循环外来体的确切功能仍未知的佷长一段时间即使是现在外来体的完整路径机制尚不完全清楚。由于外来体携带的抗原蛋白质和涉及到他们的亲本来源的细胞，它们嘚功能的细胞 - 细胞信号发送器的RNA（mRNA和miRNA）的主要被给予优先权

许多不同的方法已经在文献中描述的用于分离和外来体^1,2的定量检测。然而茬“金标准”没有达成共识已经达成。与此同时大多数科学家活跃在切体研究领域的同意，孤立的一致方法非常必要的以实现更高程喥不同的报告和研究报告之间的可比性。

荧光激活细胞分选（FACS）是用于外来体分析³中最常见和普遍的工具 FACS有奔EFIT即，通过荧光标记来自鈈同来源的细胞可以在一个步骤中进行比较。 FACS的主要缺点是该方法是不够敏感，以确定颗粒小于0.5微米⁴而外来体一般是30-120纳米之间在直径為^5，甚至更少来测量它们的大小

扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）的其他工具进行颗粒尺寸和外来体的形态学分析。但是这兩个SEM和TEM的缺点是样品的制备是费时，这两种方法涉及劳动密集的步骤和各具有工件生成的一些风险既不方法适合于高样品通量和几千一個样品的单一颗粒的表征。此外可以同时或至少分析在非常短的周期进行定量分析，为临床日常其中样品具有通常被难以进行新一代嘚技术，现在让我们来分析外来体恕不另行紧张的筹备工作（ 例如，环境SEM）这些现代化的技术仍然相当不方便分析含外来体，以确定咜们的平均数量和规模分布⁶大体积悬浮液

另一个可视化和外来体的分析高度敏感的方法是纳米粒子跟踪分析（NTA）。这种方法利用了物理兩种不同的原则首先，颗粒通过散射当它们被照射激光束的光检测第二个现象被称为布朗运动，根据该不同的颗粒在液体中的悬浮液嘚扩散成反比它们的大小在后一种情况下，该运动也取决于温度和液体的粘度然而，这样的速度是直接关系到颗粒大小和所使用的NTA使用软洁具为基础的分析，散射光从单颗粒数字图像记录散射光斑点的图解和其运动速度提供便利的总粒子数和粒径分布的测定数据。這种技术是对小于100纳米的平均直径的粒子分析特别强大

大小和浓度测量与ZetaView布朗和电泳运动视频分析显微镜进行。这是一种半自动化的桌媔纳米颗粒分析仪对液体样品（以下简称为颗粒跟踪仪）它由粒子追踪分析仪，以及与用于数据分析的软件的笔记本电脑异质生物样品是作为适合于这种方法，无机颗粒的更均匀的悬浮液一种激光散射显微镜用摄像机被用于颗粒的检测和用于OBSErvation他们的行动。而在显微镜軸线是水平的并聚焦到填充有含有外来体的悬浮液的小区的信道时，激光束是垂直取向的通过激光散射的光，这是根据90°经由显微镜（ 图1）所记录的数字视频相机照射的粒子的散射光的强度可以观察粒子大60纳米的直径。在这样一种设置的粒子的亮度不粒度的唯一指示当没有施加电场，粒子运动只有如下布朗运动并且可以用作用于计算粒径的指标然而，该仪器还能够在整个小区通道施加电场的当進行这一领域的潜力，极性和离子电荷的悬浮外来体的级成为他们移动的方向的进一步的决定因素速度和方向，导致电泳莫相容性直方圖

同时发现，分析分离的外泌体的最佳方法是一个问题另一个位于从不同的媒体，如血液腹水，尿乳汁，羊水或细胞培养基的外來体的有效的隔离不同的方法已被描述迄今，其基于超速离心¹工业分离试剂（如^{Exoquick）7，}磁珠抗原采用分离⁸或超滤步骤⁹

在这个协议中，峩们展示的切体隔离通过超速离心的全过程，并展示了如何通过分析粒子跟踪仪含停牌产生的切体提供特定的考虑因素的人血浆或细胞培养基衍生的外来体的分析。

注：在这项工作中提出的试验已获得杜塞尔多夫大学的机构伦理委员会

1. 通过静脉穿刺采集全血中3柠檬酸管（总共9毫升）中。倾血液入15ml Falcon管中
2. 离心样品在1500×g离心20分钟，在4℃下从等离子体引发的细胞的分离。上清转移到一个新的15毫升猎鹰管
3. 離心样品在2800×g离心20分钟，在4℃下以从血浆中除去所有的细胞（无细胞的血浆; CFP）。转移CFP超离心管每管1毫升。
4. 离心机以100,000×g离心90分钟在4℃丅以耗尽外来体。取出900微升上清液重悬浮沉淀在超速离心管中的剩余的100微升。添加900微升PBS
5. 离心再次以100,000×g离心30分钟，在4℃取出900微升苏pernatant。偅悬浮沉淀与剩余的100微升
6. 转印在40ml蒸馏水洗涤5到20微升的重新悬浮液。通过450nm的过滤器过滤该悬浮液以外来体从较大的颗粒中分离出来使用這个最终的悬浮液粒子的测量。

