上海应物所等实现原子力显微镜下DNA直读检测_检测,仪器,设备,纳米_技术前沿_中国化工仪器网
上海应物所等实现原子力显微镜下DNA直读检测
　　【中国化工仪器网 技术前沿】近日，中国科学院上海应用物理研究所物理生物学研究室与上海交通大学、南京邮电大学合作，基于DNA纳米技术发展了一系列DNA折纸结构并作为纳米力学成像探针，实现了原子力显微镜下对基因组DNA的直读检测和高分辨成像。相关结果发表于《自然-通讯》（Nature Communications38）。　　上海应物所等在DNA折纸纳米力学成像探针设计方面取得进展　　　　DNA折纸结构是利用DNA碱基互补配对原则，通过程序性设计将M13 DNA在上百条DNA短链的辅助下折叠成指定几何形状。上海应物所博士张宏陆等在研究员樊春海指导下，并与晁洁、师咏勇等合作，通过设计DNA折纸结构作为原子力显微镜的纳米力学成像探针，在单分子水平下实现了对DNA分子的特异性标记和单核苷酸变异性（SNP）的直读检测。　　　　相较于基于荧光成像的直读方法，这种新技术将分辨率提升一个数量级，可达到远超光学衍射极限的10纳米分辨。基于DNA纳米折纸结构设计的探针为原子力显微镜的图像获取提供了精确的标尺和丰富的选择，为遗传分析等生物学应用提供了新的工具。进一步，他们还将该方法与之前发展的纳米PCR和单倍型分析技术(Nature Nanotechnology )结合，实现了单分子水平的遗传样本单倍型分析。这种单分子水平的单倍型分析通量高，可靠性好，有望用于易感基因的发现、疾病相关基因的鉴定和药物设计等方面。　　　　编辑点评　　　　中国科学院上海应用物理研究所物理生物学研究室纳米力学成像探针，成功实现了原子力显微镜下对基因组DNA的直读检测和高分辨成像，有望用于易感基因的发现、疾病相关基因的鉴定和药物设计等方面　　　　（原标题：上海应物所等在DNA折纸纳米力学成像探针设计方面取得进展）
（来源：上海应用物理研究所）
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全国高教仪器设备展示会历经20余年的发展，成为高等教育 领域举办时间最长、规模最大、影响力最强的专业品牌& 原子力显微镜在DNA和蛋白质相互作用方面的研究进展
原子力显微镜在DNA和蛋白质相互作用方面的研究进展
摘 要：评述了原子力显微镜在研究DNA和蛋白质相互作用领域的应用进展。AFM可在空气和液体中对静态的DNA-protein复合体进行成像,也可在液体中实时观察DNA和protein的反应过程。而且,力模式AF
【题　名】原子力显微镜在DNA和蛋白质相互作用方面的研究进展
【作　者】王云起（综述） 廖问陶（综述） 蔡继业（审校）
【机　构】暨南大学生命科学技术学院化学系,广州510632
【刊　名】《生物医学工程学杂志》 2007年第24卷第5期,页
【关键词】原子力显微镜 DNA 蛋白质 相互作用 动力学
【文　摘】评述了原子力显微镜在研究DNA和蛋白质相互作用领域的应用进展。AFM可在空气和液体中对静态的DNA-protein复合体进行成像,也可在液体中实时观察DNA和protein的反应过程。而且,力模式AFM还可获得DNA和protein分子间作用力的信息。AFM已揭示了许多基因调控的机制,也必将在生命科学的研究中起到越来越重要的作用。
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原子力显微镜,DNA,蛋白质,相互作用,动力学
上一篇：暂无DNA原子力显微镜成象条件的研究
16:31:07& 来源：&
& &&摘　要:原子力显微镜(AFM)在空气中对DNA进行观察时,针尖很容易对其造成损伤,从而影响图象质量.为探索此问题的解决办法,本研究在空气、水和无水乙醇中对DNA进行成象,同时对针尖的结构进行了扫描电镜观察.取100&g/ml质粒pQE30水溶液20&l滴加在新鲜剥离的云母基底上,吸附1 min,用滤纸吸去基底上的多余残液,氮气吹干后在空气中成像;pQE30分别溶于去离子水和无水乙醇,质量浓度为100&g/ml,各取100&l加入液体池中成象.成象时均采用MultiMode AFM(Nanoscopea)的敲击模式,并记录力曲线.结果发现:在液体中DNA的图象分辨率优于在空气中,在无水乙醇中优于在水中;针尖与DNA样品间的相互作用力越大,成象的分辨率越低;多次使用后针尖磨损,分辨率降低.这一结果为选择DNA的理想AFM成象环境,研究生理条件下DNA的结构和功能提供了实验基础.
