转基因为什么不能直接用PCR产物连接在表达载体上?我在做小麦转基因到拟南芥中,今天在想为什么不能把目标基因PCR后直接表达载体构建,而要用克隆载体后再构建表达载体?
当然是可以直接将目标基因PCR后直接连到表达载体上的.但实际上在操作过程中,我们都是推荐先将目标基因的PCR产物连接到克隆载体上后再用于构建表达载体.原因是首先如果是未知序列的话,需要用克隆载体来对这段序列进行测定,然后好确定序列中的酶切位点,为下一步表达载体的构建策略提供必要的信息.然后,即使是序列很确定的基因,一般也会先装在克隆载体上.主要是因为你没办法保证你的序列的重复性.如果直接用PCR产物的话,由于你的模板并不一定是完全一致的,即使有少量的mRNA有碱基错配,很有可能就在PCR反应中这些错误的mRNA反转录的cDNA就被无限放大了,这样你连上去的序列就不一定准确了.但如果是装入克隆载体的序列,从克隆载体上获得的序列就有绝对的一致性,这样结果才有说服性.最后一点就是,连在克隆载体上的片段是很稳定的,你以后进行实验的时候还能保证可以获得完全一致的片段.但如果重新RT-PCR,这结果就有几率不同了.当然,对于已知序列直接PCR产物连接表达载体是很少几率出错的,这样做实际上是为了实验结果的严谨.
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酷似是为了测序方便，有时候表达载体不能进行测序，或者说不方便，就需要经过一次亚克隆。当然，如果表达载体可以用通用引物测序就可以一步到位进行连接，测序证实没有突变就可以去表达了。
一是测序方便，有通用引物嘛~二是提高连接效率~
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【求助】表达质粒和目的片段双酶切后，一直连不上，为什么？
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这个帖子发布于5年零281天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
大家好，我最近一直在做表达载体、目的片段的双酶切和酶连、转化。但是转化后的平班上长出来的菌落全部是假阳性的，一个板子能长10-30个菌落，但是做菌液PCR后全部是假阳性。做了好长时间了，一直是这样，不知道什么原因了！还望大家给予指点，小妹在此不胜感激！！！！！！
内切酶和T4连接酶都是购买的TaKaRa的产品。
我用的两个内切酶是EcoRI和XhoI，内切酶是没有问题的，我已经做了单酶切试验了，都能把pET-28a和pGEX-4T-1这两个表达载体切开（由于不知道那种载体能将蛋白表达，所以同时用了2个表达载体）。
我加抗生素的时候都是在LB培养基的温度为50读左右的时候加的。Amp的终浓度是50ng/ul，Kan的终浓度是50ug/ml。
我的酶切体系20ul：EcoRI
1ul，XhoI 1ul，10*H Buffer 2ul，质粒DNA/目的片段
16ul；37度酶切4h。双酶切产物进行柱式胶回收纯化，然后进行连接。
酶连体系10ul：T4连接Buffer 1ul，DNA 3ul，载体DNA 5ul，T4连接酶 1ul；我是按照p摩尔比（DNA：载体DNA=10:1进行的连接）；连接条件是4杜连接过夜（20h左右）。纯化后的载体DNA浓度为5ng/ul，DNA浓度为40ng/ul。
将以上的连接产物进行转化实验，转化到大肠杆菌感受态细胞BL21（DE3）中，最后平板上长出来的菌落全部是假阳性的！
我的目的片段是1.9kp，目的片段直接用PCR纯化产物进行双酶切，表达载体提取质粒后进行双酶切，然后进行的酶连以及后续试验。
不知道邀请谁？试试他们
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我是菜 酶切后的载体做个自连的对照吧，看看载体有没有完全切开！另外不知道你酶切前的载体跟片段的浓度，你少切点儿试试，保证你的酶切量在500ng以下，我觉得是你的载体没有切开。酶切前载体的浓度是5ng/ul，目的片段的浓度是40ng/ul。我再试试看吧。谢谢您了！
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zfv2007 我觉得这其中存在一个问题，你构建载体时感受态细菌用的是BL21，这个菌一般用来做表达用，但是不适合用于做克隆，转化效率太低，不如在构建载体时换用DH5或者JM109之类的感受态细菌，而且连接反应也没必要在四度进行，直接16度过夜就可以。还有，如果假阳性太高，可以考虑采用磷酸酶如CIP之类的处理一下载体，可以防止载体自连。我现在就是做的表达，想把我的目的片段连接到表达载体上然后诱导表达的。难道需要把构建好的重组表达载体转化到DH5a中吗？这样做是什么意思？谢谢您的答复！
