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【求助】oligo DNA的退火问题 (急！！！)
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这个帖子发布于9年零31天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
请教各位高手：我化学合成了两条互补的oligo DNA，磷酸化后要退火成双链。现存在的问题是，按照T4多核苷酸激酶的反应体系磷酸化后，oligo DNA的终浓度是1uM,而oligo DNA退火的反应体系要求oligo DNA的浓度为1 ug/ul（即48uM，oligo DNA的分子量是20755），而该体系的终浓度仅为20ul。请问该如何解决？？是否有更优化的oligo DNA退火的反应体系？请求赐教！！！
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你是要做RNAi?我们的oligo DNA都不磷酸化，退火后直接和载体连接就可以
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1。可以考虑先退火合成双链，再去磷酸化；2。oligo DNA退火合成双链的反应很容易进行的，浓度应该没那么严格的要求，还有反应体系不是一定的，可以20也可以50ul，具体的LZ得自己分析了；3。至于oligo DNA退火的反应体系，我一般就是10uM，94度5min，50度10min，当然具体还得看oligo DNA的长度、GC含量（退火温度）了，还有实验目的！
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多谢两位！1、我合成的oligo DNA两端都是羟基，必须磷酸化，才能和载体连接。2、先退火后磷酸化，将会把退火缓冲液引入磷酸化体系中，是否会影响磷酸化？3、常用的退火缓冲液是 10X annealing buffer: 200mM Tris–HCl, pH 7.5, 500mM NaCl, 100mM MgCl2，上海生工给出的退火缓冲液是 10mM Tris, pH 7.5 - 8.0, 50mM NaCl, 1mM EDTA，生工的缓冲液是 1X annealing buffer吗？请求赐教！！！不胜感谢！！！
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可以先磷酸化，然后接着退火一步完成，磷酸化缓冲液可以充当退火缓冲液
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你好，我也是做小干扰的，最近合成的单链Oligo,两端都是羟基，是否需要先磷酸化呢？谢谢！等待指教……
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当然是先退火后磷酸化了，汗。。。
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关于丁香园手把手教你搞定 CRISPR/Cas9 系统操作
手把手教你搞定 CRISPR/Cas9 系统操作
今天我们邀请冰糖来介绍 lentiCRISPR v2 应用指南。lentiCRISPR v2 说明克隆 gDNA 使用 BsmBI 位点，载体可以切出一个~1.9 kb 的 filler 片段，便于 confirm 酶切成功并利于载体回收。BsmBI 的位点如图所示：酶切之后不需要 CIP 脱磷也不会自连。Cas9 的 COOH 端带有 FLAG tag, 可以 WB 或者 Immunostaining。EFS promoter 被优化的小而强，极大提高了慢病毒包装的效率。载体带有 Puromycin 抗性，可以富集转染/感染成功的细胞。参考文献：Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPRscreening. Sanjana NE, ShalemO, Zhang F. Nat Methods. ):783-4. doi:10.1038/nmeth.8/nmeth.3047 PubMed gDNA 设计说明gDNA 设计方法和原则请查看「CRISPR/Cas9 系统操作指南一」。请加颜值担当菌菌，微信号：biotalk。注明 protocol 就会给到你《CRISPR/Cas9 系统操作指南一》。对于 lentiCRISPR v2 克隆，其合成的 oligo 末端和 pX330 不同，请注意设计。举个例子说明（千万注意 oligo 的方向）载体克隆说明1.Backbone 的酶切体系与文章「CRISPR/Cas9 系统操作指南一」一样，不脱磷处理参考图 1 中的操作，脱磷处理参考图 2 中的操作。2.Oligo 的退火条件也与文章「CRISPR/Cas9 系统操作指南一」一样。注意：如果载体不脱磷，oligo 不需要磷酸化；载体脱磷参考图 2（FengZhang 提供的 protocol，设计脱磷，可以参考），oligo 就需要加磷处理。图 1图 2 病毒包装体系包装病毒使用的包装体系如下（for 100 mm dish， 6x106 293T）4 μglentiCRISPR v2-gDNA plasmid3 μgpsPAX2 packaging plasmid& &2 μgpMD2.G envelope plasmid转染条件：用细胞转染试剂 lipofiter。DNA:lipofiter=1 μg：2.5 μL收集 48 h 和 72 h 病毒上清，待用。此处病毒包装的 protocol 没有列出，如果想看，请加颜值担当菌菌，微信号：biotalk。注明 protocol 就会给到你《CRISPR/Cas9 系统操作指南一》。目的细胞系的感染转染 （2μg &plasmid/60 mm dish，细胞密度 60～80%）【v2=lentiCRISPR v2，下同】感染 （1～5 mL 病毒上清）【v2=lentiCRISPR v2，下同】KO 单克隆的获取有限稀释法：50～100 cells 均匀分到 96-well plate单克隆挑取法KO 单克隆的鉴定直接测序或者 T7E1 或者酶切鉴定：鼠尾直接 PCR 试剂盒 (快速基因型鉴定)&，直接取细胞进行 PCR，然后测序或者做 T7E1 或者酶切鉴定即可。测序看套峰T7E1 assay酶切鉴定WB 鉴定如果抗体好用，直接用 Dot blot 也很快， 通量高。文章来源：文章由冰糖授权转载
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引物合成技术服务常见问答
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&&引​物​是​如​何​合​成​的​？​
​
​目​前​引​物​合​成​基​本​采​用​固​相​亚​磷​酰​胺​三​酯​法​。​D​N​A​合​成​仪​有​很​多​种​,​无​论​采​用​什​么​机​器​合​成​,​合​成​的​原​理​都​相​同​,​主​要​差​别​在​于​合​成​产​率​的​高​低​,​试​剂​消​耗​量​的​不​同​和​单​个​循​环​用​时​的​多​少​。
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