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两种桃芽总RNA提取方法的比较研究
以‘曙光油桃’芽为试材,采用改良CTAB法、Trizol法进行总RNA提取,并通过凝胶电泳、核酸蛋白分析仪和Q - PCR检测所提取总RNA样品的质量.结果表明:改良CTAB法提取的RNA,经Q- PCR后扩增桃芽HK基因,可以得到与目的片段大小一致的条带,条带清晰,能满足基因表达分析等后续试验的要求；而Trizol法所提取的RNA,条带较弱,经Q-PCR后扩增桃树芽内HK基因,得不到与目的片段大小一致的条带,难以达到进一步试验的要求.
CHEN Xiu-de
GAO Dong-sheng
作者单位：
山东农业大学园艺科学与工程学院,作物生物学国家重点实验室,山东泰安271018
年，卷(期)：
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万方数据电子出版社下列关于生物实验的叙述正确的是( )A．观察DNA和RNA在细胞中的分布和低温诱导植物染色体数目加倍两个实验都需要用盐酸溶液B．观察花生子叶细胞中的脂肪颗粒和绿叶中色素的提取和分离两个实验都不需要显微镜C．检测生
下列关于生物实验的叙述正确的是(&&&& )
A．&观察DNA和RNA在细胞中的分布&和&低温诱导植物染色体数目加倍&两个实验都需要用盐酸溶液
B．&观察花生子叶细胞中的脂肪颗粒&和&绿叶中色素的提取和分离&两个实验都不需要显微镜
C．&检测生物组织中的还原糖&和&检测生物组织中的蛋白质&两个实验都需要水浴加热
D．&观察根尖分生组织细胞的有丝分裂&和&植物细胞的失水和吸水&两个实验都可以用洋葱的根尖分生区细胞
难度评价：
做题心得：
官方解析【考点】低温诱导染色体加倍实验；检测蛋白质的实验；DNA、RNA在细胞中的分布实验；检测还原糖的实验；检测脂肪的实验；观察细胞的有丝分裂．
【分析】1、&观察DNA和RNA在细胞中的分布&实验中，用质量分数为8%的盐酸改变细胞膜的通透性，加速染色剂进入细胞，将染色体上的DNA和蛋白质分离，便于染色剂与DNA结合．
2、斐林试剂是由甲液（质量浓度为0.1g/mL氢氧化钠溶液）和乙液（质量浓度为0.05 g/mL硫酸铜溶液）组成，用于鉴定还原糖，使用时要将甲液和乙液混合均匀后再加入含样品的试管中，且需水浴加热；双缩脲试剂由A液（质量浓度为0.1 g/mL氢氧化钠溶液）和B液（质量浓度为0.01 g/mL硫酸铜溶液）组成，用于鉴定蛋白质，使用时要先加A液后再加入B液．
3、低温诱导染色体数目加倍实验（1）低温诱导染色体数目加倍实验的原理：低温能抑制纺锤体的形成，使子染色体不能移向细胞两极，从而引起细胞内染色体数目加倍．（2）该实验的步骤为选材&固定&解离&漂洗&染色&制片．（3）该实验采用的试剂有卡诺氏液（固定）、改良苯酚品红染液（染色），体积分数为15%的盐酸溶液和体积分数为95%的酒精溶液（解离）．
【解答】解：A、&观察DNA和RNA在细胞中的分布&和&低温诱导植物染色体数目加倍&两个实验都需要用盐酸溶液，前者用盐酸进行水解，后者用盐酸和酒精组成解离液进行解离，A正确；
B、&观察花生子叶细胞中的脂肪颗粒&实验中需要用显微镜观察，B错误；
C、&检测生物组织中的蛋白质&的实验不需要水浴加热，C错误；
D、洋葱的根尖分生区细胞不成熟，没有大液泡，不可用于&植物细胞的失水和吸水&实验，D错误．
【点评】本题综合考查检测蛋白质实验、检测还原糖实验、观察细胞有丝分裂实验、观察细胞质壁分离及复原实验、低温诱导染色体数目加倍实验等，对于此类试题，需要考生注意的细节较多，如实验的原理、实验采用的试剂及试剂的作用、实验现象等，需要考生在平时的学习过程中注意积累．
若以人的口腔上皮细胞为材料进行&观察DNA和RNA在细胞中的分布&实验，最终可能观察到的结果是（　　）
A．细胞核呈绿色，细胞质呈红色
B．细胞核呈红色，细胞质呈绿色
C．仅细胞质呈红色
D．细胞基本不被染色&观察DNA和RNA在细胞中的分布&实验中，正确的实验步骤是（　　）
A．取口腔上皮细胞制片&水解&冲洗&染色&观察
B．取口腔上皮细胞制片&染色&冲洗&水解&观察
C．取口腔上皮细胞制片&水解&染色&冲洗&观察