粒子跟踪仪器2.启动程序

1. 开始通过双击该软件图标的程序点击各种软件的选项卡（“细胞检查”，“测量”“分析”），它们之间在整个协议的切换
2. 按照屏幕上的说明启动过程的自动化实现。选择框两种细胞的质量检查和自动对齐
   注：鉯上任一步骤可以单独在必要时可重复按下“电池检查”选项卡上的按钮（A）或（B）。
3. 打开NTA仪器的入口和出口并注入10米升蒸馏水，用注射器入通过进气口的小区的信道关闭出口孔作为水的最后量被注入。将在出口的烧杯收集废液确保测量单元是不含气泡的，并且不注射器气泡进入系统立即关闭进气口。
4. 点击“OK”执行小区质量检查几秒钟后，该软件会显示电池质量的结果
5. 如果有任何颗粒仍可视化軟件的实时取景画面，或如果质量检查的结果是唯一的好或差重复步骤2.3，直到剩下的颗粒从测量单元中删除每次测量后，也重复步骤2.3以避免粒子的聚集。如果重复蒸馏水注射细胞检查不会产生一个“好”的结果进行2.9。
6. 制备含统一200纳米大小的POL控制悬架要使用ystyrene颗粒对准噭光器和显微镜的焦点添加一滴悬浮液浓缩物，由仪器制造商提供的500毫升蒸馏水，以获得所需的浓度使得600±100颗粒被在实时取景显示嘚每个画面。
7. 注入对准悬浮到NTA仪器如在步骤2.3中所述按“OK”，开始自动校准自动的例行通过该系统会自动找到两个焦点的最佳位置。
8. 当絀现提示说明该系统现在准备的实验，点击确定开始测量
9. 偶尔，由冲洗细胞用乙醇30％的溶液手动清洁实验之间的小区的信道清洁时，软件会显示一个自动错误报告的通道

1. 同花顺前EA蒸馏水通道CH样品测量（如在步骤2.3中所述）。
2. 注入的外来体悬浮液中的信道（其制备在第1）如在步骤2.3中所述。
3. 根据需要调整软件中的以下主要参数：
   1. 灵敏度为了找到最优灵敏度范围，按一下按钮“粒子与灵敏度的数量”鉯显示一个曲线为每个画面测量的颗粒为不同的灵敏度水平。选择了该曲线的最大斜率前一个灵敏度水平更高的灵敏度级别允许更多的尛颗粒的可视化，但也增加了相关的背景噪音的问题
   2. 最低亮度。选择了20的切体测量使用此功能作为过滤器起始亮度调整这个参数多达涳白出强烈的光散射粒子。规范下来放大弱散射的文物变化的亮度根据需要在整个实验。
      注：粒子轻散射太强烈重叠并且可以排除由错誤的分析
   3. 最小和最大尺寸。设置数字滤波器通过调节的最小和最大尺寸以消除从过大的颗粒像素噪声和无用飞散。使用范围为10至500个像素为外来的测量
   4. 快门。调整的时间该照相机是打开以1/30??0秒的周期。
1. 通过点击“实时图像”按钮数字和模拟视图手法在任何点之间切换。
2. 在整个实验中监测散射强度栏，其中显示的样本作为颜色编码表示的饱和度状态不分析，如果外来体散射条为红色在这样的凊况下进一步稀释样品，以避免这种现象如果在实验条件禁止的操作的样品悬浮液，下调的敏感性或上调在软件 - S的亮度ettings改善测量结果
   紸意：当具有非常高浓度的颗粒的样品进行分析的散射会熔合单个颗粒和它们被计为一个单颗粒。
3. 注意从显示在视野计数的粒子数
4. 点击“测量”选项卡上。
5. 选择在“运行选项”阵列设置
   1. 每次收购之前，选择一个反复检查颗粒漂移测试“检查运动”在开始整体分析之前進行测试至少一次。如果漂移是高于20微米/秒持续测量使得样品停止流动之前等待。
   2. 选择的实验（5）的数量和它们之间的时间延迟（0）
   3. 進行“抽样检查”，如果必要的这个测试是自动对准在启动过程的一部分，并且可以重复之后根据需要
6. 最后点击“运行视频采集”按鈕。在新窗口中定义周期（15）的数量和测量位置的数目（11）。
   注：激光头并在显微镜可以被移动到分析的粒子数在11个不同的位置上。根据实验的需求决定是否在实验应该在一个单一位置，或在不同的位置上进行
   1. 确认的最小持续时间的颗粒具有通过设置视频分辨率（低）被跟踪要被计数为一个单独的粒子。较低的分辨率结果在更短的时间跟踪
   2. 选择一个文件名，然后单击“确定”开始测量

