那个RACE设计引物具体怎么做的?求指教
乱颜是神铝噲
你现在有现成的RACE盒子么,如果有的话,你看下盒子的说明书,上面有提到引物设计.实在不行把你的已知序列和你要用的RACE盒子里的引物的序列都给发我,我帮你看看邮箱,资料越详细越好
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请教PCR的引物设计中多少个bp最合适?
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这个帖子发布于13年零16天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
我是一名新手,请教PCR的引物设计中多少个bp最合适?是不是在设计引物时一定要在引物前加保护碱基和酶切位点?是不是上下游引物的碱基一定要一样多?谢谢!
不知道邀请谁？试试他们
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一般18－23个都可以，你可以据此调节一下gc％含量 在40－60％为好，至于加不加酶切位点和保护碱基是看你要做什么，做后续克隆的话，双酶切是保护碱基和酶切位点都加，要是做T载体的可以不加保护碱基。 至于上下游不必要一样长，但不能相差太大，否则gc含量不一致，退火温度会相差很大
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:) 第一个问题，引物的长度要看你的目的。按教科书上说，一般是15-30个bp,这个长度对于一般的PCR一般够了，只要保证引物的特异性，如果是克隆或者别的PCR，引物可以更长，几十个甚至上百个bp,这都是常见的，总之一句话，能满足你要求的就是最合适的，没有具体的长度。:)至于保护碱基和酶切位点，这也是你的目的决定的。所谓的保护碱基，是为了增加酶切效率，保护酶切位点的，如果你做克隆，你要酶切位点干什么？:)还要保护什么呢？:)上下游引物不一定要一样长。建议你在园子里多看看，搜索一下关于引物设计的帖子，学习一种常见的引物设计软件，如Prime Premier 5.
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关于丁香园【求助】请教定点突变引物设计 - 经验共享 - 分析测试百科网 - 分析测试百科网
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【求助】请教定点突变引物设计
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各位兄弟姐妹，俺是第一次做定点突变，以下是我的目的序列，蓝色字体的是我的目的序列，也就是我要扩增的序列，从181到2475；红色标记的碱基AAC,AAT,我都想突变为CAG，请各位给我帮助，实验室以前也没有做的，请各位给些意见了，最好稍微详细的一步一步的，听说还要两次PCR,设计5对引物啊。真是不明白啊。5‘端是Hand3的酶切位点，下个5’的酶切位点ECorI。谢谢啦。
121 gctaaaacat tgcacaggag aagtcggcct gagtggtgcg gcgctcggga cccaccagca
181 atgctgctct tcgtgctcac ctgcctgctg gcggtcttcc cagccatctc cacgaagagt
――――――――――――――――――――――――――――――――
361 agaggtggct gcataaccct catctcctcg gagggctacg tctccagcaa atatgcaggc
421 agggctAACc tcaccaactt cccggagAAC ggcacatttg tggtgaacat tgcccagctg
481 agccaggatg actccgggcg ctacaagtgt ggcctgggca tcaatagccg aggcctgtcc
541 tttgatgtca gcctggaggt cagccagggt cctgggctcc taAATgacac taaagtctac
601 acagtggacc tgggcagaac ggtgaccatc aactgccctt tcaagactga gaatgctcaa
661 aagaggaagt ccttgtacaa gcagataggc ctgtaccctg tgctggtcat cgactccagt
721 ggttatgtaa atcccAACta tacaggaaga atacgccttg atattcaggg tactggccag――――――――――――――――――――――――――――――――