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您好，谢谢您的建议。现在回答一下您的问题：1、双酶切体系中加入的DNA或者是载体我都是测了浓度的，这两种内切酶都要求DNA的质量小于或等于1ug就可以完全切开，之所以加大DNA的量是因为怕回收纯化完之后浓度太低而无法进行连接实验。在酶切完之后我进行了电泳检测，当然设置了没有没切的质粒作为对照，进行双酶切的质粒大部分都已经切开，只有小部分没有切开，我要进行胶回收的时候切胶是切的完全酶切开的片段。1、目的片段加了保护碱基：EcoRI加了2个保护碱基、XhoI加了三个保护碱基。2、酶切体系是20ul，但是我同时做了两个平行样，也就是说最后进行回收纯化的体系是40ul的体系。3、我要是把连接产物直接转化到大肠杆菌DH5a中或者Top10中后，如果出现重组表达质粒的话，后续试验怎样进行？先把重组表达质粒提取出来然后再转化到表达载体BL21（ED3）中吗？我想做的就是将我的目的片段进行表达。急盼佳音！谢谢！
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civcul 1、质粒没有完全切开，虽然你切下来的感觉是切开的部分，但是你不能分开是单酶切开的，还是双酶切开的。因此，建议减少质粒量；增大酶切体系，如30ul；延长酶切时间，如过夜酶切。回收之前先取一点跑一下电看看是否完全酶切开了，之后再回收。2、引物加了保护性碱基，一般问题不大，如果还是不行，也可以考虑增大酶切体系；延长酶切时间等措施。还可以先连接到T载体，再酶切下来，这样可以保证切下来的片段是正确的。3、先转化DH5a中拿到阳性克隆，然后再转化BL21进行表达即可。谢谢版主，我再试试看。
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zfv2007 你要做的工作是：1.构建载体，可以采用DH5a，这样比BL21容易些，2.第二是做表达，把构建好的载体转到BL21中，然后诱导表达。不知道是否明白？谢谢，已经明白了！！！
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cedar1985 不好意思，DXY没按时上。看完其它人的，补充一个，如果你还没有做出来的话，建议把EcoRI的保护碱基加到四个好的，我再试试看。谢谢了！
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关于丁香园载体构建若目的片段大于3kb,连接时有没什么比较有效率的方法?
zsCL29JB95
如果目的片段过长不好连接,可考虑T载体,连接效率还是比较高的
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那位高手帮忙指点下，我要构建一个产酶的基因工程菌，目的片段通过也能扩增出来，在引物设计时也都引入了酶切位点。我的方法是先与T载体连接，转入DH5a, 筛选出阳性子提取质粒酶切，再与表达载体Pet30连接，转入BL21进行表达，筛选出阳性表达子。我的问题是能否将PCR产物直接酶切与表达载体连接转入BL21，省去与T载体连接。谢谢！
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我觉得可以，只是很难，我最近一直在做这个，后面双酶切就是不行，现在就想先连进T载体，可是不知道怎么回事，转化后提取质粒再双酶切就是切不出来，郁闷！
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2010大海000
& & 一般可以，但前提是你的克隆引物前要有保护碱基，这样才比较好切。
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你用的是啥菌株，啥酶啊。
像TOP10那样的菌甲基化比较严重
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&&嗯，我的是DH5α啊，EcoRI和SalI双酶切
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连T最重要的目的是要保存基因，如果直接转pET20没问题，但如果中间有困难，返回头来还需要重新PCR，回收纯化。因此连T的步骤可以省，但非常有必要。
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pcr以后TAQ酶会在末端添加一个A，做T连接更容易连接上
签到天数: 1 天[LV.1]初来乍到
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当酶切的位点在dna片段的末端时，酶切的效率很低，这时可以先给它连个t载体，或者设计引物时，在酶切位点外侧加几个碱基（所谓的保护碱基，3～5个？）这样酶切效率就不会降低了。
我没做过，上面的内容是以前在某个地方看到的，忘记具体内容了。也许可以去找takara的限制酶说明书看看。
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