荧光定量PCR问题疑难解答（一）；Q：1.这两天我做标准曲线，线性关系还行，R平方；A：曲线不光滑有时跟染料的量相关，可以加大看看，；1.PCR反应效率差：引物，试剂PCR条件的原因；做realtime-pcr优化体系很重要，你的扩；模板提取方法需要改进；3.样品稀释不准确：；正常情况10倍比稀释时，前后是相差3.32个循环；Q：荧光定量PCR的灵敏度；A：
荧光定量PCR问题疑难解答（一）
Q：1. 这两天我做标准曲线，线性关系还行，R平方0.998。但是扩增效率只有80%，另外扩增曲线也不是太光滑。2.我用SYBR作为荧光染料，样品的荧光强度也挺低的，只有100-200左右。
A：曲线不光滑有时跟染料的量相关，可以加大看看，或者就是扩增产物太少了。
1. PCR反应效率差：引物，试剂PCR条件的原因。
做realtime-pcr优化体系很重要，你的扩增效率低。可以增加Mg离子的浓度，如果其他条件都好了，还不行，那就是引物的原因，那你就只能重新设计引物了。
2. PCR中混入影响反应的物质：
模板提取方法需要改进
3. 样品稀释不准确：
正常情况10倍比稀释时，前后是相差3.32个循环。
这很重要，做标准曲线很多不好的时候，很多都是倍比稀释的问题，
Q：荧光定量PCR的灵敏度
A：对于染料法的荧光定量来说，Ct值在13~30之间比较准确，30~33之间需要再次确认，在以上范围内的置信度比较差。
Q：标准曲线要重复两三次吗?
A：没有人说做定量PCR标准曲线要重复两三次，只是用来做标准曲线的梯度点最好不要少于4个，否则标准曲线准确性不高。
Q：关于荧光定量标准曲线的制作
A：一般的仪器虽然声称能进行单拷贝检测，但如果不是特别设计的体系，很难做到100拷贝以下的准确定量，一般用来做标准曲线的最小浓度为1000拷贝，再往下可靠性就降低了，这不是稀释或其他什么问题，而是本身你选作标准曲线的浓度以及定量浓度最好不要低于1000拷贝，如果再低一点，100拷贝也勉强可以接受，否则即使你做出来，认可度也不会太高。
Q：溶解曲线高矮
A：Tm值相同，而峰高低有差异是表达丰度不同，同样的扩增产物也会出现Tm值有微小差异，一般差异在1度以内都可以接受。融解曲线的纵坐标表示荧光信号对温度的一阶负导数。
Q：定量PCR没有扩增
A：把定量PCR的产物跑个电泳，看看有无产物，如果电泳有条带，说明PCR是成功的，只是荧光信号没有读取到，这时要调整染料或探针的浓度（看你是染料法还是探针法）；如果电泳没有条带，那么还要在定量PCR仪上优化实验条件。虽然你在普通PCR仪上优化过条件，但换了定量PCR仪，由于两台仪器的升降温速度及温度精密度等指标存在差异，同样的条件做不出PCR也是可能的。
由于很多因素的影响，扩增子的溶解温度会有一定变异。溶解温度会受特殊缓冲液的pH值，所用Taq聚合酶，SG和MgCl2浓度和其他因素的影响。要做溶解曲线的对比你首先要确保所用的条件相同。
Q：SG的稳定性如何？
1周到3个月，这取
A：只要不进行稀释，SG是非常稳定的。一旦稀释，可以保存
决于冻融次数，推荐配置成一定浓度的贮存液，用时现用现配稀释液。
为优化SG反应，有必要在所有的常规步骤来确定，优化扩增反应的条件（合适的MgCl2、dNTP和Taq酶浓度等）。结果应该在凝胶电泳上有唯一的条带。
SG分析的优化主要包括以下4个因素：
a) SG 浓度
b) 引物浓度
c) MgCl2浓度
d) 温度和反应次数