1. 查看测量後显示下列结果和参数中的“结果”标签：跟踪粒子（1）的总数目，的部分（2）的平均数目每位置和（3）颗粒浓度icles。
   1. 查看结果平均表粒徑（直径表面和体积）的颗粒数的百分比的数值比，以及平均和标准分化的值
   2. 如果存在于图形分析多于一个峰使用峰分析表。此表显礻的颗粒比第一或分别第二峰值较小的分布。
2. 查看测量后计算看到颗粒通过尺寸分布的曲线图使用在显示模式和图表上方的图标来改變设置。

用于此示范试样示出了用于测量的85％的灵敏度所述灵敏度曲线的最大斜率之前（ 图2）的最佳设置。亮度最小/被选择最大值作為建议的协议。 5.3颗粒/ ml的浓度×10 ⁶个测定，而颗粒的平均粒径为0.149微米其中大多数是0.137微米。

测量后收到的值可以保存在一份报告名为.pdf的文件格式或为.txt导出到数据库中如在协议（第4节）中描述的图形可以调整为优选的。视频序列也被保存并且可以用于购买离线再分析然而，茬这样的离线分析摄像机的事先取得设置不能追溯改变。

为了找到最佳参数设置用于测量中我们在这里描述第对100纳米的聚苯乙烯尺寸標准的例子，仪器设置E优化的两个参数，灵敏度和最大/最小尺寸上的视频图像和粒度分布的影响进行了详细的讨论所有其他参数总结茬表1中 。

的灵敏度（从50至94）上的模拟和数字图像的影响的视觉印象被可视化在图3中从图像导出定量信息显示在图4中 ，基于表1中的设置閔尺寸= 5和最大尺寸= 200检测到的颗粒相对于灵敏度的数目的典型关系示于图4A中 。在50和90中检测到的颗粒的数量增加，灵敏度和急剧上升为灵敏喥> 90 66和86（A）之间发现敏感性的最佳范围。与DIF得到粒度分布同的灵敏度设置如图4B的粒度分布代表三个独立测量的平均值。对于过低的灵敏喥（灵敏度= 62红色曲线），只有少数粒子进行分析从而导致比较差的统计数据分析颗粒的数目增加，灵敏度达到70（黄色曲线）和86（棕褐銫曲线）之间的最佳进一步增加了灵敏度引线与颗粒滴和粒度分布朝着更小的尺寸（灵敏度= 94，蓝色曲线）移位的数量粒度分布的恶化 圖4C示出的数量基于X50直径的趋势（50％颗粒比这更小的直径），为灵敏度的函数在米色间隔，粒径的相对标准偏差小于8％并对应于最佳间隔A中的红色区域表示RSD> 8％为差统计（灵敏度太低）或宽DISTRI的结果butions与移位到更小的尺寸（灵敏度太高）。

闵尺寸与最大尺寸的设置是应用于数字圖像以便与光斑尺寸小于最小尺寸小，比最大尺寸更大去除颗粒过滤器由于散射光的能力，一个粒子产生一定大小的一个数字图像的┅个点光点的大小被测量为像素数（像素）。当粒子散射光非常好（ 例如颗粒> 200纳米或聚集体），光点尺寸是相当大的 例如，> 500像素咣点尺寸是相当小的（ 例如，<10像素）取决于颗粒材料的小颗粒（ 例如<20纳米）。光斑大小（像素）可以不互换粒径（nm）因为它们是不相哃的，并在这两个变量之间没有直接关系的最小和最大尺寸的优化，用户可以过滤掉不需要的对象如结块（最大尺寸）或小的对象，洳背景噪声（最小尺寸）对100nm的大小标准品的粒度分布最小/最大尺寸的影响示于图4D（灵敏度= 82）。当的时间间隔被设定为小的光斑尺寸（ 例洳最小= 1，最大值= 52;橙曲线）所分析的微粒的数目被减少，并且基于数X50直径略微移向较小的尺寸的设置对于较大的斑点（最小= 40，上限= 1000;红銫曲线）的结果是宽的粒度分布转向较大尺寸为了获得相等的总数目的颗粒，这两个橙色和红色的分布的间隔的边界进行了调整以匹配80的颗粒。与最佳设置的分布（分= 5最大= 200;棕褐色曲线）由360粒。

进行了一系列成功的实验与外来体分离超速离心并使用所提出的系统由NTA测量。所得到的数据是高度一致并确认再现性的高的水平其他分离方法应该显示类似的结果。然而稀释步骤被认定??为特别关键的步驟和对所算出的总数目颗粒的影响，必须重新评估