& &&原子力显微镜是具有原子级分辨率的新一代显微镜,在生命科学中,尤其在生命的遗传物质&DNA的精细结构研究中,得到了极大的关注.近年来,成功地获得了DNA、RNA以及DNA-蛋白质复合物结构图象[1~4]. AFM与传统的X射线衍射、核磁共振、旋光色散等方法相比,具有分辨率高、制样简单以及在保持生物活性条件下成像等优点.
& & 虽然AFM已经成功地获得了DNA的图象,但仍存在一些问题.针尖对样品的作用力很容易损伤柔软的生物组织,特别是在空气中,由于探针和样品分子表面有一层水膜,扫描时探针要穿透这层水膜,从而产生强大的毛细力易使柔软的生物大分子遭到损坏,影响图象的质量.人们尝试通过不同的途径来解决这一问题,在液体中成象受到了普遍的重视,这样可以减少针尖对样品的作用力.本研究探索了在空气、水和乙醇中DNA成象的比较,并对AFM针尖结构进行了扫描电镜观察,以求从成象环境和仪器本身来进行分析.
& & 1　材料与方法
& & 1. 1　材料
& & 质粒pQE30为QIAGEN公司的产品,是全长3462bp的双链环状DNA. pQE30在大肠杆菌JM105中复制,用QIAGEN Plasmid Midi Kit提取纯化,其A260/A280为1.85.
& & 1. 2　样品制备
& & 将pQE30分别溶于无菌去离子水和无水乙醇,使其终浓度为100&g/ml.取20&l pQE30水溶液,滴加到新鲜剥离的云母表面上,吸附1 min,用滤纸条沿液滴的边缘将残液吸去,氮气吹干,待观察.取100&l pQE30水溶液和乙醇溶液,分别加入液体池中,用原子力显微镜进行观察.
& & 1. 3　原子力显微镜观察
& & 三种样品成象所用的原子力显微镜型号为Digital Instrument公司生产的MultiModeAFMNanoscopea,扫描管为J型,成象模式为敲击模式(tapping mode).微悬臂的力常数k为0.12 N/m,测量前用紫外灯对其照射5 min进行消毒.图象在室温条件下获得,扫描速度为1.0~2.5 Hz.所有图象只采用Flatten Auto处理,以消除慢扫描方向上的低频噪音.成象同时记录力曲线,比较AFM针尖和样品间相互作用以及成象结果.
& & 1. 4　AFM针尖的扫描电镜观察
& & 分别取用过数十次和新的AFM的Si针尖各1个,由于其具有导电性,可在扫描电镜下直接成象,型号为Hitachi S520.
& & 2　结果与讨论
& & 在液体中对DNA成象需要加入一定浓度的二价阳离子,这是由于载体云母表面和DNA分子均带负电荷,相斥作用使DNA分子难以固定在云母片上而影响成像,二价阳离子起&搭桥&作用固定DNA分子,如图1所示.
