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流式细胞术检测cyclin d1和bcl-2在b细胞淋巴瘤诊断中的意义
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Bcl-2shRNA转染联合塞莱昔布对胃癌细胞株SGC-7901增殖的影响.pdf
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Bcl-2反义核酸增强青蒿琥酯诱导K562细胞凋亡
Bcl-2 antisense oligodeoxynucleotides to enhance the apoptosis-inducing effect of artesunate on K562 cells
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目的:研究bcl-2反义核酸增强青蒿琥酯对人慢性粒细胞白血病K562细胞株诱导凋亡效应.　方法:合成bcl-2反义核酸(ASON)导入K562细胞,应用Western　blot法检测bcl-2蛋白的表达,TUNEL技术、流式细胞仪法(FCM法)检测细胞凋亡.　结果:bcl-2反义核酸(ASON)能明显抑制bcl-2蛋白的表达.　青蒿琥酯在1～7　mg/L浓度范围内能分别明显抑制K562细胞的增殖,并具有时间和浓度依赖性,Ġmg/L青蒿琥酯作用72　h的K562细胞株A值最低.　原位细胞凋亡检测可见细胞变小,核固缩为一个或多个染色质团块,与未经ASON转染的K562细胞株相比,经bcl-2　ASON转染的K562细胞株对青蒿琥酯的诱导凋亡作用更加明显;FCM法出现低于G1期DNA含量的亚二倍体凋亡峰,细胞凋亡主要发生在G1/S期,与未经ASON转染的K562细胞株相比,经bcl-2　ASON转染的K562细胞凋亡率显著增加.　结论:青蒿琥酯在体外一定浓度范围内可诱导K562细胞株凋亡,bcl-2反义核酸可增强青蒿琥酯诱导K562细胞凋亡的作用.
[赵新汉;王志宇;李晶;全平]西安交通大学医学院第一附属医院肿瘤内科,环境与疾病相关基因教育部重点实验室,陕西,西安,710061
第四军医大学学报
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邮编：710049论文:反义bcl-中大网校论文网Bcl-2基因对膀胱癌细胞抗氧化能力增强作用的实验研究
本研究首次采用含有Bcl-2基因的重组质粒pcDNA3.1(+)-Bcl-2转染膀胱癌BIU87细胞，建立了稳定过表达Bcl-2的细胞株BIU87/Bcl-2。应用流式细胞术检测阿霉素(adriamycin，ADR)诱导的BIU87、BIU87/neo和BIU87/Bcl-2细胞凋亡和ROS水平，探讨Bcl-2基因对细胞凋亡和细胞内ROS的影响。应用分光光度计检测．ADR作用后BIU87/neo和BIU87/Bcl-2细胞内SOD、CAT酶的活性变化，探讨Bcl-2基因对细胞内抗氧化酶的影响。我们还分别提取了ADR作用后BIU87/neo和BILl87/Bcl-2细胞胞浆及胞核蛋白，对其中NF-κB p50、p65和IκBα蛋白进行了检测，在蛋白水平探讨Bcl-2基因对细胞NF-κB...展开
本研究首次采用含有Bcl-2基因的重组质粒pcDNA3.1(+)-Bcl-2转染膀胱癌BIU87细胞，建立了稳定过表达Bcl-2的细胞株BIU87/Bcl-2。应用流式细胞术检测阿霉素(adriamycin，ADR)诱导的BIU87、BIU87/neo和BIU87/Bcl-2细胞凋亡和ROS水平，探讨Bcl-2基因对细胞凋亡和细胞内ROS的影响。应用分光光度计检测．ADR作用后BIU87/neo和BIU87/Bcl-2细胞内SOD、CAT酶的活性变化，探讨Bcl-2基因对细胞内抗氧化酶的影响。我们还分别提取了ADR作用后BIU87/neo和BILl87/Bcl-2细胞胞浆及胞核蛋白，对其中NF-κB p50、p65和IκBα蛋白进行了检测，在蛋白水平探讨Bcl-2基因对细胞NF-κB活化的影响，从而揭示Bcl-2基因在膀胱癌细胞中调控细胞内ROS可能传导通路。
实验方法：
采用标准DNA重组方法构建Bcl-2表达质粒pcDNA3.1(+)-Bcl-2，通过脂质体Lipofectamine 2000介导将Bcl-2基因转染到人膀胱癌细胞株BIU-87细胞，采用RT-PCR和Western blot方法鉴定细胞内Bcl-2水平，建立稳定过表达Bcl-2基因的BIU-87/Bcl-2细胞株。BIU87、BIU87/neo和BIU87/Bcl-2细胞经不同浓度ADR．作用24h后应用MTT比色法检测细胞抑制率，应用流式细胞技术检测细胞凋亡及ROS水平，并应用吖啶橙染色法观察细胞的形态学变化。分别提取BIU87/neo和BIU87/Bcl-2细胞胞浆和胞核蛋白，应用Western blot方法检测两种细胞胞核NF-κB p50、p65和胞浆IκBα蛋白表达情况，同时应用黄嘌呤氧化酶法检测细胞SOD活性，应用可见光法测定细胞CAT活性。