D．取口腔上皮细胞制片&冲洗&水解&染色&观察①②③④⑤是使用操作显微镜的几个步骤．如图为显微镜观察中的两个视野，其中细胞甲为主要观察对象，由视野（1）到视野（2）时，操作过程的正确顺序是（　　）
①转动粗准焦螺旋&&&&&&& ②转动细准焦螺旋
③调节光圈&&&& ④转动转换器&&& ⑤移动玻片．
A．①②③④ B．①⑤③② C．⑤④③② D．⑤④①②
学优网-成就我的梦想。分子生物学研究方法（上）
——DNA、RNA及蛋白质操作技术
重点：1. DNA操作技术
2. 基因克隆的主要载体系统
难点：1. DNA操作技术
2. 基因克隆的主要载体系统
课时分配：8学时
重组DNA技术史上话
一、二十世纪分子生物学的三大成就
（1）20世纪40年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题；
（2）50年代提出了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制，解决了自我复制和世代交替问题；
（3） 50年代至60年代，相继提出了“中心法则”和操纵子学说，成功地破译了遗传密码，阐明了遗传信息的流动与表达机制。
二、基因工程
1、基因操作
gene manipulation
主要包括DNA分子的切割与连接、核酸分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、核酸序列分析以及基因的人工合成、定点突变和PCR扩增等，是分子生物学研究的核心技术。
2、基因工程
engineering
将外源DNA，通过具有复制能力的载体分子形成重组DNA分子，导入受体细胞，进行持久稳定的复制和表达，使受体细胞产生外源DNA或蛋白质。是核酸操作技术 的一部分。
基因的剪刀——限制性内切酶
基因的针线——DNA连接酶
基因的运输工具——载体
4 基本步骤
提取目的基因
目的基因与载体结合
将目的基因导入受体细胞
目的基因的检测和表达
三、DNA 重组技术
recombinant DNA technique
其核心是用限制性核酸内切酶和DNA连接酶对DNA分子进行体外切割与连接。
四、重组DNA技术史上的主要事件
1973 Cohen第一例成功的克隆实验
Genentech公司
世界上第一种基因工程蛋白药物
1982 第一个基因工程药物--重组人胰岛素在英、美获准使用
第一批转基因家畜（兔、猪和羊），中国
基因工程西红柿在美国上市
英国爱丁堡罗斯林研究所
中国获准加入人类基因组计划.负责测定人类基因组全部序列的1%
科学家公布人类基因组工作草图
公布人类基因组基本信息
五、生物技术工程：
基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程
第二节 DNA操作技术
一、DNA的分离，提取
1. 材料的选择：物种、组织的选择
2. 组织匀浆：细胞分散、破碎(EDTA:乙二胺四乙酸；Tris-Hcl: 三羟甲基氨基甲烷)
3. 破碎细胞： SDS表面活性剂
4. 除蛋白： 蛋白酶K、酚、氯仿抽提
5. 除RNA：
6. DNA回收：
乙醇、异丙醇沉淀
7. 质量鉴定：
（1） 琼脂糖凝胶电泳，常用溴化乙锭（EB）染色，紫外灯下观察和照相。 自从琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶被引入核酸研究以来，按相对分子质量大小分离DNA的凝胶电泳技术，已经发展成为一种分析重组DNA分子及蛋白质与核酸相互作用的重要手段，也是现在通用的许多分子生物学研究方法，如DNA分型、DNA核苷酸序
列分析、限制性内切酶片段分析以及限制性内切酶作图等的技术基础，受到科学界的高度重视。
原理： 带有电荷的分子在电场作用下的迁移速度，叫电泳的迁移率，它与电场强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比，在无反应活性的稳定的支持介质中，与分子的摩擦系数成反比。也就是说，电场强度越大，电泳分子所携带的净电荷数越多，分子越小，其迁移的速度越快，反之越慢。因此，根据分子大小的不同、构型或形状的差异以及所携带的净电荷数的多寡，便可以通过电泳将蛋白质或核酸分子混合物中的各种成分分离开来。