推荐的SG终浓度变动范围是1：0000。经常用到的浓度范围是1：1000。引物浓度的优化应该测试不同浓度的正向和反向引物。引物浓度的范围应该是50nM到300nM，然而，也有例外的情况。
Q：荧光定量污染解决办法
A：几个月前我也有跟你一样的遭遇，当时跳楼的心都有。后来美国来人给培训，按照他们的要求，污染果真就给控制了，两个月来一直还很好。以下的经验希望对你有用。
1. 配反应体系和加模板要在不同的屋子进行；
2. 配体系的屋子准备一件干净的白大衣，每次进去都要记得换白大衣，至少要把别的屋子穿的白大衣脱掉；
3. 分装好体系以后把反应板/条放在一个有盖的干净的托盘中端到加样的房间；
4. 配体系戴的手套可以带到加样的房间，反过来不可；
5. PCR完毕后，反应产物拿到别的屋子扔掉；
6. 最重要的就是不要把DNA带到配体系的屋子，以上几点也都是为了这一目的。
Q：荧光定量real-timePCR重复性问题
1ul，而是稀释10倍左右然后加10ul，这样有助于改善重
A：建议不要只加
如果你测的是拷贝数，重复性不好是很难避免的。我感觉用SYBR green作realtime的误差还是比较大的，它的优势在于灵敏度高，但如果想精确定量，还是比较困难的，只好重复很多次，或者多花钱买标记的引物，那个特异性最好。
Q：各位高手，今天第一次做完8个基因的相对荧光定量（ddct法），扩增时忘了做融解曲线了，现在是不是没法再做融解曲线了？（ABI7500）对于每个基因都作了NTC对照，结果显示NTC无扩增，这样能否说明引物设计得还可以，没有引物二聚体的产生？至于是否有非特异性产物，就必须得做融解曲线了？请帮忙指教一下啊
A：把你的定量PCR产物重新作融解曲线，只是新建立一个反应，反应条件按照融解曲线的条件设定就可以了，没必要重新作定量。Ct值25-29，融解曲线单峰；ntc无CT值，融解曲线无峰，就不用电泳了，可以肯定。模板量增加10倍，Ct值减小3.32Cycles。
Q：荧光阈值高，怎么改进？
A：阈值取决于基线，基线是3~13cycles左右的荧光信号值标准偏差10倍，可能是背景高，把模板纯化一下看看。要调整一下你的基线的起止循环数。一般开始的循环为2或3，中止循环为一次试验最早起峰的Ct-3，即如果一条曲线在第13个循环就已经起峰了，那么基线的中止循环可以设置为13-3=10。如果你的体系不存在问题，就可能是你的那次试验模板浓度较高，起峰早，导致的阈值线过高。
Q：荧光定量PCR检测灵敏度和线性范围的关系
A：一般大家认为的检测灵敏度即检测下限，可以理解为能检测到和准确定量的最低浓度(拷贝数)，而线性范围为能够检测的区间，即可以检测及分辨的最低浓度到最高浓度的数量级。但两者都与荧光定量PCR仪器及试剂体系相关。
Q：real time PCR CT值一般在多少后认为模板没扩增？
A：当进入对数期的循环数大于35个时，RealTime RT-PCR检测无效，基因没有表达；当进入对数的循环数在32-35个循环时，需要有至少3个重复才能判断是否能检测到基因的表达。
Q：正常情况NTC是不应该出现CT值的吗？
A：如果是探针法，应该没有Ct值，所谓的没有，也是针对不同算法而言的。NTC一般没有明显的指数扩增，所以一般软件不计算Ct。
如果是染料法，可能在30个循环后有微弱起峰，并且软件计算出Ct值，这时还要观察溶解曲线，看扩增产物是否是引物二聚体。大多情况是二聚体，这时也可以优化条件，比如提高退火温度等。
如果是探针法，阴性对照起峰肯定是污染，如果是染料法，还要看溶解曲线：如果溶解曲线的Tm值在80度以下，那么很可能是引物二聚体；如果溶解曲线是双峰或更多峰，其中有与加模板后的扩增产物的Tm值相同的峰，那么就意味着存在污染。
