组织与细胞化学；一、填空题：；体视学里是主要的填空题；二、名词解释；1、异染现象；染料离子以某种方式使它对所吸收的波长有所改变，因；2、诱发荧光和自发荧光；诱发荧光：；自发荧光：由于紫外线的照射，标本中的荧光物质吸收；3、原位杂交组织化学和免疫组织化学；原位杂交组织化学（Insituhybridiza；4、点计数（P116）；估计面积和面积分数的方法，称为点
组织与细胞化学
一、填空题：
体视学里是主要的填空题。
二、名词解释
1、异染现象
染料离子以某种方式使它对所吸收的波长有所改变，因而观察到被染的组织显示与该染料本身颜色不一样，此现象为异染现象。
2、诱发荧光和自发荧光
诱发荧光：
自发荧光：由于紫外线的照射，标本中的荧光物质吸收光能后，呈现出不同颜色的荧光，这是自发荧光。
3、原位杂交组织化学和免疫组织化学
原位杂交组织化学（In situ hybridization histochemistry，ISHH）是应用已知碱基顺序并带有标记物的核酸按碱基配对的原则进行特异性结合，形成杂交体，然后再应用与标记物相应的检测系统通过组织化学或免疫组织化学在核酸原有的位置进行细胞内定位。 免疫组织化学（immunohistochemistry）: 将化学反应中呈色反应与免疫学抗原抗体反应结合起来，用标记的特异性抗体（或抗原）对细胞及组织内抗原（或抗体）的分布进行组织或细胞内原位检测的一门技术。
4、点计数（P116）
估计面积和面积分数的方法，称为点计数。
5、形态计量术
形态计量术(morphometry)是运用数学和统计学原理对组织和细胞内各种成分的数量、体积、表面积等的相对值与绝对值的测量,其中以研究组织和细胞内某种结构的三维立体结构的研究称体视学(sterology)。
6、DAB系统
7、各向同性和各向异性
指物体的物理、化学等方面的性质不会因方向的不同而有所变化的特性，即某一物体在不同的方向所测得的性能数值完全相同。
材料在各方向的力学和物理性能呈现差异的特性。
8、饲养细胞
在体外的细胞培养中，单个的或数量很少的细胞不易生存与繁殖，必须加入其它活的细胞才能使其生长繁殖，加入的细胞称之为饲养细胞(Feeder cell)。
9、完全抗原、半抗原和不完全抗原
完全抗原:兼有免疫原性和反应原性的物质称完全抗原。大多数蛋白质是良好的完全抗原。 半抗原:只有反应原性而无免疫原性的物质称半抗原或不完全抗原，绝大多数低分子量的多糖和所有的类脂均属半抗原。
10、抗体的效价（滴度）
指抗体在保持其最佳特异性染色，并且具备最小背景条件下的最高稀释倍数。
11、灰度(grey level)(p113)
12、交叉点计数(p118)
13、特征物
特征物就是要定量研究的形态结构，即感兴趣的某种组织结构，它具有一定的形态和分界，在肉眼或显微镜下可以识别或分辨。
14、等距抽样、随机抽样和盲点抽样
等距抽样：它是首先将总体中各单位按一定顺序排列,根据样本容量要求确定抽选间隔，然后随机确定起点，每隔一定的间隔抽取一个单位的一种抽样方式。是纯随机抽样的变种。在系统抽样中，先将总体从1～N相继编号，并计算抽样距离K=N/n。式中N为总体单位总数，n为样本容量。然后在1～K中抽一随机数k1，作为样本的第一个单位，接着取k1＋K,k1+2K……，直至抽够n个单位为止。
随机抽样：按照随机的原则，即保证总体中每个单位都有同等机会被抽中的原则抽取样本的方法。
盲点抽样：(p108)