核酸带负电荷，放置在电场中，会向正极方向迁移。相同碱基数量的双链DNA分子几乎带有等量的净电荷，能以同样的速度向正极方向迁移。在一定电场强度下，电泳的迁移率取决于核酸分子大小和构型，可以通过电泳将核酸分子混合物中大小不同的片段分离开来。
琼脂糖是一种线性多糖聚合物，从红色海澡产物琼脂中提取出来。将琼脂糖粉末加热到熔点后冷却凝固便会形成良好的电泳介质，其密度由琼脂糖的浓度决定。
凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。反之，浓度降低，孔隙就增大，其分辨能力就随之减弱。
B.检测量：可达ug，ng级
C.检测信息：DNA的有无、 DNA的大小、 构象、 纯度
（2）聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用二甲苯青（F.F）染色，白光灯观察和照相
（3）两种方法比较
① 凝胶的分辨能力同凝胶的浓度和类型有关。
② 琼脂糖凝胶的分辨范围：0.2~50kb
③ 聚丙烯酰胺凝胶的分辨范围：1~1000bp
④ 溴化乙锭染色。
在凝胶电泳中，加入适量溴化乙锭染料对核酸分子进行染色，然后将电泳标本放置在紫外光下观察，可十分灵敏而快捷地检测出凝胶介质中DNA的谱带部位，即使每条DNA带中仅含有0.05ug的微量DNA，也可以被清晰地检测出来。溴化乙锭是一种具扁平分子的核酸染料，能插入到DNA或RNA分子的相邻碱基之间，并在300nm波长的紫外光照射下发出荧光。把含有DNA分子的凝胶浸泡在溴化乙锭的溶液中，或是将溴化乙锭直接加到DNA的凝胶介质中，此种染料便会在一切可能的部位与DNA分子结合，然而却不能与琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶相结合，因此，只有DNA分子能吸收溴化乙锭并发出荧光。在适当的染色条件下，荧光强度与DNA片段的大小或数量成正比。
8. 纯度检测：
紫外吸收法（260nm）
OD260 ---- 决定DNA的量
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RNA提取与纯化
掌握RNA提取的基本技术，了解RNA提取过程中的各种注意事项。
RNA提取是分子生物学实验中难度较大的实验技术。
RNA提取和DNA提取有类似的地方，因为它们都是核酸，都具有较好的水溶性。提取RNA首先破碎细胞，然后用提取液将RNA溶出，反复抽提去除蛋白质，加入乙醇沉淀RNA，将RNA沉淀溶解备用。那么如何区分DNA和RNA分开？DNA和RNA的溶解性不同，DNA在1M的盐溶液中具有最好的溶解度，而RNA在0.14M的盐溶液中具有最好的溶解度，所以可以利用它们的溶解性将它们进行区分。另外，RNA的分子量一般比较小，而DNA分子很大且和蛋白结合成复合体，所以DNA更容易随蛋白沉淀，而RNA具有较好的溶解性。
RNA提取的另一个关键问题就是如何抑制或去除环境中RNA酶。所有的玻璃、陶瓷和铁器具在180℃×6 h以上。所有的塑料器皿用0.1％的DEPC水37℃过夜浸泡，然后湿热灭菌80℃烘干备用。配制溶液所需的水也要用DEPC处理过的水，而配置Tris相关的缓冲液时Tris会与DEPC发生反应，应避免用DEPC处理。另外操作过程中应戴手套。
判断RNA 的质量主要有两个标准，一是纯度，二是完整性（是否被降解）。RNA的纯度可以通过分光光度计进行测定的A260／A280值来判断。RNA的完整性主要通过电泳分析来阐明，未降解的总RNA电泳时在凝胶中会出现18S和28SrRNA对应的条带（如果有DNA污染则在RNA后会发现基因组DNA对应的条带）。RNA电泳系统也要严格对RNA酶进行处理。如果用普通琼脂糖凝胶电泳，则用尽量减少电泳时间。
三、试剂与器材
（一）试剂
1、暗培养7天的小麦苗，用前光照诱导3 h
3、DEPC处理的ddH2O
4、RNA提取液：（每1000毫升中含有）
(最终浓度为50 mM )
6.03 克 (LiCl -H2O 9.06克)
(最终浓度为150 mM )
EDTA（0.5 M）
(最终浓度为5 mM )
(最终浓度为5 % )
Li Cl：33.92克Li Cl 溶于100 ml DEPC处理的ddH2O
6、 水饱和酚