& & 2. 1　不同成象环境DNA图象的比较
& & 质粒DNA一般存在线型、松弛型及超螺旋型三种拓扑结构[5].图2是在不同环境对pQE30DNA进行AFM观察的结果.由图2可见pQE30DNA分子呈松弛的环状结构,但环的直径有所不同;另一部分DNA分子呈颗粒状,这种形态的DNA为超螺旋DNA,但没有观察到明显的线型结构,一般在温度较高或被酶切断后,质粒才呈线状结构. DNA分子链的表观宽度在空气中为21~25nm(图2a),在水溶液中为18~22 nm(图2b),在乙醇中为15~19 nm(图2c).
& & 在空气中成象时,空气的相对湿度、基底表面和样品间的毛细作用力,针尖对DNA分子进行扫描成象时所施加的力导致DNA分子发生的弹性形变,都会影响其表观直径,降低DNA分子的成象质量.同时由于AFM针尖在空气中扫描时,会吸附水分子和粘附有机沉淀物,以及磨损等都会导致针尖曲率半径增加,使成象分辨率降低,如图3所示.另外, AFM针尖有它们本身的几何形状,成像时针尖的展宽效应不能绝对排除.
& & AFM扫描力曲线可以反应针尖和样品间相互作用的特性.针尖在乙醇中扫描时,DNA和针尖间横向作用力较小,如图4(a)所示.由于液层的作用,降低了扫描过程中的摩擦力,使针尖形变力与针尖&样品间吸引力保持平衡,从而提高了成象的稳定性和分辨率,如图2(c)所示.在水溶液中成象时,样品表面与针尖之间的横向作用力增加,针尖形变加大(图4b),但同空气相比(图4c)针尖所受的粘附力和针尖的弹性形变仍小得多.根据实验结果,得出针尖与样品表面间作用力大小顺序为:空气&水&乙醇;图象的质量的排序为:乙醇&水&空气.
& & 2.2　AFM针尖的扫描电镜观察
& & 如图3所示,新的AFM针尖尖端锐利,曲率半径小,而多次使用后的针尖受到磨损,尖端钝而不规则,侧面有污染物.原子力显微镜是通过针尖扫描样品表面获得信息成像的,其分辨率取决于探针针尖的尖锐程度.针尖磨损后,成像的分辨率就会大大降低.因此,在对样品成象时选用新的尖端曲率半径尽可能小的针尖有助于提高图象质量.
& & 3　结　论
& & (1)原子力显微镜在乙醇中对DNA进行成象,减少了AFM针尖和DNA间的相互作用,避免了针尖对DNA的损伤,改善了图象的质量,提高了成象的分辨率.
& & (2)在水溶液中,针尖与DNA样品间的作用受到静电作用力的影响,图象质量有所下降,但比在空气中的成象效果好.
& & (3)磨损的针尖将会降低图象质量,应避免使用.
& & (4) AFM合适成象环境的选择、高分辨率DNA图象的获得,将为进一步探讨DNA的结构、功能及其与生物大分子的相互作用奠定良好的基础.
& & 参考文献:
& & [1]KIRBY A R, GUNNING A P, MORRIS V J. Imaging po-lysaccharides by atomic force microscopy[J]. Biopolymers,):355-366.
& & [2]MASATO Tanigawa, TAKAO Okada, JASON H. Motion andenzymatic degradation of DNA in the atomic force microscope[J]. Analytica Chimica Acta, ):19-25.
& & [3]KASPER K, HERMANNK. DNA binding to mica correlateswith cationic radius: assay by atomic force microscopy[J].Ultramicroscopy, ): .
& & [4]HANSMAHG, REVENKO I, KIM K,et al. Atomic forcemicroscopy of long and short double-stranded, single&stranded and triple-stranded nucleic acids[J]. Nucleic AcidsRes, ): 13-720.
& & [5]汪新文,白春礼,朱传风,等. DNA原子力显微镜成象方法研究[J].生物物理学报,):538-542.
& & 本文作者：国立秋 &赵铁强 &董　申 &钟照华
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