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你可能喜欢酒精浓醪发酵概述（天津科技大学生物工程学院肖冬光&&许葵）
浓醪发酵具有高细胞密度、高产物浓度和高生产速率等特点，是国内外发酵行业长期研究和追求的技术，也是发酵工业的发展目标和方向。不同微生物菌种、不同原料和不同发酵产品的生产，浓醪发酵时产物浓度的界限存在着明显的差别。此外，随着发酵技术的不断进步，浓醪发酵的标准有逐渐提高的趋势。就酒精生产而言，浓醪发酵一般是指酒精浓度大于12%（V）的发酵生产。
与传统的酒精发酵工艺相比，酒精浓醪发酵具有如下的优点：
(1) 单位设备的生产率提高：例如若发酵成熟醪液中的酒分达到12.5%（V/V）， 则 1000m3发酵液中的酒精量为：1000&12.5%&0.7893t/m3
=99.125t；如果采用浓醪发酵，发酵成熟醪中酒分达到18%（V/V），则最终酒精的产量可以达到124.074t[15]。酒精浓醪发酵可以明显地提高单位设备的生产率和利用率。
2.1酵母菌的生长与代谢
在酒精发酵过程中，酵母菌处于主体地位。研究发现，处于对数生长期的酵母细胞产生酒精的能力是平衡期的酵母细胞产酒能力的三十倍，而处于平衡期的酵母细胞所消耗的糖类主要是维持酵母菌自身的生长代谢所需。资料表明，酵母菌需要能量时才吸收和发酵糖类[16]。正是由于能量的产生、菌体的生长和乙醇的生成是紧密联系在一起的，所以有必要在发酵培养基里加入相应的酵母必需物质，创造条件使酵母菌维持旺盛的生长繁殖能力，以避免不彻底发酵的发生。对于酒精浓醪发酵而言，其发酵醪液中的酵母所需营养成分显得格外重要。
2.2葡萄糖浓度
葡萄糖是酵母菌进行酒精发酵的主要基质。当葡萄糖浓度低于10g/L时，其消耗速度和糖浓度成均匀的直线关系，但是目前的酒精生产中葡萄糖浓度远远高于这一数值。但是当葡萄糖的浓度超过一定浓度值时（许多学者认为是150g/L），它对酵母菌的发酵和呼吸作用都产生抑制作用。要实现酒精浓醪发酵，必须解决高浓度葡萄糖的抑制作用。
2.3酒精的抑制作用
酒精是酵母菌的代谢产物，它会对酵母菌产生毒害作用。随着发酵醪液中酒精浓度的增加，乙醇可以插入到细胞膜的疏水区，降低了疏水相互作用力（这种作用力对维持细胞膜的完整性是非常重要的）。另外乙醇在疏水区的存在还会降低范德华力的相互作用，增加细胞膜的运动性和疏水区的极性，使细胞膜减弱对极性分子自由交换的疏水性障碍作用[17]。不同的酵母菌株它的耐酒精能力是不同的，但是一般情况下，当发酵醪液中的酒精含量达到18%（V/V）时，酵母菌细胞不再生长，也不产生酒精。当酒精含量低于3.8%（V/V）时，它对酵母菌的抑制作用才可忽略不计。
2.4溶氧的影响
氧气可以破坏酵母菌酒精发酵的厌氧代谢过程，从而使酵母菌采取有氧呼吸，不进行厌氧发酵，不产或者仅产生少量酒精。日本的福井郎指出，即使在充足氧的存在条件下，如果有足够葡萄糖的存在，酵母菌细胞也可以通过发酵的途径增殖，此时酵母菌细胞是受阻抑细胞，具有呼吸能低的特点，他认为高浓度葡萄糖的存在妨碍酵母菌细胞呼吸系的发达，并且减少“功能性”线粒体的个数，从而使无氧呼吸的酒精发酵途径在一定水平上有所提高[18]。常规的酒精发酵醪液中，溶解氧的数量已经能够保证酵母菌对氧的需要。而在浓醪酒精发酵过程中，有限量氧气的存在，可以为酵母菌提供合成细胞的原生质膜和线粒体中的聚不饱和脂肪酸和类脂质，从而保护细胞膜的完整性，利于酒精发酵。