OD是optical density（光密度）的缩写，表示被检测物吸收掉的光密度，是检测方法里的专有名词，检测单位用OD值表示，OD=lg（1/trans），其中trans为检测物的透光值。
光通过被检测物，前后的能量差异即是被检测物吸收掉的能量，特定波长下，同一种被检测物的浓度与被吸收的能量成定量关系。
三、问答题
1、试述荧光显微镜的原理，结构以及生物学上的应用。
答：是用以观察细胞及组织内荧光物质的分布。荧光显微镜的基本构造是由普通光学显微镜加上一些附件(如荧光光源 、激发滤片、双色束分离器和阻断滤片等)的基础上组成的。它是装有、能产生紫外线（短波长）的光源及系列滤片装置的显微镜。由于紫外线的照射，标本中的荧光物质吸收光能后，呈现出不同颜色的荧光，这是自发荧光，如维生素A呈绿色荧光、心肌细胞内脂褐素呈棕黄色～金黄色荧光。但是,细胞内的某些成分只有与荧光素结合后，在紫外线的激
发下，才可呈现一定颜色的荧光；如应吖啶橙（荧光素）处理细胞后，细胞核内的DNA呈绿～黄绿色荧光，细胞质及核仁内的RNA呈桔黄～桔红色荧光。
利用荧光染色法及荧光显微镜可以观察组织、细胞的结构、细胞内某些成分含量的变化，并探讨细胞的功能状态。或用荧光素标记免疫球蛋白，进行免疫荧光细胞化学研究。
2、如何进行抗原修复，方法有哪些？（酶法、热修复??????）
答：免疫组织化学方法成功与否关键在于抗原决定簇的保存和暴露。组织经甲醛固定，甲醛的醛基与抗原蛋白的氨基交联，使抗原决定簇被掩盖，从而影响对蛋白表达的检测。要充分暴露抗原决定簇，通常用到抗原修复。
加热抗原修复法
高压加热修复法
① 切片脱蜡至水;
② 0.3% H2O2甲醇处理切片10
③ 蒸馏水洗;
④ 切片放入0.01M 柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)中，连同容器放入高压锅中加热至沸腾。盖上压力阀至喷汽后持续1－4
⑤ 待修复液恢复至室温后，PBS洗3次，随后按选好的免疫组织化学染色方法进行染色。 电炉加热修复法
① 切片脱蜡至水;
② 0.3% H2O2甲醇处理切片10
③ 蒸馏水洗;
④ 将切片放入抗原修复液中于电炉上加热，不时用温度计测量温度，当达92℃后，即可拔离电源，当温度低于92℃时，再插上电源，如此反复持续至10min左右;
⑤ 待抗原修复液降至室温后，PBS洗3次，随后按选定的免疫组化染色方法进行染色。 微波修复法
① 切片脱蜡至水;
② 0.3%H2O2甲醇处理10
③ 蒸馏水洗;
④ 0.01M柠檬酸盐缓冲液（pH6.0），于微波炉内微波辐射10
⑤ 待修复液降至室温后，PBS洗3次，随后按选好的免疫组织化学染色方法进行染色 胃蛋白酶消化法
① 切片脱蜡至水;
② 0.3% H2O2甲醇处理切片10
③ 蒸馏水洗;
④ PBS洗3次;
⑤ 滴上配制好或商品化的胃蛋白酶，处理切片20min左右;
⑥ PBS冲洗3次;
⑦ 按选择好的免疫组化该法进行染色。
胰蛋白酶消化法
① 切片脱蜡至水;
② 0.3% H2O2甲醇处理切片10
③ 蒸馏水洗;
④ PBS洗3次;
⑤ 滴上自配的或商品化的胰蛋白酶，处理切片20min左右;
⑥ PBS洗3次;
⑦ 按选好的免疫组化染色方法进行染色。
1)、抗体的保存
浓缩抗体：有效期内，只需放在4℃冰箱内，保存时间可达1-3年。
即用型抗体：理论上在4℃冰箱内可保存半年左右。
PBS或抗体稀释液稀释的抗体：一般只可放置1-2个月。
2)、出现假阳性的原因
组织切片质量不佳，造成假象，如刀痕裂缝边缘的组织着色过深，不能作为判断阳性的依据。