实验结果：
1、稳定过表达Bcl-2基因膀胱癌细胞株的建立及其对ADR化疗的敏感性。
(1) 真核表达载体pcDNA3.1(+)-Bcl-2的构建pcDNA3.1(+)-Bcl-2经EcoR I和Xho I双酶切后，可见约847bp的cDNA片段。核酸序列分析证实全长Bcl-2插入在真核表达载体pcDNA3.1(+)的EcoRI、Xho I位点间。
(2) 稳定转染Bcl-2基因膀胱癌细胞株的建立经G418筛选后，分别转染pcDNA3.1(+)和pcDNA3.1(+)-Bcl-2的BIU87/neo和BIU87/Bcl-2细胞生长旺盛，形态与BIU87细胞无明显差别。RT-PCR和Westernblot检测结果显示BIU87、BIU87/neo和BIU87/Bcl-2三种细胞株Bcl-2基因和蛋白表达水平均有显著性差异(P<0.01)，其中BIU87/Bcl-2中Bcl-2表达明显增高，而BIU87和BIU87/neo细胞Bcl-2表达无明显差异。
(3)三种细胞对ADR的化疗敏感性检测经不同浓度ADR作用24h，BIU87、BIU87/neo、BIU87/Bcl-2细胞生长均不同程度受到抑制，其中ADR对BIU87/Bcl-2细胞的抑制率明显降低(P0.05)。
2、Bcl-2过表达对ADR诱导的膀胱癌BIU87细胞凋亡和ROS水平变化的影响。
(1)Bcl-2过表达对ADR诱导的细胞凋亡的影响经终浓度分别为6.25μg/ml、12.5μg/ml和25μg/ml的ADR作用24h后，应用流式细胞术检测BIU87、BIU87/neo、BIU87/Bcl-2细胞的凋亡率，结果显示与对照细胞相比，各组细胞凋亡率均明显增加(P<0.01)，其中BIU87/Bcl-2细胞凋亡率比其它2组细胞明显降低(P0.05)。吖啶橙染色结果显示经ADR处理的3组细胞部分细胞表现为细胞皱缩，细胞核内可见致密浓染的黄绿色染色或碎片，呈现细胞凋亡的特征性形态学改变。
(2)Bcl-2过表达对ADR诱导的细胞内ROS水平变化的影响经终浓度分别为6.25μg/ml、12.5μg/ml和25μg/ml的ADR作用24h后，应用流式细胞术检测BIU87、BIU87/neo、BIU87/Bcl-2细胞内ROS水平，结果显示与对照细胞相比，各组细胞ROS水平均明显增加(P<0.01或0.05)，其中BIU87/Bcl-2细胞ROS水平比其它2组细胞明显降低(P0.05)。
(3)细胞内ROS水平与细胞凋亡的相关分析经不同浓度ADR作用24h后，3组细胞的ROS水平与细胞凋亡率呈正相关(r=0.767，F=65.805，P<0.01)。
3、Bcl-2过表达对ADR诱导的膀胱癌细胞BIU87 NF-κB活化和抗氧化酶活性改变的影响。
(1) NF-κB活化检测结果Westemblot显示，与未经药物处理的细胞相比，经ADR作用24h后，BIU87/neo和BIU87/Bcl-2细胞胞核p50和p65蛋白表达均明显增加，胞浆IκBα蛋白表达均明显减少，差异有统计学意义(P<0.01)：与BIU87/neo细胞相比，BIU87/Bcl-2细胞胞核p50和p65蛋白表达明显增加，胞浆IκBα蛋白表达明显减少，差异有统计学意义(P<0.01)。
(2)SOD和CAT活力变化与未经ADR处理的对照细胞相比，BIU87/neo和BIU87/Bcl-2细胞经ADR作用24h后，细胞SOD活力和CAT活力均明显降低(P<0.01)；与BIU87/neo细胞相比，BIU87/Bcl-2细胞SOD活力和CAT活力均明显提高，差异有统计学意义(P<0.01)。
研究结论：
1、通过脂质体介导的方法可建立稳定过表达Bcl-2基因的膀胱癌细胞株BIU87/Bel-2。
2、Bcl-2过表达使膀胱癌BIU87细胞对ADR的化疗敏感性降低。
3、Bcl-2过表达可抑制ADR诱导的膀胱癌BIU87细胞凋亡，这种抑制作用与Bcl-2能够降低细胞内的ROS水平有关。
4、Bcl-2可通过降解胞浆IκBα促进膀胱癌BIU87细胞NF-κB活化。
5、Bcl-2可抑制ADR诱导的膀胱癌BIU87细胞sOD和CAT活性降低。
6、Bcl-2降低细胞内ROS的可能途径是Bcl-2促进NF-κB活化，使细胞内抗氧化酶表达增加，从而降低细胞内ROS水平。收起
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