8、 0.5M NaCl
9、 溴乙啶(EB)： 10mg/ml溴乙啶。 注意：该试剂具致癌作用，用时要小心。
10、点样缓冲液Loading buffer（10×）：0.25%溴酚蓝，40%甘油。
1、 分光光度计
2、 电泳仪
3、 台式离心机
4、 手提式紫外监测仪
5、 恒温水浴
6、 凝胶成像系统
四、操作步骤
1、取植物叶片1-3克，放在液氮中磨成粉末。(可以多研磨一些，然后分装，小量提取试剂量可减至1／10)
2、液氮挥发完之前，倒入含有10 毫升RNA提取液的离心管中，迅速反复倒置混匀，直至看不见任何团状物为止。
3、立即加入10毫升的等体积（酸性）酚/氯仿，剧烈（！）反复倒置混匀5至10min（如在震荡器上震荡，要确保混匀而不能仅仅是振动！）。
4、13000g×5min，吸管取上清（注意避免吸取界面上的蛋白）。
5、重复步骤3和4，三次左右（注意观察界面上白色物质）。
6、取上清，加入等体积的氯仿，反复倒置混匀2-5min。
7、13000g×5min。
8、取上清，加入1/3体积8 M 的 LiCl （即8 M LiCl应占最后体积的25%）， 沉淀RNA，4℃过夜。
9、离心13000g × 10 min。
10、弃上清,保留沉淀（此时应把RNA沉淀转入Eppendorf管中，以便于操作）, 加入70%无水乙醇+30% 0.5 M NaCl 的混合液0.5 毫升洗涤沉淀数分钟（和缓地反复倒置混匀），离心 （13000g × 2 min）。重复洗涤沉淀数次。
11、用70%乙醇再洗涤2次沉淀，去掉盐离子。
12、用枪头吸去残留的液体，真空干燥2min。
13、加入200 ul DEPC 处理过的水溶解RNA。
14、取用5 ul电泳检测RNA完整性,
用TEB 缓冲液, 200V× 20-30min。
15、取5 ul稀释40倍测定RNA纯度和浓度，A260 nm /A280 nm应在 2.0 左右。
16、将RNA 分装,放在-70℃长期保存备用.
辅助方案：试剂盒提取法（Trizol）
（一）试剂：
1.Ttizol Reagent
4.70%无水乙醇
（二）器材：
2、 离心机
（三）实验步骤
1、 称取小麦叶片50-100mg,于研钵中加液氮研磨成粉末，迅速转移到1.5ml离心管中。
2、 加入1 ml Trizol
Reagent，15～30℃×5min。
3、 加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15 sec，15～30℃×3min。
4、 冷冻离心12 000 rpm×15min。
5、 将上清液转移到另一个离心管中，加0.5ml预冷异丙醇,混匀 ，-20℃放置20min。
6、 冷冻离心12 000 rpm×10min。
7、 加入0.5ml 70% 乙醇洗RNA沉淀，悬浮，7500 rpm×2min，除去乙醇。
8、 加入30 ul DEPC 处理过的ddH2O溶解RNA。
RT-PCR扩增目的基因cDNA
学习从细胞或组织的RNA中用逆转录PCR扩增目的基因的技术及操作。
普通PCR方法可以以DNA为模板扩增基因，但真核生物的基因组中通常分为可转为mRNA的外显子和不转录的成mRNA的内含子，所以从染色体DNA用PCR方法扩增出的基因是内含子和外显子相间排列的DNA分子，不能用于基因工程的直接表达。如果用人工的方法把内含子去除，是极其烦琐费力的事。逆转录PCR利用逆转录病毒依赖于RNA的DNA逆转录合成酶，在反义引物或oligo（d T）的引导下合成mRNA互补的DNA（complemental DNA），再按普通的PCR的方法用两条引物以cDNA为模板，扩增出不含内含子的可编码
，，完整蛋白的基因。这一DNA的5和3端经改造可直接用于基因工程的表达，因此逆转录
PCR成为了目前获取目的基因的一条重要途径。
试剂与器材
1、 RNA模板
2、 cDNA引物
3、 反转录缓冲液
5、 AMV反转录酶
6、 RNA抑制剂（RNasin）
8、 10×PCR缓冲溶液
9、 引物（P1、P2）
1、PCR扩增仪
3、台式离心机
4、恒温水浴
5、紫外分析仪
6、微量移液器
一、RNA的反转录
1、在小管中依次加入
6 ul DEPC H2O
混合后,65℃×5 min(破坏二级结构).