Q：无结果，而用产物跑电泳条带很清楚，什么问题？
A：我也出现过此情况，后来发现是因为加样的时间太长了，荧光染料暴露时间太长了，荧光基团淬灭了，出现上述问题还有一种情况，那就是荧光PCR仪的荧光采取信号值太低，有时也不稳定。 如果你使用探针法，有荧光信号而没有求出Ct值，那么可能你的探针浓度有问题，可能太高或者太低了，可能改变探针浓度看看。
Q：最佳荧光采集温度
A：采集荧光的时机不是决定于温度，而是决定于采用的方法。
如果采用染料法，一般要在延伸阶段的末点进行检测，而72度延伸的效率最高，所以采用染料法时大多在72度检测。如果扩增产物中存在引物二聚体，也有采用更高的读板温度，比如76度、80度等，这时的读板温度与引物二聚体的Tm值相关。
如果采用TaqMan探针法，由于TaqMan探针是累积荧光，理论上说在任何步骤检测都可以，但目前TaqMan大多采用两步法，所以在退火的末点进行检测即可。
如果采用分子信标的方法，就要在退火的末点进行检测。
FRET探针法，要在退火时进行荧光检测。
Q：标准曲线的讨论
A：有一点可以告诉你：样品浓度太高，beta-actin都是很高的，要漂亮就稀释1000倍后再做。浓度高，很容易导致污染。而且第一二个梯度没有分开啊。标准曲线的落点局限在15个循环以前，那样你得到的反应有效线性范围太窄，就是说要很高浓度的样品才适用你这标准曲线。
Q：定量PCR中，质粒作为标准分子为何要线性化
A：因为你要检测的目的基因如果不出意外的话，应该是线性的吧，而你用来定标准曲线的目的基因确是连接在环状的质粒上的。我想单从变性和复性的难易上就会有很大的区别，当然会对引物的结合等各方面造成影响，何况环状的空间构象和线性的空间构象上的差异了。
做标准曲线时的基本原则之一就是要尽量的模仿需要定量的基因所在的自然条件，所以说，如果做标准曲线时你可以有条件做到用和你要检测的基因一样的标准品做标准曲线的话，就不要选择把一段基因克隆到质粒上。但是一般情况下是很难做到的。楼上说的没有酶切效果
还行，那只是还行。荧光定量本来就是很容易受到很多因素影响的实验，当然是要求严点好了，当然如果你检测的基因本身就是环状的，那当然不用线性化了，那样反而不好了！
线性化比较麻烦：首先要酶切，保证完全酶切，才能全部线性化。然后要回收，质粒酶切后再回收容易被破坏，而且回收率也不是很高。第三，线性化的质粒不容易保存，相对于环状质粒来说。所以，如果有实验证据证明不线性化的质粒可以用，那就可以省去很多事情了。
Fig. 6 also shows the efficiency of the PCR reaction is not altered by using circular
plasmid DNA in place of linearised plasmid DNA.线形化与环状质粒比较文章
评论：这篇文章用这个质粒对线性化和非线性化做了比较，从实验结果看线性化并没有对标准曲线产生任何改变。但是这篇文章只是摆出了试验结果，并没有从原理上分析这个实验结果的原因，因此线性化对于标准曲线的作用并不能以这篇文章的结果来外推。就是说可能需要更多的实验结果，或者从原理上分析了这篇文章的结果，才能得出结论来说明，线性化确实对于所有,或大部分的质粒标准分子是不必要的。
荧光定量PCR问题疑难解答（二）
Q：realtime pcr不同基因之间的阈值(threshold)是不是要一样啊?