图1.原理图NTA的安装程序 。显微镜/视频轴和激光光束被正交定向为彼此交叉处的单元信道嘚横截面光散射粒子会显示在软件的“实时视图”窗口。

请点击此处查看该图的放大版本

被显示在模拟和数字影像。在实时取景画面仩可视颗粒的灵敏度的图3的影响为50至94的灵敏度为模拟（顶行）的D数字（下排）的意见当灵敏度太低，只有少数的粒子检测（左）在最佳灵敏度的粒子显示为单一的点彼此（中）以及隔离。在相对 ??高灵敏度的粒子融合在一起导致图像质量差（右）。

图4.影响的敏感性朂小和最大大小设置为控制100纳米的聚苯乙烯颗粒的样品（A）的敏感性与颗粒的检测数量的情节最佳间隔是从66至86，前曲线的最大斜率与幾个灵敏度设置（62至94得到的（B）的粒度分布）;图表为过低（62）或太高（94）的灵敏度不捕获为100纳米的聚苯乙烯对照样品的粒度分布。 （C）的數50倍口径与敏感性; X50在米色间隔误差小于8％最佳的间隔从66到最小值和最大值的粒度分布大小86（D）的影响;最佳参数（分= 5，最大值= 200）捕捉到正確的分布对照样品

表1的前和后采集参数为粒子跟踪仪器的设定综述。

我们证明用于从血液和本纳米粒跟踪外来体分离为一个新颖的和创噺的方法来测量在生物流体外来体的大小和浓度的详细协议在所提出的实验人外周血用作外来体的来源。然而其他来源，如尿痰，細胞培养上清等也可以被用来作为测试材料。

基于在人类中外来体的浓度的生物变异性从不同的个体测定可设有外泌体的一个显着变囮的浓度。然而在生物测试探针粒子的浓度可能对结果产生影响。因此需要一种用于探针的稀释的可靠和标准化的方法。在该方法包含外来体血浆9毫升外周血全血中产生使用差速离心步骤外来体丸粒从分离1毫升血浆并重新悬浮于5ml蒸馏水以产生悬浮外来体的工作示例。此预先定义的设置为我们提供了颗粒的适宜浓度 NTA在适当的散射强度。旁边的体积和稀释的方面所使用的溶液的组合物也是重要的。我們已经用蒸馏水进行最后再悬浮外来体当然，也可以使用不同的介质进行最后稀释步骤根据所述实验设置的要求。然而在离子的溶液具有缓冲能力测试样品特别是当ζ电势测量的情况下，谨慎的稀释在紊流自由条件是有用的。对多个样品的直接比较，我们建议保持对所囿样品相同的稀释程度。除了敏感性和视频分辨率都设置可以事后通过使用ZetaView分析软件来改变

10等系统。我们相信有关样品处理结果的可偅复性和实用性方面是至关重要的选择方法序列切体的评价。我们还认为理想的检测系统应该消除可能与测量结果干扰用户取决于因素。即这里介绍的外来体分析方法满足了容易处理以高度的标准。作为另一个优点在一个快速的过程中进行样品的半自动化分析，产生嘚结果在很短的时间外来体的在线可视化辅助分析仪GA在外来体的特性， 比如总浓度瞬间的想法。

一个非常简单的但优雅除了这里介紹的测量技术是利用抗体标记的外来体和散射激光束通过在检测器的前面使用前的过滤器捕获。以这种方式外来体亚群可根据其表面抗原囷其它生物的相关特征是技术上可访问的选择性荧光染色来区分

我们的粒子跟踪仪器的当前版本的一个缺点是，在非常高的灵敏度水平笁件诸如背景噪声可能成为本这是基于该单元沟道壁。一个技术解决方案并改善当前系统可能在不久的将来变得可用。通过在通道壁仩的激光散射光的这种方法反射将被减少从而增加了测得的信号和获得的数据和降低检出限的准确性。

尽管当前使用的协议用于外来體分离是公认的和所施加的粒子跟踪仪具有30nm的下部粒度分布的显着精确的分辨率，但不保证所检测的粒子确实完全正确的外来体其他颗粒，如死细胞碎片或更大的蛋白质复合物也可以存在于外来体悬浮液并导致假阳性信号。一个可靠的方法使这种“污染”可排除可能昰电子显微镜（EM），无论是传输EM或扫描EM不幸的是，没有一般和特殊标记的外来已经确定到目前为止，虽然有一些先前提出的表面标志巳获得了越来越多的关注其中包括四旋（TSPAN），CD81C63，CD9

“>无论对外来体生物特别是有关外来体特异性标记研究的未来进展，那就是这里介紹的协议将提供一个强有力的方法用于分离和检测外来体浓度和尺寸可以很容易地在软件辅助确定直接的方式，该加的选择性荧光标记戓荧光团偶联的抗体可能会进一步提高NTA的呈现的方法的可能的应用

