亚硫酸氢盐处理过的DNA稳定吗?如果不立即使用，在-20可以保存多久保持稳定？
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DNA甲基化检测技术全攻略
DNA甲基化检测技术全攻略
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近年来涌现出不少DNA甲基化的检测技术，少说也有十几种。大致可以分为两类：特异位点的甲基化检测和全基因组的甲基化分析，后者也称为甲基化图谱分析(methylation profiling)。下面大家介绍一些常用的方法。
一、特异位点的甲基化检测
甲基化特异性PCR(MS-PCR)
这种方法经济实用，无需特殊仪器，因此是目前应用最为广泛的方法。在亚硫酸氢盐处理后，即可开展MS-PCR。在传统的MSP方法中，通常设计两对引物，一对MSP引物扩增经亚硫酸氢盐处理后的DNA模板，而另一对扩增未甲基化片段。若第一对引物能扩增出片段，则说明该检测位点存在甲基化，若第二对引物能扩增出片段，则说明该检测位点不存在甲基化。
这种方法灵敏度高，可用于石蜡包埋样本，且不受内切酶的限制。不过也存在一定的缺陷，你要预先知道待测片段的DNA序列，并设计出好的引物，这至关重要。另外，若存在亚硫酸氢盐处理不完全的情况，那可能导致假阳性。
亚硫酸氢盐处理+测序
这种方法一度被认为是DNA甲基化分析的金标准。它的过程如下：经过亚硫酸氢盐处理后，用PCR扩增目的片段，并对PCR产物进行测序，将序列与未经处理的序列进行比较，判断CpG位点是否发生甲基化。这种方法可靠，且精确度高，能明确目的片段中每一个CpG位点的甲基化状态，但需要大量的克隆测序，过程较为繁琐、昂贵。
联合亚硫酸氢钠的限制性内切酶分析法(COBRA)
DNA样本经亚硫酸氢盐处理后，利用PCR扩增。扩增产物纯化后用限制性内切酶(BstUI)消化。若其识别序列中的C发生完全甲基化(5mCG5mCG)，则PCR扩增后保留为CGCG，BstU I能够识别并进行切割;若待测序列中，C未发生甲基化，则PCR后转变为TGTG，BstUI识别位点丢失，不能进行切割。这样酶切产物再经电泳分离、探针杂交、扫描定量后即可得出原样本中甲基化的比例。
这种方法相对简单，可快速定量几个已知CpG位点的甲基化，且需要的样本量少。然而，它只能获得特殊酶切位点的甲基化情况，因此检测阴性不能排除样品DNA中存在甲基化的可能。
荧光定量法(Methylight)
此种方法利用TaqMan(R) 探针和PCR引物来区分甲基化和未甲基化的DNA。首先用亚硫酸氢盐处理DNA片段，并设计一个能与待测位点互补的探针，随后开展实时定量PCR。这种方法最大的优势在于其高通量和高敏感性，且无需在PCR后电泳、杂交等操作，减少了污染和操作误差。
Qiagen就提供了多种预制的MethyLight分析。EpiTect MethyLight PCR Kit包括了两条甲基化敏感的TaqMan探针和2条甲基化不敏感的PCR引物。随着目标序列甲基化状态的不同，只有FAM标记的亚硫酸氢盐转化的甲基化DNA特异的TaqMan探针，或只有VIC标记的亚硫酸氢盐转化的未甲化的DNA特异的TaqMan探针能与目标序列杂交。如果探针与DNA杂交则释放出荧光信号。信号强度与PCR产物的量成正比，据此可计算出样品的甲基化程度。
甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析
亚硫酸氢盐处理后，甲基化与未甲基化DNA会存在序列差异，这种差异可通过熔解曲线分析来发现，因为甲基化DNA含有更多的GC，相对更难熔解。根据熔解温度及峰型的变化，可轻易区分完全甲基化、完全非甲基化或杂合甲基化。高分辨率熔解(HRM)技术可检出极微小的差别。
使用这种方法进行甲基化分析仅需一对引物，相比以往的方法更加快捷、简便和精确。不过对仪器的要求颇高，需要带HRM模块的荧光定量PCR仪。目前市场上有多款PCR仪可满足要求，包括Illumina的Eco、QIAGEN的Rotor-Gene Q、罗氏 LightCycler 480等。
焦磷酸测序
焦磷酸测序技术(Pyrosequencing)作为一种新的序列分析技术，能够快速地检测甲基化的频率，对样品中的甲基化位点进行定性及定量检测，为甲基化研究提供了新的途径。
通过准确定量单个连续的CpG 位点上的甲基化频率，焦磷酸测序本身能检测并定量甲基化水平上的细微改变。在序列延伸过程中，根据C和T的掺入量来定量确定单个位点的C-T 比例。因此，不同位点的甲基化变异就能被准确检测。由于焦磷酸测序提供了真实的序列数据，甲基化状态也就以序列形式呈现。
QIAGEN目前提供三种焦磷酸测序仪器，通量由低到高，适合不同的应用。PyroMark Q24 的强项在于可对多达24个样品进行焦磷酸测序。需要大样品量的应用更适合在PyroMark Q96 ID 上进行。在考虑到处理成百上千个样品所需的大量试剂时，运行通量最大化可能会使实验成本变得很高。而PyroMark Q96 MD 装有一台高度灵敏的光检测摄像头，可以在减少试剂量的情况下对少量的DNA模板进行准确测序。
为配合焦磷酸测序，QIAGEN还推出了PyroMark CpG Assays。这些预设计的甲基化分析使用特别定制的算法来设计出焦磷酸分析所用的PCR和测序引物，从而实现了基因组内特异靶点的甲基化分析。
二、基于芯片的甲基化图谱分析
