含量测定时，药典采用多种限制条件来控制方法误差，如系统适应性，控制供试与对照浓度的差异范围等.系统适应性用来判定仪器能否达到稳定要求，一半waters和agllent的连续进样误差在1%以内，自动进样就更不用说了.达到要求时，其仪器部件特别是件测器表明已稳定，可以进样.通过控制供试与对照浓度的差异范围是通过减少标准曲线不完全过圆点造成的方法误差。1.一般外标法的步骤为对照供试各2份，每份2针，取平均计算.其误差为(4*0.2%(称量)+4*0.2%(稀释)+2%(仪器)*4)/2=4.8%.内标法为两份各一针，其误差为2*0.2%(称量)+2*0.2%(一次稀释)+0.2%(转移)+0.2%(二次稀释)+2*2%(仪器)=5.2%，如果仪器误差很小或在1%以内时，可以看出内标对外标的相对误差要大.内标相对外标还有一次内标物的转移和稀释所多造成的人为误差，且无法通过重复取平均来消除。其人为因素影响占较大成分.在仪器高度发达的今天，仪器的误差已经在人为误差之下.所以其为准确度不如外标的主要原因。2.在测定含量时，内标法还有内标物与供试杂质或杂峰重叠的风险，此时内标定量也不如外标准确。3.做体内药分时，在处理前加内标，也存在内标物与血桨结合，萃取损失等缺点，且同样与待测物一样，重复性不佳，也无法保证每次处理内标与待测物的回收比率一致，这时就不如外标的实迹值准确，因为在定方法时，其可能损失已经有回收率应大于……这个指标来控制。4.单个误差比较。在选取色谱条件时(尤其是气相)，其很多参数是依据待测物来定，在制定其检测条件时，其待测物的耐受性一般是要验证的，以保证其个人，仪器，实验室间的误差，在此条件下，其方法对于内标物，其耐受性一般均不会优于待测物，即其在仪器变化的影响，内标大于待测物，其内标就不如外标方法稳定。我做气相时就经常因温度对内标的挥发和聚集不利而导致校正因子误差很大，所以评判时要看其使用的对象，具体问题具体分析.xinzuan同意cpuliuwei观念，随着现代分析仪器的发展，原手动进样被定量环和自动进样取代，在HPLC中，进样量大，外标法已具有很好的进样精度。如果是原料药，或者制剂的成份不很多，用外标法即可，不一定非要用内标法。参与论坛讨论：
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利用实时定量PCR和2－△△CT法分析基因相对表达量
来源:生物谷
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利用实时定量PCR和2－△△CT法分析基因相对表达量　　
METHODS 25, 402C408 (2001)
Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 2－△△CT Method
Kenneth J. Livak* and Thomas D. Schmittgen&,1
*Applied Biosystems, Foster City, California 94404; and & Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy,
Washington State University, Pullman, Washington
现在最常用的两种分析实时定量PCR 实验数据的方法是绝对定量和相对定量。绝对定量通过标准曲线计算起始模板的拷贝数；相对定量方法则是比较经过处理的样品和未经处理的样品目标转录本之间的表达差异。2－△△CT方法是实时定量PCR 实验中分析基因表达相对变化的一种简便方法，即相对定量的一种简便方法。本文介绍了该方法的推导，假设及其应用。另外，在本文中我们还介绍了两种2－△△CT衍生方法的推导和应用，它们在实时定量 PCR 数据分析中可能会被用到。
关键词：反转录PCR 定量PCR 相对定量实时PCR Taqman
反转录 PCR （RT-PCR ）是基因表达定量非常有用的一种方法（1 - 3 ）。实时PCR 技术和RT-PCR 的结合产生了反转录定量 PCR 技术（4&,5 ）。实时定量 PCR 的数据分析方法有两种：绝对定量和相对定量。绝对定量一般通过定量标准曲线来确定我们所感兴趣的转录本的拷贝数；相对定量方法则是用来确定经过不同处理的样品目标转录本之间的表达差异或是目标转录本在不同时相的表达差异。