出血和坏死：红细胞的内源性过氧化物酶，坏死细胞释放的内源性过氧化物酶均可出现假阳性反应。
抗体的交叉反应。
3)、出现假阴性的原因
? 固定时间过长，浸蜡、烤片温度过高，导致抗原丢失，无法补救。
? 固定液不合适或浓度不对，导致固定不佳。最好使用10%中性福尔马林。
? 抗体浓度过低。
? 孵育时间太短，或孵育温度太低。
? 缓冲液pH值不正确。
4)、必须严格设置阳性对照和阴性对照。
5)、DAB有致癌性，用后不应随处倒弃。
3、酶组织化学方法通常有哪些？在酶组织化学中应注意哪些事项？
答：1）、金属-金属盐显示法
酶作用于底物时，其分解产物与底物混合液中某种物质结合，沉着在作用部位。然后结合物被金属置换，通过金属显色来证明酶的存在。或者，酶作用于底物后生成的分解产物，与底物孵育液中的金属离子相结合，直接沉着于酶反应部位，使其显色。
方法Ⅰ：钙-钴法
方法Ⅱ：铅法
2）、偶联偶氮色素法
同时偶联法：
该法是孵育液中的底物在酶作用下产生分解产物，后者立即与重氮盐结合（偶联偶氮反应），形成不溶性偶氮色素而显色。
后偶联法：
该法是为了防止重氮盐对酶的抑制作用，而先使酶作用于底物，使其分解产生反应物沉淀，然后将其浸渍于重氮盐溶液中，使其形成偶氮色素而显色。
3）、色素形成法
四唑盐法：
主要用于显示脱氢酶。底物中含有四唑盐或双四唑盐。在脱氢酶的作用下，底物释出氢原子，并与四唑盐或双四唑盐形成红色或蓝色的甲（càn）或二甲色素。
酶组织化学注意事项：
1）、选择最适温度、pH值及缓冲液
2）、为保持酶活性，最好使用冰冻切片，固定时间不能过长
3）、有些物质能提高或抑制酶的活性，故要选择合适的捕捉剂
4）、进行对照实验：用酶的抑制剂、用去底物的孵育液、用已确定含该酶的组织细胞进行对照
4、举例说明细胞色素氧化酶的原理。
答：细胞色素氧化酶(CCO):线粒体标志酶
5、什么叫多克隆抗体和单克隆抗体？对它们的优缺点进行比较。
答：抗体：浆细胞合成、分泌的一类能与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白（immunoglobulin, Ig）
多克隆抗体：（polyclonal antibody, PcAb）
大多数天然抗原物质往往具有多种不同的抗原决定簇，而每一决定簇都可刺激机体产生一种特异性抗体。多克隆抗体是多个抗原决定簇刺激机体后，由多个免疫淋巴细胞分泌的多种抗体的混合物。PcAb 特异性差，易出现交叉反应。
单克隆抗体：（monoclonal antibody, McAb）
由单一克隆B细胞杂交骨髓瘤细胞产生的，只识别一种抗原表位的具有高度特异性的抗体。 制备单一表位特异性抗体的理想方法是获得针对单一表位的浆细胞克隆，使其在体外扩增并分泌抗体。但浆细胞在体外的寿命较短，也难以培养。于是，将可产生特异性抗体但短寿的浆细胞与无抗原特异性但长寿的恶性浆细胞瘤细胞融合，建立了可产生单克隆抗体的杂交瘤细胞和单克隆抗体技术。
优点：结构均一、纯度高、特异性强、效价高、易大量制备。
比较：单抗特异性高，而且一旦制备成功就可以永续生产完全一致的抗体。多克隆抗体在特异性方面无法与单抗相比拟，而且即便是用相同抗原制备的不同批次的多抗也不能保证其一致性，因而多抗在特异性、一致性方面有很大局限。但多抗有制备时间短、首次制备成本低的特点，在一些情况下也是一种选择。
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