2.5酵母菌细胞密度的限制
酒精是酵母菌生长代谢的产物，一般情况下，发酵醪液中酵母菌细胞的密度越高，单位时间、单位容积产生的酒精就越多，效率就越高。但是在一般的间歇发酵工艺中，受发酵醪液中营养物质的含量、酒精代谢产物浓度、及酵母菌自身生理和遗传等因素的影响，醪液中的酵母菌细胞密度会有一个极限值[17][19]。对于酒精浓醪发酵来说，由于发酵醪液中的葡萄糖的浓度比一般的发酵醪液中高出很多，此时加入酵母菌的数量也应该比一般的间歇发酵醪液中要多，但是考虑到生产成本以及酵母菌个体间的相互影响，酵母菌细胞的密度应该增加到一个合理的范围内，从而防止酵母菌因为过量增殖而消耗多余的原料糖，同时又能保证酵母菌细胞正常生理代谢所需要的糖，实现良性发酵代谢。
2.6温度条件
在酒精浓醪发酵中，由于葡萄糖浓度很高，溶液的渗透压增加，容易导致细胞膜破裂。而此时如果发酵醪液的温度仍维持在一般发酵的最适温度33℃，则有可能会使磷脂分子在膜内作快速的侧向扩散或者侧向运动，频繁的在脂双层的同一层中与邻近的分子进行交换。结果膜脂的流动性增加，膜的完整性容易遭到破坏。据研究表明，酒精浓醪发酵的最适温度是27℃[15-17]。此外，温度升高有利于乳酸菌的生长，从而影响发酵效率，增加生产成本。由此可见，温度是制约酒精浓醪发酵实际生产的一个关键因素。
2.7副营养物匮乏的影响
[12][2021]
3酒精浓醪发酵菌种的选育
酵母菌发酵的主要优点是能在pH3－4的范围内进行发酵，污染杂菌的几率低，副产物少。酵母酒精发酵过程的主要缺点是，高酒精度和高温对浓醪酒精发酵有明显抑制。[22]国内外科研工作者关于酵母酒精发酵主要育种方向是：提高糖酵解运行效率、提高酒精耐性和提高耐高温性能。尽管糖酵解途径的碳代谢受多点调控来调节其运行效率，但是单一限速步骤速率的高低对其影响还是很大的，特别是三步不可逆反应催化酶的活力：己糖激酶（葡萄糖激酶）、磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶。上述不可逆的步骤是糖酵解和葡萄糖再生途径中重要的调节位点。[23]因此实现高浓度发酵的首要前提是提高酵母上述酶活力，抵抗葡萄糖的抑制作用和阻遏作用及构建利用淀粉的基因工程酿酒酵母菌。酵母发酵的另一种育种方向是耐高温菌种的选育，提高发酵温度后可节约冷却用水，缩短发酵周期，从而大幅度降低生产成本。目前世界上同时耐高温、耐酒精的菌种应用于大生产还未见报道。人们正采用不同的手段，从不同的角度来改进酿酒酵母的生产性能，并取得了一定的进展[24] 。
3.1传统育种技术
传统的酵母菌育种技术主要有直接筛选、杂交育种和诱变育种等。在工业育种中，经这些方法选育出的菌种具有生产稳定性好、实用性强、菌种适应性强等优点，因此，现在乃至今后相当长的时间内仍将被广泛使用。目前，利用传统技术培育菌种的育种目标是：选育耐高温，耐高糖，发酵周期短，能直接利用淀粉以及直接利用纤维素和半纤维素的菌株。
目前工厂中使用的菌株大多是采用直接筛选的方法进行选育。1990年，研究人员从酵母样品中分离到两株酵母菌Et-2和Et-4，能利用35%的蔗糖发酵生产酒精，产生的酒精浓度分别是18.4%（V/V）和18.5%（V/V）。1991年，Bertolini等人[25]从巴西的酒精厂中分离到两株既耐高渗又高产酒精的酵母菌osmo-1和osmo-5，在30%的蔗糖糖浆中发酵，最终酒精产量达到18%（V/V）左右。