绝对定量通常在需要确定转录本绝对拷贝数的条件下使用。通过实时 PCR 进行绝对定量已有多篇报道（6 - 9 ），包括已发表的两篇研究论文（10,11 ）。在有些情况下，并不需要对转录本进行绝对定量，只需要给出相对基因表达差异即可。显然，我们说 X 基因在经过某种处理後表达量增加 2.5 倍比说该基因的表达从1000 拷贝/ 细胞增加到2500 拷贝/ 细胞更加直观。
用实时PCR 对基因表达进行相对定量分析需要特殊的公式、假设以及对这些假设的验证。2－△△CT方法可用于定量PCR 实验来计算基因表达的相对变化：2－△△CT公式的推导，以及实验设计，有效性评估在Applied Biosystems User Bulletin No.2（P/N4303859）中有介绍。用2－△△CT方法分析基因表达数据在文献中也有报道（5,6）。本文介绍了该方法的推导、假设以及应用。另外，本文还介绍了2－△△CT两种衍生方法的推导和应用，它们在实时定量PCR 数据分析中都可能被用到。
1. 2－△△CT方法
1.1. 2－△△CT方法的推导
PCR 指数扩增的公式是：
这里，Xn 是第 n 个循环後目标分子数，X0 是初始目标分子数，Ex 是目标分子扩增效率，n 是循环数，C T 代表目标扩增产物达到设定阈值所经历的循环数。
X T 是目标分子达到设定的阈值时的分子数。C T,X 是目标分子扩增达到阈值时的循环数。Kx 是一个常数。
对于内参反应而言，也有同样的公式：
用XT 除以RT 得到：
对于使用 Taqman 探针的实时扩增而言， XT 和 RT 的值由一系列因素决定：包括探针所带的荧光报导基团、探针序列对探针荧光特性的影响、探针的水解效率和纯度以及荧光阈值的设定。因此常数K 并不一定等于1 。
假设目标序列与内参序列扩增效率相同：
XN 代表经过均一化处理过的初始目标分子量；△CT表示目标基因和内标基因CT值的差异（CT,X－CT,R ）整理上式得：
最后用任一样本q 的XN 除以参照因子（calibrator, cb）的XN得到：
对于一个少于150bp 的扩增片断而言，如果 Mg2+ 浓度、引物都进行了适当的优化，扩增效率接近于1 。因此目标序列的量通过内均一化处理之后相对于参照因子而言就是
1.2. 2－△△CT方法的假设和应用
要使△△CT计算方法有效，目标序列和内参序列的扩增效率必须相等。看两个反应是否具有相同的扩增效率的方法是看他们模板浓度梯度稀释後扩增产物△CT如何变化。
图1 显示的是 cDNA 样品在 100 倍稀释范围内的实验结果。对于每一个稀释样本，都用GAPDH 和c-myc 特异的荧光探针及引物进行扩增。计算出c-myc 和 GAPDH 的平均CT值以及△CT值，通过cDNA 浓度梯度的log值对△CT值作图，如果所得直线斜率绝对值接近于0，说明目标基因和内标基因的扩增效率相同，就可以通过△△CT方法进行相对定量。在图1中，直线斜率是0.047，因而假设成立，△△CT方法可以用来分析数据。如果两个扩增反应效率不同，则需要通过定量标准曲线和绝对定量的方法来进行相对定量；或者也可以重新设计引物，优化反应条件使得目标序列和内参序列具有相同的扩增效率。
1.3. 2－△△CT内标和参照因子的选择
使用内标基因的目的是为了对加入到反转录反应中的RNA 进行均一化处理。标准的看家基因一般都可被用作内标基因。适合于实时 PCR 反应内标基因包括GAPDH，β -actin，β2-microglobulin 以及rRNA 。当然，其它的看家基因也同样能被用作内标。我们推荐在应用某一基因作为内标之前首先确证该基因的表达不会受实验处理的影响。验证实验处理是否对内标基因表达产生影响的方法在2.2 部分有描述。
2－△△CT方法中参照因子的选择决定于基因表达定量实验的类型。最简单的设计就是把未经处理的样品作为参照因子（calibrator ）。经内标基因均一化处理後，通过方法计算，目标基因表达差异通过经过处理的样本相对于未经处理的样本的倍数来表示。对于未经处理的参照样，△△CT=0，而20=1。所以根据定义，未处理样本的倍数变化为1 。而对于那些经过处理的样本，相对于参考因子基因表达的倍数为2－△△CT。同样的分析也可用于不同时相的基因表达差异，在这种情况下，一般选0 时刻的样本作为参照因子。