A：如果做标准曲线或者相对定量，建议阈值还是一样比较好。而且阈值一般要放置于扩增曲线的指数段，即荧光数据对数坐标轴下的线性段。如果扩增曲线的效率接近，阈值线的位置对于定量结果的影响是微乎其微的。
Q：扩增曲线本底不断升高是什么原因?
A：我近期也遇到过这种现象，现在基本解决了，原因可能如下：
1、试剂质量差是主要原因，我用ABI的SYBR试剂做了一年从来没有遇到过类似问题，而近期换成东洋纺的试剂就出现了这个问题，所以最好不要贪便宜用小鬼子的试剂！
2、模板不纯是一个重要原因，我用东洋纺的试剂出现问题后，用ddH2O稀释10倍以上（一定不要用TE稀释，要不然可能会更差），问题基本解决；
3、如果模板稀释后基线还有一定的上升，结果分析时可以将基线从6以上设，避开初始的几个上升厉害的循环；
建议：要根本解决此问题请用质量可靠的试剂，便宜没好货！
Q：分子信标做的阴性对照，曲线为一条斜线，什么原因？
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荧光定量PCR详细流程和问题解析
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荧光定量PCR详细流程和问题解析
荧光定量PCR详细流程和问题解析 [转自 丁香园论坛]
前一段时间在百度中搜索，发现多年前写的一个关于荧光定量PCR技术的PPT有很多人看过或引用过，考虑到自己作荧光定量PCR工作已经了五年了，做的实验以及解决的问题远比五年前多了，因此利用过年的时间，写点荧光定量PCR实验中的一些注意事项及感想，无论对错，都是希望对相关的人员有些参考价值。
荧光定量PCR原理等大家都已经很熟了，我就不细说了，主要是写一些有人问过的事，希望写的内容是大家都关心的。
普通PCR与荧光定量PCR技术区别？
简单的讲PCR技术最早是用于扩增一段特异的PCR片段，用于克隆、测序等实验，后来也将其用于样本中特异的PCR片段有无或非很粗的相对定量，而荧光定量PCR技术则是为了测定样本中特异的PCR片段相对及绝对量，是一种测定特异的PCR片段含量的方式。如测定病人样本中病原体的含量、实验样本中某一特定的mRNA的含量等。
前些年有人讲过普通PCR后，通过电泳也可以进行定量，其实是将PCR产物的定量与PCR样本中模板定量相混了。近两年没有人再讲这类的话了。
Sybr Green、Taqman、Molecular beacon、LUX这些方法如何选择？
从实验成本来讲，Sybr Green是最好的，基本上就是普通PCR加上一点Sybr Green I 荧光染料即可，其信号强度也很好，还可以进行融解曲线分析等，但缺点是只能在一个反应管内进行一种PCR反应的检测，另一个问题是非特异性扩增会影响实验结果，当然也有一些技术解决这些问题，后面会讲到。对于研究人员来讲，如果需要检测的基因很多，而每个反应管中进行一种PCR反应的检测可以满足实验要求，则Sybr Green是最好的选择。
如果需要进行多通道实验，即在一个反应管中进行2种或以上的反应，则要选择其他的方法，最常用的是Taqman、Molecular beacon，这两种都是探针的方式，由于增加了探针的特异性，因此其扩增曲线反映的就是特异性产物的扩增曲线，不含有非特异性扩增的成分。因此商业用途的检测试剂盒大都采用这一技术，以减少非特异性产物造成错误结论的可能性。其缺点在于探针成本较高，有时设计的探针并不合适，有造成损失的可能性。并且要进行较多的实验条件的优化。这两种探针技术用于商业目的时都有专利问题，据说取得Molecular beacon的许可权的成本相对较低，但只是据说。
另一种值得一提的是LUX探针，它也可进行多通道实验，但它没有Taqman和Molecular beacon方法的增加探针特异性的功能，因此只能是一种折中的方案，如果不考虑多通道实验，则不如Sybr Green法
选择单通道实验还是多通道实验？