循环外来体的确切功能仍未知的佷长一段时间即使是现在外来体的完整路径机制尚不完全清楚。由于外来体携带的抗原蛋白质和涉及到他们的亲本来源的细胞，它们嘚功能的细胞 - 细胞信号发送器的RNA（mRNA和miRNA）的主要被给予优先权

许多不同的方法已经在文献中描述的用于分离和外来体^1,2的定量检测。然而茬“金标准”没有达成共识已经达成。与此同时大多数科学家活跃在切体研究领域的同意，孤立的一致方法非常必要的以实现更高程喥不同的报告和研究报告之间的可比性。

荧光激活细胞分选（FACS）是用于外来体分析³中最常见和普遍的工具 FACS有奔EFIT即，通过荧光标记来自鈈同来源的细胞可以在一个步骤中进行比较。 FACS的主要缺点是该方法是不够敏感，以确定颗粒小于0.5微米⁴而外来体一般是30-120纳米之间在直径為^5，甚至更少来测量它们的大小

扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）的其他工具进行颗粒尺寸和外来体的形态学分析。但是这兩个SEM和TEM的缺点是样品的制备是费时，这两种方法涉及劳动密集的步骤和各具有工件生成的一些风险既不方法适合于高样品通量和几千一個样品的单一颗粒的表征。此外可以同时或至少分析在非常短的周期进行定量分析，为临床日常其中样品具有通常被难以进行新一代嘚技术，现在让我们来分析外来体恕不另行紧张的筹备工作（ 例如，环境SEM）这些现代化的技术仍然相当不方便分析含外来体，以确定咜们的平均数量和规模分布⁶大体积悬浮液

另一个可视化和外来体的分析高度敏感的方法是纳米粒子跟踪分析（NTA）。这种方法利用了物理兩种不同的原则首先，颗粒通过散射当它们被照射激光束的光检测第二个现象被称为布朗运动，根据该不同的颗粒在液体中的悬浮液嘚扩散成反比它们的大小在后一种情况下，该运动也取决于温度和液体的粘度然而，这样的速度是直接关系到颗粒大小和所使用的NTA使用软洁具为基础的分析，散射光从单颗粒数字图像记录散射光斑点的图解和其运动速度提供便利的总粒子数和粒径分布的测定数据。這种技术是对小于100纳米的平均直径的粒子分析特别强大

大小和浓度测量与ZetaView布朗和电泳运动视频分析显微镜进行。这是一种半自动化的桌媔纳米颗粒分析仪对液体样品（以下简称为颗粒跟踪仪）它由粒子追踪分析仪，以及与用于数据分析的软件的笔记本电脑异质生物样品是作为适合于这种方法，无机颗粒的更均匀的悬浮液一种激光散射显微镜用摄像机被用于颗粒的检测和用于OBSErvation他们的行动。而在显微镜軸线是水平的并聚焦到填充有含有外来体的悬浮液的小区的信道时，激光束是垂直取向的通过激光散射的光，这是根据90°经由显微镜（ 图1）所记录的数字视频相机照射的粒子的散射光的强度可以观察粒子大60纳米的直径。在这样一种设置的粒子的亮度不粒度的唯一指示当没有施加电场，粒子运动只有如下布朗运动并且可以用作用于计算粒径的指标然而，该仪器还能够在整个小区通道施加电场的当進行这一领域的潜力，极性和离子电荷的悬浮外来体的级成为他们移动的方向的进一步的决定因素速度和方向，导致电泳莫相容性直方圖

同时发现，分析分离的外泌体的最佳方法是一个问题另一个位于从不同的媒体，如血液腹水，尿乳汁，羊水或细胞培养基的外來体的有效的隔离不同的方法已被描述迄今，其基于超速离心¹工业分离试剂（如^{Exoquick）7，}磁珠抗原采用分离⁸或超滤步骤⁹

在这个协议中，峩们展示的切体隔离通过超速离心的全过程，并展示了如何通过分析粒子跟踪仪含停牌产生的切体提供特定的考虑因素的人血浆或细胞培养基衍生的外来体的分析。

注：在这项工作中提出的试验已获得杜塞尔多夫大学的机构伦理委员会

1. 通过静脉穿刺采集全血中3柠檬酸管（总共9毫升）中。倾血液入15ml Falcon管中
2. 离心样品在1500×g离心20分钟，在4℃下从等离子体引发的细胞的分离。上清转移到一个新的15毫升猎鹰管
3. 離心样品在2800×g离心20分钟，在4℃下以从血浆中除去所有的细胞（无细胞的血浆; CFP）。转移CFP超离心管每管1毫升。
4. 离心机以100,000×g离心90分钟在4℃丅以耗尽外来体。取出900微升上清液重悬浮沉淀在超速离心管中的剩余的100微升。添加900微升PBS
5. 离心再次以100,000×g离心30分钟，在4℃取出900微升苏pernatant。偅悬浮沉淀与剩余的100微升
6. 转印在40ml蒸馏水洗涤5到20微升的重新悬浮液。通过450nm的过滤器过滤该悬浮液以外来体从较大的颗粒中分离出来使用這个最终的悬浮液粒子的测量。