有些情况下，并不是比较不同处理样本基因表达差异。例如，有的是想看某一器官中特定 mRNA 的表达。在这种情况下，参照因子可能是另一器官中该 mRNA 的表达。表1显示了大脑和肾脏总RNA 中c-myc 和GAPDH 转录本的CT 值。在这一个例子中，大脑被人为的选择为参照因子，通过计算得到肾脏c-myc 表达量经GAPDH 校正後相对于大脑的表达量的结果。尽管相对定量方法可用于这种组织之间的比较，但结果的生物学解释是相当复杂的。不同种类细胞中目标和参照转录本单一的相对量变化可能在任何特定的组织中都存在。
1.4. 2－△△CT方法的数据分析
实时定量PCR所得到CT值可以很容易的输出到表格程序如Microsoft Excel中去。为了显示数据分析过程，我们在这里给出了一个基因表达定量的实验数据和样本列表。通过β-actin 均一化处理，我们对目标基因fos-glo-myc 的表达变化进行了监测。在8h 的时间范围内，在每一时间点都取3 个重复样本，每一样本在cDNA 合成之後都做定量PCR ，数据分析用到了公式9，即：
Time x 表示任意时间点，Time 0表示经β -actin 校正后1 倍量的目标基因表达。
0 时刻目标基因和内标基因的平均CT（见图2 第8 栏）被用于公式9 中。通过公式9 计算出每一个样本目标基因表达通过β -actin 均一化处理後相对于0 时刻的倍数（见图2 第9 栏）。平均SD，CV 由每一个时间点所取的三个重复样求得。用这种分析方法，在0 时刻的平均倍数变化接近于1。我们发现通过检测在 0 时刻平均倍数变化是否为1 可以很方便的验证三个重复样品之间是否有错误或者误差。如果得到的结果与1偏差很大，则表明存在计算错误或者是很高的实验误差。
在前面的例子中，在每一时间点上分别取了三个独立的 RNA 样本进行了分析。因此对每一个样本分别处理，通过计算後取结果的平均值就非常重要。如果是同一样本进行 PCR 扩增的重复，这就需要首先求出平均CT，然後再进行 计算。怎么样计算平均值就要看目标基因和内参基因是在同一个管子中扩增还是在不同的管子中扩增。表 1 给出了目标基因（c- myc ）和内参基因（GAPDH ）在不同管中扩增的实验数据。在这里不应该把任一单个的 c-myc 管子和 GAPDH 管子作比较，而应该分别计算出 c-myc 和 GAPDH 的平均CT 来计算△CT 。重复实验中CT值的估计偏差通过标准的指数计算转化成最後结果中相对量的变化。但其中的一个难点是 CT值与相应的拷贝数成指数关系（见第4 部分），因此，在最後的计算中，的误差通过△△CT 加上标准偏差和△△CT 减去标准偏差来评估，这就使得求得的数值相对于平均值呈不对称分布。不对称分布是因为结果经指数处理後转化成量的线性比较造成的。
通过不同荧光染料标记的探针，我们可以在同一管中同时扩增目标序列和内标序列。表2 给出了目标基因（c- myc）和内标基因（GAPDH）在同一管中扩增的实验数据。对于任意一个管子，目标基因（c- myc）和内参基因（GAPDH）扩增时加入的cDNA 量都是一样多的，所以可以分别对每个管子计算△CT 值，这些值取平均后再进行计算。在这里估计误差值也是一个不对称的范围，反映了误差经指数处理转化为线性差异。
在表1 和表2 中，估计误差在从△CT 到△△CT 的计算中未见有增加，这是因为我们把参照基因和检测基因的误差都显示出来了。我们把△CT，cb 当作一个人为设定的常数来减去，得到△△CT 。这样得到的结果就与图 2 所显示的在求平均之前对不同重复样本分别通过各自的CT 值求实& 所得结果 相当。另一种方法是将参照基因当作没有任何误差的1倍的量，在这种情况下，平均△CT,cb 的误差值被引入到每一样本的△△CT中。在表1中，肾脏中△△CT 变成- 2.50±0.20 而经过校正的c-myc 量是5.6 倍，范围从4.9 到 5.6 。而在大脑中的结果是没有误差的1倍。
2. 2－△Cf方法
2.1. 2－△Cf方法的推导