2、 置于冰浴5 min.
3、在管中依次加入: (反应体系为20 ul)
RT buffer ( 5×)
dNTP ( 10mM)
Oligo T17A（G／C） （50-100 uM） 1 ul
AMV反转录酶
置于 42℃× 1 h。
4、70℃× 5 min（使酶失活，可省略）。
5、加入100ul ddH2O (从总RNA开始制备)或1000 ulddH2O（从mRNA开始制备）。
6、置于-20℃保存备用.
二、PCR扩增DNA
在灭菌的0.5ml PCR管中，依次加入
10×PCR buffer
Taq DNA聚合酶
加ddH2O 补足50μl ，混匀。
三、PCR产物的鉴定
取20ul PCR产物进行1.2%琼脂糖电泳分析。
实验十 质粒载体和外源DNA的连接反应
掌握DNA体外连接的基本技能，了解连接反应的注意事项。
DNA片段之间的连接是通过DNA连接酶的催化实现的。DNA连接酶催化具有平末端或互补粘性末端的DNA片段间相邻碱基通过3’,5’磷酸二酯键连接起来，该反为需能反应，通常需要加入ATP或NADH，DNA连接酶对粘性末端的连接效率要远高于对平末端的连接效率。在基因基因工程实验中，最常用的来源于T4噬菌体的T4DNA连接酶。对于平末端或互补的粘性末端可直接进行连接反应。一个片段是平末端，另一片段为粘性末端或两个片段都是粘性末端但不配对，则需要通过各种方式使其可一匹配或通过平末端进行连接。通常采用末端补平、加同聚物尾、加接头等方式是目的片段之间能够匹配。
进行连接反应时，为了减少片段的自连，通常要进行去磷酸化，去磷酸化可通过碱性磷酸酶完成。比如将目的片段和载体进行时通常要将载体去磷酸化，以减少载体的自连。同要进行连接反应也经常对目的片段进行磷酸化以增强目的片段的连接，在相邻碱基间如果没有磷酸在连接效率大幅下将，如果载体进行了去磷酸化，目的片段可进行磷酸化，以增强目的片段和载体的连接。
在连接反应中，目的DNA片段和载体的比例是一个关键问题，对于长度为1kb的片段和3kb的载体而言，通常目的片段和载体的比例设为2：1或3：1，如果目的片段越长该比例应再升高，因为主要考虑的是载体和目的片段之间的分子数的比例。反应体系中核酸的浓度也是一个重要问题，通常反应体系中反应物浓度应保持在25-100 ng / μl。
连接反应和其它酶不同，需要在较低的温度下进行，通常在12～16℃过夜，也可在4℃过夜连接，如果是平末端连接，可适当提高连接温度。除上述因素外，DNA样品的纯度、盐浓度等会影响连接效率。
三、试剂与器材
（一）试剂
1、目标DNA片段（实验九RT-PCR扩增产物）
2、载体（pGEMT-easy）
3、2 × ligation 缓冲液
4、T4 DNA连接酶
（二）器材
1、台式离心机
2、恒温水浴
3、微量移液器
四、操作步骤
1、取一个1.5ml离心管依次加入下列试剂:
2 × buffer：
pGEMT-easy：
目的片段：
T4连接酶：
2、 2000 rpm 离心30S，使反应体系充分混合。
3、4℃过夜连接。
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