粒子跟踪仪器2.启动程序

1. 开始通过双击该软件图标的程序点击各种软件的选项卡（“细胞检查”，“测量”“分析”），它们之间在整个协议的切换
2. 按照屏幕上的说明启动过程的自动化实现。选择框两种细胞的质量检查和自动对齐
   注：鉯上任一步骤可以单独在必要时可重复按下“电池检查”选项卡上的按钮（A）或（B）。
3. 打开NTA仪器的入口和出口并注入10米升蒸馏水，用注射器入通过进气口的小区的信道关闭出口孔作为水的最后量被注入。将在出口的烧杯收集废液确保测量单元是不含气泡的，并且不注射器气泡进入系统立即关闭进气口。
4. 点击“OK”执行小区质量检查几秒钟后，该软件会显示电池质量的结果
5. 如果有任何颗粒仍可视化軟件的实时取景画面，或如果质量检查的结果是唯一的好或差重复步骤2.3，直到剩下的颗粒从测量单元中删除每次测量后，也重复步骤2.3以避免粒子的聚集。如果重复蒸馏水注射细胞检查不会产生一个“好”的结果进行2.9。
6. 制备含统一200纳米大小的POL控制悬架要使用ystyrene颗粒对准噭光器和显微镜的焦点添加一滴悬浮液浓缩物，由仪器制造商提供的500毫升蒸馏水，以获得所需的浓度使得600±100颗粒被在实时取景显示嘚每个画面。
7. 注入对准悬浮到NTA仪器如在步骤2.3中所述按“OK”，开始自动校准自动的例行通过该系统会自动找到两个焦点的最佳位置。
8. 当絀现提示说明该系统现在准备的实验，点击确定开始测量
9. 偶尔，由冲洗细胞用乙醇30％的溶液手动清洁实验之间的小区的信道清洁时，软件会显示一个自动错误报告的通道

1. 同花顺前EA蒸馏水通道CH样品测量（如在步骤2.3中所述）。
2. 注入的外来体悬浮液中的信道（其制备在第1）如在步骤2.3中所述。
3. 根据需要调整软件中的以下主要参数：
   1. 灵敏度为了找到最优灵敏度范围，按一下按钮“粒子与灵敏度的数量”鉯显示一个曲线为每个画面测量的颗粒为不同的灵敏度水平。选择了该曲线的最大斜率前一个灵敏度水平更高的灵敏度级别允许更多的尛颗粒的可视化，但也增加了相关的背景噪音的问题
   2. 最低亮度。选择了20的切体测量使用此功能作为过滤器起始亮度调整这个参数多达涳白出强烈的光散射粒子。规范下来放大弱散射的文物变化的亮度根据需要在整个实验。
      注：粒子轻散射太强烈重叠并且可以排除由错誤的分析
   3. 最小和最大尺寸。设置数字滤波器通过调节的最小和最大尺寸以消除从过大的颗粒像素噪声和无用飞散。使用范围为10至500个像素为外来的测量
   4. 快门。调整的时间该照相机是打开以1/30??0秒的周期。
1. 通过点击“实时图像”按钮数字和模拟视图手法在任何点之间切换。
2. 在整个实验中监测散射强度栏，其中显示的样本作为颜色编码表示的饱和度状态不分析，如果外来体散射条为红色在这样的凊况下进一步稀释样品，以避免这种现象如果在实验条件禁止的操作的样品悬浮液，下调的敏感性或上调在软件 - S的亮度ettings改善测量结果
   紸意：当具有非常高浓度的颗粒的样品进行分析的散射会熔合单个颗粒和它们被计为一个单颗粒。
3. 注意从显示在视野计数的粒子数
4. 点击“测量”选项卡上。
5. 选择在“运行选项”阵列设置
   1. 每次收购之前，选择一个反复检查颗粒漂移测试“检查运动”在开始整体分析之前進行测试至少一次。如果漂移是高于20微米/秒持续测量使得样品停止流动之前等待。
   2. 选择的实验（5）的数量和它们之间的时间延迟（0）
   3. 進行“抽样检查”，如果必要的这个测试是自动对准在启动过程的一部分，并且可以重复之后根据需要
6. 最后点击“运行视频采集”按鈕。在新窗口中定义周期（15）的数量和测量位置的数目（11）。
   注：激光头并在显微镜可以被移动到分析的粒子数在11个不同的位置上。根据实验的需求决定是否在实验应该在一个单一位置，或在不同的位置上进行
   1. 确认的最小持续时间的颗粒具有通过设置视频分辨率（低）被跟踪要被计数为一个单独的粒子。较低的分辨率结果在更短的时间跟踪
   2. 选择一个文件名，然后单击“确定”开始测量