通过内标RNA 可以对加入 RNA 的量的差异进行校正。2－△△CT方法的数据分析的一个特点就是能够利用实时PCR 实验的一部分数据来完成这种校正。在其它的方法不能定量初始 RNA 量的时候：例如，在能得到的 RNA 量非常有限的时候或者需要处理高通量的样品的时候，这一方法的优势就格外明显。当然我们也可以利用PCR 实验以外的方法来完成这种校正。最常用的一种方法就是用紫外吸收来确定用于cDNA 合成的RNA 量，然後将相同的RNA 反转录产生的cDNA 用于PCR 定量反应。这种外标法校正的一个应用例子就是研究某种实验处理是否影响内标基因的表达。在这里，目标基因和内标合二为一。在这个例子中，公式[2] 不被公式[3] 除，公式[5 ]变成：
任一样品X0,q 除以参照品X0,cb 得：
在这里△ C'T=CT,q-CT,cb 。△C’T与前面计算中用的△CT（用目标基因CT值减去参照基因CT值）相互区别。
就象在1.1部分所描述的，如果条件优化较好，效率接近于1，内标相对于参照因子为：
2.2. 2－△Cf方法的应用
2－△CT'方法的一个应用就是确定实验处理对某一候选内标基因的影响。为了显示这一过程，我们做了血清饥饿/ 诱导实验（7） 。血清饥饿/ 诱导是研究某些 mRNA 降解的常用方法（8）。然而，血清可能影响一些基因的表达包括标准的看家基因的表达。
在24-h 血清饥饿培养之後，在NIH 3T3 细胞中加入15% 血清诱导基因表达。从细胞中提取Poly(A)+ RNA ，并将之反转录成cDNA 。利用SYBR Green 通过实时定量PCR 检测GAPDH ，β 2 -microglobulin cDNA 的量。GAPDH 和β2 -microglobulin 各自的相对量通过2－△CT'公式求得。细胞处理对于GAPDH 的基因表达有明显影响，但对β2 -microglobulin 没有什么影响。因此β2 -microglobulin 很适合做血清刺激定量实验的内标，而GAPDH并不适合。这一例子向大家展示了在只研究一个基因的时候怎么用2－△CT'的方法分析基因相对表达数据。
3. 实时PCR 数据的统计学分析
实时PCR 最终分析的是阈值循环或CT。
CT值通过 PCR 信号的对数值和循环数来确定。因此CT值是一个指数而非线性概念。因此，在任何统计分析中都不要用原始的CT值来表示结果。正如我们在前文中所描述的一样，PCR 相对量通常和内标和参照样本一起计算而很少直接用CT值来表示，除非我们想检验重复样本之间的差别。为了向大家显示这一点，我们用SYBR Green 通过real-time PCR 来检测相同cDNA 的96 个重复反应。所有反应组分在同一管中混好後分装到 96 个管中，做实时 PCR 分析，得到了每一个样本的 C T 值。为了比较样品间变化，计算了96 个样本的平均±SD，如果通过原始CT值计算，平均 ±SD 是20.00±0.193，CV 为0.971% 。但是如果把原始CT 值用2 -CT 转化成线性形式，平均±SD是9.08 × 10-7 ±1.33 × 10-7，CV 为13.5 %。从这个简单的例子我们可以看出，通过原始CT值来反映变化是错误的，应该避免。用2－CT 将单个数据转化成线性形式来说明重复样本之间的变化和差异更准确可靠。
实时定量PCR 实验设计和数据分析可以采用相对定量和绝对定量两种方法，研究人员在设计实时定量PCR 实验分析基因表达的时候首先要问的一个问题就是：数据最後会以一个什么样的形式得到。如果需要知道绝对的拷贝数，就必须用绝对定量的方法，否则只需要给出基因表达相对量就足够了。相对定量可能比绝对定量要更容易一些，因为它不需要作标准曲线。
本文所给出的公式对于每个用相对定量的方法分析基因表达差异的研究人员都足够了。下面，我们总结一下实验设计和评估中的一些重要步骤：
选择一个内标基因。
确定内标的有效性，确保它不会受到实验处理的影响。
通过PCR 扩增目标基因和内标基因RNA 或cDNA 的一系列梯度稀释模板确保它们的扩增效率相同。
最後通过2－△CT 计算将统计数据转化成线性形式而不是原始CT值。
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