利用诱变剂对酵母进行处理是一种简便有效的育种方法。王滨等人[26]利用筛选出的酵母菌Y316作为出发菌株，经紫外线诱变原生质体，选育出酒精高产菌株Y316-23。当料水比为1：1.8时，发酵60
h，成熟醪的酒精体积分数在13.5%（V/V）以上。另外，刘建军等人[27]利用热冲击、紫外线和γ-射线联合作用获得一株高产酒精酵母NHY4-36，以玉米淀粉为原料，采用边糖化边发酵工艺（SSF），32℃发酵60-68
h，该酵母菌株可产酒精度在17.5%（V/V）以上，耐酒精度在20%（V/V）以上。
3.2现代育种技术
现代酵母菌育种技术是以原生质体融合和DNA重组技术为依托的。近年来，运用原生质体融合和遗传工程等育种新技术来改良菌种，克服了远缘菌种间基因重组的不亲和性，提高了重组频率，已培育出了一批工程菌，对于拓展酒精生产原料和提高产量有很大的促进作用。然而，在生产上这些工程菌仍然缺乏良好的稳定性，因而大多数还没有达到工业应用的程度。此外，培育集两个或多个优良性状于一身的工程菌的研究也将是酵母菌选育工作的一个热门方向。
3.2.1原生质体融合技术
原生质体技术起源于20世纪50年代。1977年Sipiczki 和Ferenczy[28]首次实现了酵母菌的原生质体融合。原生质体融合技术是将双亲细胞通过酶解脱壁，制成原生质体，然后在高渗条件下加入助融剂，使双亲的原生质体发生凝聚，通过细胞质融合、核融合，发生基因间的交换重组，进而在适当的条件下再生出细胞壁，形成重组子的过程[29]。这项技术主要包括制备原生质体、原生质体融合和检出融合子三个步骤，具有杂交频率高、受接合型的限制较小和遗传物质保持完整的特点。原生质体融合是一种更为广泛更随机的基因重组方式，重组的频率达到10-6左右，可以轻易实现大规模遗传物质重组，打破种属界限，实现远缘菌株间的基因重组[30]。它也可以和其他育种方法相结合，将多种优良性状组合到一个单株中，大大缩短育种周期。
原生质体融合技术已广泛应用于工业用酵母菌株的优良性状改造[31,32,33]。Chi等[34]利用原生质体融合技术使酵母菌株W-Y-2和酿酒酵母1200（Saccharomyces sp.
1200）的细胞融合，与亲本相比，得到四倍体菌株C4能明显提高发酵速度。目前，实现淀粉原料直接发酵生产酒精是酒精发酵工业需要迫切解决的问题[35,36,37]。酵母糖化酶基因的表达受多种基因的调控，因此很难分离到与之相适应的基因产物。用原生质体融合技术进行糖化酵母育种则显现出了更大的优势。通过遗传物质重组，可选育出具有淀粉糖化酶活性的酵母新菌株，或进一步改良亲本菌株，实现淀粉直接发酵成酒精的一步生产法。目前国内外已通过此方法实现了酿酒酵母（S.
cereVisiae）和其他酵母菌或霉菌种间或属间的融合。庞小燕等人[38]以酿酒酵母（S. cereVisiae）和热带假丝酵母(C.
tropicalis)为亲本，通过单亲灭活，进行属间原生质体融合技术，获得了既具有糖化酶活性又高产酒精的融合株，在一定量的淀粉培养基中发酵，酒精产量可达11.5%（V/V）。黎碧莲等人[39]在酿酒酵母(S.