这是要根据实验需要来选择的，如果有一个、两个或是三个基因要进行比较，并用看家基因进行对照，可以考虑选择多通道实验。多通道实验的好处是可以消除样本加样的误差。但要克服的困难也比较多，一是条件的优化比较麻烦，即多种PCR反应以及探针要在同一个反应条件下进行，并且效率都要比较高，另一个困难是要求相互之间没有干扰，因为干扰会影响到实验结果。还有一个困难是当一个基因的模板数显著大于其他基因时，因为共用核苷酸等资源的原因，会让模板数少的基因的定量值变小或变为零。因此一般两通道的实验比较多些，即一个基因进行多样本比较，用看家基因进行对照。
可以看出，如果单通道实验可以解决问题，就不要选择多通道实验了。三个以上的基因进行比较时就最好用单通道。因为一般的仪器最多也只有四个通道，就是有更多的通道，实验条件的优化也是足够麻烦了。
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双通道实验时如何克服反应条件、干扰以及模板数差别很大等困难？
对于反应条件的优化，可通过两个单独实验的标准曲线来优化，主要是复性温度，可用PCR仪的温度梯度功能来选择，然后找到一个合适的复性温度。对于如何确定是否存在相互干扰，则要通过两个独立的单通道实验与双通道实验的结果进行比较，如果差别不大，则表明没有干扰。至于模板数差别很大的问题，可以通过降低引物浓度的方法来实现，即primer limited，在一般的PCR反应中，引物的浓度是足够高的，基本上可以将反应液中的核苷酸全部消耗尽，在优化引物浓度时，用不同的引物浓度进行实验，找到不影响反应的C(t)值的最低引物浓度。这样在实际反应中，模板数高的基因在引物耗尽后，反应液中仍然有足够的核苷酸等用于另一个基因的反应。
引物设计中的几个注意事项
1、 引物设计最好用相关的软件来进行设计，考虑引物自身回折、错配、引物二聚体、复性温度、产物变性温度等问题，其中产物的变性温度是大家不太关心的问题，但有些产物在一般的95度条件下不能充分解链，会严重影响实验结果。
2、 引物所设计的片断一定要有足够的特异性，选择好片段后，最好到互联网中进行相关的搜索，看在样本的基因组有没有相拟的基因以及假基因等，如果有，则可选择特异性更高的区域。
3、 在进行mRNA表达量的定量，可以在引物设计时考虑基因组的污染问题，即在引物设计时让两个引物跨一个内含子，这样基因组污染所造成的扩增可以区别出来，或因为片段过大而不能扩增
4、 由于mRNA表达量的定量有一个逆转录的过程，如果逆转录是用poly（T）作引物，则设计的片段尽量靠近poly（A），以免逆转录的效率影响到实验结果。如果用特异性引物进行逆转录，则要考虑引物区是否存在RNA二级结构的问题
5、 产物片段的大小：定量PCR一般产生片段都不大，不会超过600bp。Sybr Green法一般选择250-600bp，过大会影响到PCR扩增的效率，过小则很难通过融解曲线与引物二聚体分开，但并不是绝对的。Taqman法的扩增片段都很小，几十或是100多，这是其原理造成的。Molecular beacon法对片段大小的要求不高，只要不是太长即可。
Sybr Green法的实验策略：
实验可分为三个阶段，即实验条件的优化、预实验和正式实验。
一、 实验条件的优化阶段，这一阶段是最花时间的，
1、 要找到一个阳性的模板，可以是克隆有基因质粒、强阳性样本或纯化的PCR产物等。有了阳性的模板才能进行最基本的定量扩增实验，如果有普通PCR的实验条件，也可以此为基础进行实验。
2、 扩增出的产物要通过电泳方法确定其大小，以确认定量PCR扩增的产物是你的目的基因，有些用户就发生过优化了几天的条件才发现扩增片段的大小不对，不是自己想要的基因。当然，能测个序什么的最好。并通过融解曲线实验来确定产生的Tm值以及所用的变性温度是否已经足够，个别情况下会出来解键不充分的现象。