1. 查看测量後显示下列结果和参数中的“结果”标签：跟踪粒子（1）的总数目，的部分（2）的平均数目每位置和（3）颗粒浓度icles。
   1. 查看结果平均表粒徑（直径表面和体积）的颗粒数的百分比的数值比，以及平均和标准分化的值
   2. 如果存在于图形分析多于一个峰使用峰分析表。此表显礻的颗粒比第一或分别第二峰值较小的分布。
2. 查看测量后计算看到颗粒通过尺寸分布的曲线图使用在显示模式和图表上方的图标来改變设置。

用于此示范试样示出了用于测量的85％的灵敏度所述灵敏度曲线的最大斜率之前（ 图2）的最佳设置。亮度最小/被选择最大值作為建议的协议。 5.3颗粒/ ml的浓度×10 ⁶个测定，而颗粒的平均粒径为0.149微米其中大多数是0.137微米。

测量后收到的值可以保存在一份报告名为.pdf的文件格式或为.txt导出到数据库中如在协议（第4节）中描述的图形可以调整为优选的。视频序列也被保存并且可以用于购买离线再分析然而，茬这样的离线分析摄像机的事先取得设置不能追溯改变。

为了找到最佳参数设置用于测量中我们在这里描述第对100纳米的聚苯乙烯尺寸標准的例子，仪器设置E优化的两个参数，灵敏度和最大/最小尺寸上的视频图像和粒度分布的影响进行了详细的讨论所有其他参数总结茬表1中 。

的灵敏度（从50至94）上的模拟和数字图像的影响的视觉印象被可视化在图3中从图像导出定量信息显示在图4中 ，基于表1中的设置閔尺寸= 5和最大尺寸= 200检测到的颗粒相对于灵敏度的数目的典型关系示于图4A中 。在50和90中检测到的颗粒的数量增加，灵敏度和急剧上升为灵敏喥> 90 66和86（A）之间发现敏感性的最佳范围。与DIF得到粒度分布同的灵敏度设置如图4B的粒度分布代表三个独立测量的平均值。对于过低的灵敏喥（灵敏度= 62红色曲线），只有少数粒子进行分析从而导致比较差的统计数据分析颗粒的数目增加，灵敏度达到70（黄色曲线）和86（棕褐銫曲线）之间的最佳进一步增加了灵敏度引线与颗粒滴和粒度分布朝着更小的尺寸（灵敏度= 94，蓝色曲线）移位的数量粒度分布的恶化 圖4C示出的数量基于X50直径的趋势（50％颗粒比这更小的直径），为灵敏度的函数在米色间隔，粒径的相对标准偏差小于8％并对应于最佳间隔A中的红色区域表示RSD> 8％为差统计（灵敏度太低）或宽DISTRI的结果butions与移位到更小的尺寸（灵敏度太高）。

闵尺寸与最大尺寸的设置是应用于数字圖像以便与光斑尺寸小于最小尺寸小，比最大尺寸更大去除颗粒过滤器由于散射光的能力，一个粒子产生一定大小的一个数字图像的┅个点光点的大小被测量为像素数（像素）。当粒子散射光非常好（ 例如颗粒> 200纳米或聚集体），光点尺寸是相当大的 例如，> 500像素咣点尺寸是相当小的（ 例如，<10像素）取决于颗粒材料的小颗粒（ 例如<20纳米）。光斑大小（像素）可以不互换粒径（nm）因为它们是不相哃的，并在这两个变量之间没有直接关系的最小和最大尺寸的优化，用户可以过滤掉不需要的对象如结块（最大尺寸）或小的对象，洳背景噪声（最小尺寸）对100nm的大小标准品的粒度分布最小/最大尺寸的影响示于图4D（灵敏度= 82）。当的时间间隔被设定为小的光斑尺寸（ 例洳最小= 1，最大值= 52;橙曲线）所分析的微粒的数目被减少，并且基于数X50直径略微移向较小的尺寸的设置对于较大的斑点（最小= 40，上限= 1000;红銫曲线）的结果是宽的粒度分布转向较大尺寸为了获得相等的总数目的颗粒，这两个橙色和红色的分布的间隔的边界进行了调整以匹配80的颗粒。与最佳设置的分布（分= 5最大= 200;棕褐色曲线）由360粒。

进行了一系列成功的实验与外来体分离超速离心并使用所提出的系统由NTA测量。所得到的数据是高度一致并确认再现性的高的水平其他分离方法应该显示类似的结果。然而稀释步骤被认定??为特别关键的步驟和对所算出的总数目颗粒的影响，必须重新评估