cereVisiae)和扣囊拟内孢霉（Endomycopsis
fibnligera）属间的融合产物中获得两株融合子P501和P519，并进行了木薯粉糖化醪发酵试验，酒精产量可达6.9%（V/V）和7.7%（V/V）。王建玲等人[40]利用PEG诱导原生质体融合技术，进行糖化酵母单倍体和耐高温酒精酵母单倍体的同型原生质体融合，培育出既有较强的糊精利用能力，又耐高温和高产酒精的融合子，使用该菌发酵可减少40%的糖化酶用量。
3.2.2 DNA重组技术
DNADNADNA[41]80[42,43,44][45]cDNApKG1Y3386%[46]GAIcDNA—GRF1820%4896.1%8.4%V/V[47]RT-PCRAS.2.1364
酒精是酿酒酵母厌氧发酵的重要产物，对酵母细胞本身具有毒害作用，影响细胞膜成分和细胞代谢。即使酒精浓度只有4%（V/V），某些菌株对糖、离子和氨基酸的吸收速率也会下降50%[48]。如果酒精浓度过高，就会影响酵母细胞的存活。试验证明，在酒精浓度为0%（V/V）时，加热到50°C，1min后15％的酵母细胞会继续存活；如果酒精浓度为6％（V/V），则仅有0.28%的酵母存活；如果酒精浓度为15％（V/V），则仅有0.05%的酵母存活。Rosa研究表明[49]，酒精浓度的增加，削弱了细胞膜对极性分子的屏蔽能力。酒精浓度达到8%～18%（V/V）时对酵母细胞有害，其毒害程度与酵母菌株和培养基状态有关。当酒精浓度达11%（V/V）时，酵母发酵完全受抑制，Fukuda[50]也证实从清酒中可以分离出高产酒精酵母，并认为清酒酵母的高产量与其对高浓度酒精和有机物的耐性有关。
研究酵母菌耐酒精的生理机制对于提高发酵工业的酒精产量，探索微生物抵抗不良环境的生命机制具有重要的实际和理论意义。尽管人们对酵母菌产酒精的过程、分泌、调节及相关耐性还没有完全弄清楚[51]。实践证明，高产酒精酵母对高浓度的酒精表现出很好的耐性是与细胞膜的特性有关，其中酵母原生质膜的特殊组成、培养条件和培养基组成对酵母菌的酒精耐性影响最大。
4.1 质膜与酵母酒精耐性的关系
虽然，细胞质膜对于亲水分子是一个有效的屏障，但小分子量的两性分子如酒精不需要特殊的透性酶就可自由进出细胞。因此，细胞内外的酒精浓度是一致的。目前已发现酵母细胞中的脂肪酸含量、线粒体、麦角固醇、Mg2+、海藻糖、水分活度等与耐酒精能力有一定的关系[52]。同时，氧对提高酵母耐酒精能力非常重要，主要是因为酵母利用氧气和NADPH来产生不饱和脂肪酸，酒精存在时，酵母细胞在有氧的情况下才能生长。此外，氧也影响到麦角固醇合成，而麦角固醇是一种细胞脂膜固醇，它有利于提高膜的稳定性。实验证实，当有酒精存在时，在高浓度酒精环境下添加不饱和脂肪酸和麦角固醇有利于保持酵母细胞质膜的稳定。同时，当有酒精存在时，酵母在微量有氧条件下生长也会导致膜中麦角固醇含量增加。
4.1.1脂肪酸
实验指出，脂肪酸的存在与否可以弱化乙醇对细胞膜透性功能的影响，减少细胞内溶物渗出。例如，生长在含7.5%（V/V）乙醇环境中的酵母菌，其膜脂中油酸的含量为34%；相反，当在未添加乙醇的介质中培养酵母菌时，其膜脂油酸的含量仅为17%。显然，当酒精存在时，细胞膜中所增加的脂肪酸是不饱和的。Kajiwara[53]的实验也证实了这一说法，他将酵母菌Arabidopsis thaliana中编码饱和脂肪酸的去饱和作用基因（OLE1）转移到酿酒酵母上，基因表达的结果是50%的饱和脂肪酸转变为不饱和脂肪酸（C16：2和C18：2型），使酿酒酵母在高酒精度的环境中仍能表现出较高的活性。
细胞膜含有较多的长链脂肪酸可以增加疏水区的表面积和范德华作用，降低极性，细胞含有较多长链饱和脂肪酸有助于酵母更快地从细胞中除去乙醇，恢复细胞膜的渗透功能[54]。Chi
[55]的实验证实了这一点，认为细胞膜中含有较多的长链饱和脂肪酸时，细胞产生酒精的速度更快，酒精的耐性更高，用18%（V/V）的酒精冲击酵母细胞时，长链饱和脂肪酸含量高的菌株死亡率明显低于含量低的菌株。通过比较耐酒精酵母和酒精敏感酵母的细胞膜组成，Chi发现前者在培养过程中能合成较多的饱和脂肪酸，而且在高浓度乙醇冲击中，死亡速率明显低于后者。此外，他也发现有些高产酒精酵母菌株可以合成大量的C10：0脂肪酸。这意味着增加短链脂肪酸的量一样可以提高膜的流动性。综合上述，可以看出，在不同条件下，不同的脂肪酸类型对菌株的耐酒精能力的影响程度是不同的。