3、 有了基本的PCR条件后，要将阳性模板进行倍比稀释，一般用10倍稀释。将稀释的模板带上阴性对照，分成多份进行温度梯度实验，对复性温度进行优化，以找出复性温度范围，复性温度最好能满足以下条件：高中低模板浓度下PCR扩增效率都很高、阴性模板没有扩增。选择满足条件的中间温度，这样可以提高实验的稳定性，不会因为样本管在加热模块中的位置不同而影响实验结果。
4、 如果找不到合适的条件，如引物二聚体过多，可对引物浓度、Mg2+离子浓度、DMSO含量等进行优化，然后再进行复性温度梯度实验。其中Mg2+离子浓度、DMSO含量都会影响Tm值以及所用的变性温度。
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二、 预实验阶段
按照优化的条件对所需要分析的样本做一个没有重复的实验，每个样本做一个10倍和100倍稀释的实验，预实验的目的主要有两个，一是了解样本的模板浓度范围，如果有样本的模板浓度在标准曲线之外，如过高或过低，则可能要对标准曲线进行重新优化，当然，如果过高和过低不影响你的实验结论则可定为高于多少或低于多少，直接进行外推是不科学的。另一个目的看样本中是否有PCR抑制物的影响，如果每个样本的定量结果与其10及100倍稀释后的样本的结果相同，则表明没有抑制物的影响，如果不同，如原倍结果为零，而10及100倍稀释后的样本的结果为阳性，则表明样本中PCR抑制物浓度较高。可用其10及100倍稀释后的样本进行定量。
有几个用户发现过实验为阴性的样本在其10及100倍稀释后的样本为阳性的，也许有更多用户没有进行这样的实验，得到了错误的结论。因为样本RNA的提取试剂中经常有抑制PCR反应的物质，清洗不干净就会影响到定量PCR反应。
三、 正式实验阶段
然后就可以进行正式实验了，只需要将每个样本作三个或更多的重复即可以了。有抑制物的样本先进行稀释，计算浓度时不要忘记就行了。最后就可以进行实验结果分析了，个别样本中离群的数值可以删除。
Sybr Green法的注意事项
1、 最好按照上面提到策略进行实验，以免造成不必要重复实验，从而降低实验成本
2、 Sybr Green I一般是先将母液用DMSO进行稀释100倍，最终的使用浓度为分之一。可能不同的Sybr Green I母液的稀释倍数不同，可通过实验来证明，但高浓度的Sybr Green I肯定会影响PCR反应。另外用水稀释后的Sybr Green I保存的时间很短，一般1周后就不能用了。DMSO似乎反复冻融会影响性能，但原因不明。
3、 在对引物浓度、Mg2+离子浓度、DMSO含量等进行优化后仍得不到满意的结果，特别是引物二聚体很多时，可以考虑更换引物，因为引物成本低，而优化实验成本很高。
4、 当有少量引物二聚体影响荧光结果时，可以提高荧光读板时的温度来消除引物二聚体的影响，如将读板时的温度提高到82度，此时引物二聚体已经解链而产物没有解链。但引物二聚体浓度很高时会严重影响PCR反应，消除引物二聚体的影响也没有用。
5、 大家都知道进行绝对定量需要标准曲线，有些用户认为进行相对定量时就不需要标准曲线了，可以通过2ΔΔC（t）来计算，但这一计算是有条件的，即所有荧光定量PCR扩增的效率都接近于100%，可以通过实验来证明。但大多数用户并没有进行这样的实验就直接用2ΔΔC（t）来计算了。这是错误的，会得到错误结论。
6、 无论是使用自配的试剂还是用商业的荧光定量试剂盒，最好买够试剂，以免进行预实验或正式实验时没有试剂而必需采用其他试剂，由于不同试剂的缓冲液成份有较大差别，如有的试剂中含有DMSO及Mg2+离子等，可能会影响到实验结果，甚至要重新进行实验条件的优化。
7、 不要在管盖上写字，原因很明显，但有些用户习惯了写字，后来再擦掉，也会对实验有些影响。
8、 最好使用高质量的PCR管，低质量管的管间差可能会很大。
9、 每次实验一定要有阳性对照和阴性对照，以免出现问题时找不到原因。
[ 本帖最后由 森林木 于
12:02 编辑 ]
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10、 在样本很珍贵时可以采用对样本进行稀释的方式进行定量。只要浓度不是太低，理论来讲对稀释是不会影响实验结果的。