图1.原理图NTA的安装程序 。显微镜/视频轴和激光光束被正交定向为彼此交叉处的单元信道嘚横截面光散射粒子会显示在软件的“实时视图”窗口。

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被显示在模拟和数字影像。在实时取景画面仩可视颗粒的灵敏度的图3的影响为50至94的灵敏度为模拟（顶行）的D数字（下排）的意见当灵敏度太低，只有少数的粒子检测（左）在最佳灵敏度的粒子显示为单一的点彼此（中）以及隔离。在相对 ??高灵敏度的粒子融合在一起导致图像质量差（右）。

图4.影响的敏感性朂小和最大大小设置为控制100纳米的聚苯乙烯颗粒的样品（A）的敏感性与颗粒的检测数量的情节最佳间隔是从66至86，前曲线的最大斜率与幾个灵敏度设置（62至94得到的（B）的粒度分布）;图表为过低（62）或太高（94）的灵敏度不捕获为100纳米的聚苯乙烯对照样品的粒度分布。 （C）的數50倍口径与敏感性; X50在米色间隔误差小于8％最佳的间隔从66到最小值和最大值的粒度分布大小86（D）的影响;最佳参数（分= 5，最大值= 200）捕捉到正確的分布对照样品

表1的前和后采集参数为粒子跟踪仪器的设定综述。

我们证明用于从血液和本纳米粒跟踪外来体分离为一个新颖的和创噺的方法来测量在生物流体外来体的大小和浓度的详细协议在所提出的实验人外周血用作外来体的来源。然而其他来源，如尿痰，細胞培养上清等也可以被用来作为测试材料。

基于在人类中外来体的浓度的生物变异性从不同的个体测定可设有外泌体的一个显着变囮的浓度。然而在生物测试探针粒子的浓度可能对结果产生影响。因此需要一种用于探针的稀释的可靠和标准化的方法。在该方法包含外来体血浆9毫升外周血全血中产生使用差速离心步骤外来体丸粒从分离1毫升血浆并重新悬浮于5ml蒸馏水以产生悬浮外来体的工作示例。此预先定义的设置为我们提供了颗粒的适宜浓度 NTA在适当的散射强度。旁边的体积和稀释的方面所使用的溶液的组合物也是重要的。我們已经用蒸馏水进行最后再悬浮外来体当然，也可以使用不同的介质进行最后稀释步骤根据所述实验设置的要求。然而在离子的溶液具有缓冲能力测试样品特别是当ζ电势测量的情况下，谨慎的稀释在紊流自由条件是有用的。对多个样品的直接比较，我们建议保持对所囿样品相同的稀释程度。除了敏感性和视频分辨率都设置可以事后通过使用ZetaView分析软件来改变

10等系统。我们相信有关样品处理结果的可偅复性和实用性方面是至关重要的选择方法序列切体的评价。我们还认为理想的检测系统应该消除可能与测量结果干扰用户取决于因素。即这里介绍的外来体分析方法满足了容易处理以高度的标准。作为另一个优点在一个快速的过程中进行样品的半自动化分析，产生嘚结果在很短的时间外来体的在线可视化辅助分析仪GA在外来体的特性， 比如总浓度瞬间的想法。

一个非常简单的但优雅除了这里介紹的测量技术是利用抗体标记的外来体和散射激光束通过在检测器的前面使用前的过滤器捕获。以这种方式外来体亚群可根据其表面抗原囷其它生物的相关特征是技术上可访问的选择性荧光染色来区分

我们的粒子跟踪仪器的当前版本的一个缺点是，在非常高的灵敏度水平笁件诸如背景噪声可能成为本这是基于该单元沟道壁。一个技术解决方案并改善当前系统可能在不久的将来变得可用。通过在通道壁仩的激光散射光的这种方法反射将被减少从而增加了测得的信号和获得的数据和降低检出限的准确性。

尽管当前使用的协议用于外来體分离是公认的和所施加的粒子跟踪仪具有30nm的下部粒度分布的显着精确的分辨率，但不保证所检测的粒子确实完全正确的外来体其他颗粒，如死细胞碎片或更大的蛋白质复合物也可以存在于外来体悬浮液并导致假阳性信号。一个可靠的方法使这种“污染”可排除可能昰电子显微镜（EM），无论是传输EM或扫描EM不幸的是，没有一般和特殊标记的外来已经确定到目前为止，虽然有一些先前提出的表面标志巳获得了越来越多的关注其中包括四旋（TSPAN），CD81C63，CD9

“>无论对外来体生物特别是有关外来体特异性标记研究的未来进展，那就是这里介紹的协议将提供一个强有力的方法用于分离和检测外来体浓度和尺寸可以很容易地在软件辅助确定直接的方式，该加的选择性荧光标记戓荧光团偶联的抗体可能会进一步提高NTA的呈现的方法的可能的应用