4.1.2麦角固醇
麦角固醇含量占酵母细胞膜成分的6％，具有调节细胞膜功能的作用。1976年，Demel证实麦角固醇能提高膜的液化和缩合，从而对膜发挥调节作用，是酵母的厌氧生长因子。在啤酒发酵时，与普通酵母产乙醇量相比，拥有较高含量麦角固醇的Ale啤酒酵母其发酵液中的酒精含量也较高。Casey等人[56]认为在培养基中加入外源麦角固醇有利于提高酿酒酵母的酒精抗性。与酒精敏感菌株相比，池振明等人[57]发现酵母高产酒精菌株在培养中能合成更多的麦角固醇，这些酵母在高浓度酒精冲击过程中，死亡速率明显降低。
4.1.3线粒体
雪利酒中的酵母可耐受15％（V/V）以上的酒精，这些菌株线粒体完全缺失。Ibeas等人[58]认为酒精可造成酵母菌的呼吸缺陷型，当酵母菌在高浓度酒精下生长时容易出现分解代谢物阻遏，造成酵母菌细胞中的线粒体丢失。Chi等人[59]认为耐酒精能力高的菌株表现出较低的呼吸突变型的突变率。目前，酒精造成呼吸缺陷的机制还不清楚。
4.1.4海藻糖
海藻糖有稳定细胞膜和蛋白质，保护细胞的功能。海藻糖可以使处在各种不利条件下的酵母菌细胞维持其结构。在培养基中加入海藻糖，可以明显地提高酵母的发酵性能[60]。Odumeru等人[61,62]发现用酒精冲击酒精酵母后，细胞内的海藻糖含量明显增加，同时发酵时酒精含量明显增加。Mansure等人[63]发现当酵母菌细胞含有高浓度海藻糖时，可以抑制由酒精引起的细胞内含物的泄漏，提高酵母菌细胞在酒精培养基中的存活率。Majara[62]分析了下层酵母细胞中海藻糖的含量与高酒精环境的关系，指出在高乙醇环境下海藻糖的含量会立刻发生变化，在酵母细胞生长中海藻糖一方面作为碳源被消耗掉，另一方面又不断地合成和积累，但总趋势是海藻糖含量随酒精浓度增加而增加。
4.1.5 Mg2+
酵母细胞膜中最重要的酶是需Mg2+激活的腺苷三磷酸（ATP）酶，它在pH中性环境下作用，对某些溶质的主动运输产生重要作用。例如，Panaretou[64]在培养基中加入一定量的Mg2+后可以提高酵母的酒精耐性。Walker[65]认为Mg2+的利用率可以影响到酒精的产量，而Mg2+的利用率又与酵母是否处于对数生长期、高浓度酒精的持续时间以及最小的可利用葡萄糖浓度有关。
就酵母菌耐酒精的分子机制研究表明，细胞的许多基因控制着酵母菌的耐酒精特性。例如，Ogawa等人[66]认为，酵母细胞暴露于酒精后，有些逆境反应基因的表达程度提高。Alexandna[67]认为，酵母经过酒精冲击后，除了乙醇应激基因的表达上升外，与离子平衡、热保护、海藻糖合成和氧化保护等相关基因的表达也被提高。
4.2 培养条件对酵母酒精耐性的影响
发酵初期，在高浓度酒精发酵中，较高的底物浓度常给酵母细胞形成一个高渗透压环境，高渗透压条件会阻碍酵母产生的乙醇向培养基中扩散，从而使细胞内的酒精对酵母细胞产生毒害作用。因此，减小环境的渗透压有利于维持细胞的高存活率。显然，发酵期间改变底物的流加条件可以克服这个问题。
4.3 培养基组成对酵母菌酒精耐性的影响
无机盐、基质浓度、溶氧、pH等因素都会影响酵母对酒精的耐性。选择合适的营养物质和添加量，有利于改善酵母的生长环境，提高最终发酵的酒精含量，缩短发酵周期。张书祥[71]以瓜干为原料生产酒精，通过添加适宜比例的氯化钠、硝酸钾、氧化钙及其复合盐，结果使酒精度提高了0.1%～2%（V/V），使发酵周期缩短30～36h。Casey[72]指出，添加脂类、蛋白质和维生素可以促进酒精发酵，提高最终乙醇的浓度。Thomas等人[73]发现，在高浓度发酵条件下，加入甘氨酸和脯氨酸等渗透压保护剂，有助于增加酒精产量和酵母菌存活率，提高糖的利用率。Jones[74]认为，在糖化醪中补充氮源可以缩短浓醪酒精发酵周期，提高最终产量。
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