2401 atggcctaca aagacttcct gctccagtcc agcaccgtgg ccgccgaggc ccaggacggc
2461 ccccaggaag cctagacggt gtcgccgcct gctccctgca cccatgacaa tcaccttcag
3’查看完整版本请点击这里：
fox_79 ( 15:38:14)
我也是按照您的方法来设计引物做的，合成了10段引物（5对），我今天做了第一次PCR,发现八个片段PCR作出来7个片段，跑电泳也非常好看，但是另一个怎么也做不出来。在电泳孔道里只有跑在最前面的100bp左右的一团稍亮的带。不知道是不是引物二聚体，不知道如何改条件才行，希望给予指导。谢谢！
我圈出来的那个孔的对比marker是在最右边，分别是从上到下是100，250，500，750，bp,
october7 ( 15:38:32)
不客气，很愿意能够提供一些参考信息。
为了说明方便，全长正向引物称为FF（Full Foward），例如从361碱基开始；全长反向引物称为FR（Full Reverse ），例如从2401碱基开始。从上游到下游，突变点分别为A、B、C、D。每个突变点的一对引物，正向的为字母大写即A、B、C、D引物，反向为字母大写并标一撇，即A' 、B'、 C'、 D'引物。
扩增成功的是四个较短的片断，分别是FF同A' 、B'、 C'、 D'引物的扩增产物。而扩增较长片断时，RF同某个引物的扩增失败（B或C？），其他扩增正常。（从你的胶图上看，上样孔在下方。离上样孔近的条带应该是大片断，未扩增成功的是在扩大片断的半块胶上，位置约1000bp，不会是引物二聚体，引物二聚体通常在100bp左右，和溴酚兰位置接近）。
扩增失败的PCR可以进行条件优化，如改变退火温度（看来要降一些），延长退火时间（有力于失败的那条引物退火）等。 你的其他组结果都很好，我认为问题出在退火温度不合适或退火时间偏短。 摸条件我的做法是先用普通Taq酶配200微升PCR混合液，分装10管，每管一个温度，连续摸数个到十个温度，取条带扩增最锐利的为最优条件。
但是我认为还是需要提醒你的是FF到RF之间的扩增片断有2K，这会增加PCR引入突变的几率。我还是建议FF到RF之间取600bp左右作突变PCR，而后用适当的酶切位点连接。当然如果你必须扩增2K的片断，这个意见不是绝对的，因为象QuickChange试剂盒，实际上对整个3K的质粒序列扩增，并用引物引入突变，也是成熟的技术。
还有一点个人经验。要注意原始DNA污染后面的突变过程。需要原始DNA作模板时，模板量尽量少些。切胶回收PCR产物时，一定要用洗涤剂清洗电泳槽而后作回收电泳。切胶在紫外灯下进行时，要把胶接触的平面用分别含酒精、NaOH（消除核酸）、清水的三块干净纸巾擦干净。
建议突变PCR只循环20周，以降低PCR引入突变的几率。
还可借鉴不对称PCR可以富集一条产物链的特点，两引物可一个高浓度，一个低浓度，使有能延伸的那个单链富集些。例如进行A点突变，第一轮两管PCR中，1. FF引物正常量，A'引物1/5正常量；2. A引物正常量，RF引物1/5量。（不可按不对称PCR 50:1的比例加引物，因为扩增成的单链难以结合EB，因而难以回收）个人感觉这样的方法可以增加突变的成功率。
fox_79 ( 15:38:50)
非常感谢，我会按照您的建议去实验的。
fox_79 ( 15:42:13)
您好，我现在按照您的指导和建议，已经做到二次PCR了，并且切胶回收了。下面我就要酶切连接了，但是我们实验室没有做过的，我第一个得摸索，不知道步骤啊，Hand3和Ecor1这两个酶和BUffer我们实验室都刚刚买的，是Fermentas公司的。我就想知道从酶切，连接，到酶切验证和PCR验证，再到测序，中间这个过程如何操作，希望您给予建议，最好有每一步的建议和详细步骤，十分感谢了，您的联系方式是什么？我联系也比较方便啊，谢谢！您可以在我原来的帖子里回答，说不定会是个精华帖呢，你的经验太丰富，这可以从你给我建议里看出来。希望您有空可以帮帮我。第一次做啊，一头雾水，谢谢！
october7 ( 15:42:31)
关于酶切、酶连、转化等一套分子克隆中的问题，我把我们实验室一套成熟的做法加以整理，已经贴在园子里。你可先参考其中PCR克隆和转化部分的内容。
一个PCR克隆酶切用量的实例：
以上主要是我个人的意见，尽量提供实用的操作Protocol，其中的原理讨论较少。所以请一定搜索和多看园子里的帖子。克隆技术方面有很多帖子。请参考核酸版、生化分子生物版、PCR技术版等。
关于PCR酶切，请参考该精华贴：
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