其他方法也可以采用类拟的策略，以节约成本，提高效率。
想到的内容就这些了，希望大家多批评指正。
反应体系的建立及优化
来源： 作者： 发布时间：
1. SG浓度：
　　终浓度1:5,000－1:100,000，一般为1:10,000—1:70,000
2. Primer浓度：
　　终浓度50nM－300nM
　　固定摸板浓度的梯度实验
　　不加摸板的对照实验（NTC）——有无非特异信号
　　熔解曲线的分析——是否单峰
　　建议使用HPLC纯化的引物
3. MgCl2浓度
　　降低MgCl2浓度以减少非特异性产物
　　最低可至1.5nM
　　同时做梯度实验和NTC对照
4. 反应温度和时间参数
　　反应温度参考所用酶的种类
　　退火温度使用温度梯度功能优化
　　反应时间与常规PCR类似，扩增片断一般为200－300bp
5. TaqMan探针
　　引物、探针设计：
　　首先选择探针序列
　　探针的Tm值为68－70度，长度不应超过30碱基
　　探针的5’端不应是G，G有可能会淬灭荧光素
　　引物应尽量靠近探针，扩增片断不超过400bp，通常为80－150bp
　　引物的Tm值为59－60度，长度约20碱基
　　避免引物、探针之间的二级结构
委托合成公司设计
　　使用辅助软件
　　确定反应参数
　　一般为两步法，94度10－20s
　　60度30－60s （Taq酶的5’外切酶活性在60度最强）
　　通过温度梯度优化退火温度
　　三步法， 72度45s
　　优化引物探针浓度
目标：最高的信号/背景比
　　最小的Ct值
　　引物浓度：50nM-900nM
　　探针浓度：50nM-250nM
　　通过多次实验确定各自的浓度和比例
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很好很强大 ++++++++
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太感激了，学到了很多。我进实验室已经三个月了，从一窍不通到现在一片混乱，日子太难过了。读了楼主的文章，虽然不能全懂，但是感觉心中有了几缕阳光。感谢！
这三个月简直是我目前人生中最难熬的一段日子。
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学习了，非常好，希望能深入讨论！
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谁能帮我详细的解释下面这句话是什么意思？
在进行mRNA表达量的定量，可以在引物设计时考虑基因组的污染问题，即在引物设计时让两个引物跨一个内含子，这样基因组污染所造成的扩增可以区别出来，或因为片段过大而不能扩增？？？&&
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回LS：不对的请指出哈
1、如果两个引物分别分布在两个外显子上，外显子之间存在一个或多个内含子，那么cDNA扩增得到的PCR产物当然小于来自基因组的PCR产物；另外Taq酶对PCR产物的合成长度是有一定限制的，并且在较短的延伸时间内也完成不了长片段的延伸。所以，如果来自基因组的PCR产物如果能顺利P出来，它的大小也是大于来自cDNA的，这在电泳时容易区分的；要么根本就P不出来的。
2、如果其中一个引物是由一个外显子尾部和下一个外显子头部拼接而成的话，那么此时的引物只能P出cDNA的产物，根本就不会把基因组的P出来。
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谢谢楼上的解答，基本明白了
不过还有一个问题：
如果要研究的目的片短只是一个外显子，这样的话是不是就不好办了，因为这样设计引物的时候要么只能将引物放在目的外显子内，要么只能放在内含子内}