就甲基化图谱分析而言，目前流行的分析方法是芯片。多个公司都提供了这种工具，包括安捷伦的Human CpG Island Microarray Kit，Illumina的HumanMethylation27 DNA analysis BeadChip，Roche NimbleGen的Human DNA Meth 2.1M Deluxe Promoter Array和Affymetrix的seven-array GeneChip(R) Human Tiling 2.0R Array Set。
平台不同，过程也各异。安捷伦和NimbleGen的分析过程中，基因组DNA分成两份，一份用来做MeDIP，另一份作为对照。两个样品都标记荧光(富集的样品用Cy5标记，对照用Cy3标记)，然后与芯片杂交。芯片上每个探针的Cy5/Cy3强度比例显示出该区域的甲基化程度。
安捷伦的244,000-element array覆盖了27000多个人CpG岛和甲基化不足区域(UMR)。NimbleGen的Human 2.1M Deluxe Promoter array也覆盖了27000多个CpG岛，还包括了27000多个启动子区域，所有这些都是以100 bp的分辨率。然而这两个平台都不能以单核苷酸的分辨率报告甲基化状态，但是Illumina的Infinium和GoldenGate分析做得到。
Illumina的Infinium HumanMethylation27 BeadChip芯片覆盖27,578个CpG位点。分析利用两个位点特异的探针拷问这些化学上差异的位点，一个探针是为甲基化位点(M磁珠类型)设计的，而另一个是为未甲基化位点(U磁珠类型)设计的。探针的单碱基延伸掺入了一个标记的ddNTP，它随后被荧光试剂染色。通过计算甲基化与未甲基化位点的荧光信号比例，可确定拷问位点的甲基化水平。
此产品虽评价颇高，可惜目前已停产，取而代之的是Infinium HumanMethylation450 BeadChip芯片。它以单碱基分辨率覆盖了每个样品中超过45万个甲基化位点，实现了基因区域和CpG岛的全面覆盖。此外，还附加了甲基化专家所精选的高价值内容，包括CpG岛之外的CpG位点，在人类干细胞中鉴定出的非CpG甲基化位点，以及肿瘤和正常组织中差异表达的甲基化位点等等。它的高覆盖度、高通量以及低价格，让它成为筛选GWAS群体的理想选择。索取HumanMethylation450 BeadChip芯片的更多资料
相比之下，VeraCode GoldenGate甲基化分析更适合高通量的验证研究，它以溶液的形式分析48至384个用户指定的CpG位点。首先，将亚硫酸氢盐处理的基因组DNA与分析oligo混合，oligo与未甲基化位点的U互补，或者与甲基化位点的C互补。杂交之后，引物延伸，并连接上位点特异的oligo来产生通用PCR的模板。最后，用标记的PCR引物生成可检测的产物。据Illumina的产品专家介绍，其产品的最大优势在于单个CpG位点的分辨率。其它分析将甲基化定位在一段区域，而通过Illumina分析，你能精确测定某个CpG位点的甲基化水平。索取GoldenGate甲基化分析的更多资料
高通量测序
新一代测序仪的飞速发展，使得测序成本大幅度下降，也使得甲基化组(methylome)的研究成为可能。近两年，多个研究小组将传统的甲基化工具(如DNA的亚硫酸氢盐转化)与目标基因组捕获技术和高通量测序相结合，绘制出了多张甲基化图谱。
而第三代测序技术的出现，更是让甲基化的直接测定成为可能。一年前，美国Pacific Biosciences公司利用独有的单分子实时(SMRT)测序技术，直接测定了DNA的甲基化。这项成果发表在《Nature Methods》杂志上。
SMRT技术采用的是对DNA聚合酶的工作状态进行实时监测的方法。DNA聚合酶催化荧光标记的核苷酸掺入到互补的核酸链中。核苷酸的掺入被检测成荧光脉冲，依据其颜色鉴定出核苷酸。当聚合酶切断连接在核苷酸末端的荧光基团时，脉冲终止。荧光脉冲的到达时间和持续时间产生了关于聚合酶动力学的信息，从而允许直接检测DNA模板链中的修饰核苷酸，包括N6-甲基腺嘌呤、5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶。
研究人员使用这些动力学特征，鉴定出基因组样品中的腺嘌呤甲基化，并发现再结合circular consensus sequencing，他们能够在单碱基分辨率上鉴定出表观遗传学修饰(mA、mC和hmC)。
美国Sequenom公司的MassARRAY(R) 平台也可用于DNA甲基化分析。MassARRAY(R) EpiTYPER(TM) DNA 甲基化分析技术结合了碱基特异性酶切反应和 MALDI-TOF 检测原理，可实现多重CpG的分析检测。
碱基特异性酶切(MassCLEAVE)实验由亚硫酸氢盐处理待测 DNA 开始。经过亚硫酸氢盐处理，DNA中未甲基化的胞嘧啶 (C) 转变为尿嘧啶(U)，由此在DNA模板中产生甲基化特异的序列变化。利用 5’39; 末端带有T7-启动子的引物进行 PCR 扩增，产物经 SAP (虾碱性磷酸酶)处理后用于碱基特异性的酶切反应。酶切后DNA片段的大小和分子量取决于亚硫酸盐处理后的碱基变化，飞行质谱能测出每个片段的分子量，配套软件 EpiTYPER 则能自动报告每个相应片段的甲基化程度。
MassARRAY甲基化检测无需任何荧光标记，每个反应覆盖长达500 bp的多个CpG位点，且灵敏度高，可检测低至5%的甲基化水平。目前有多家公司提供MassARRAY甲基化检测服务，如北京毅新兴业。
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亚硫酸氢盐。DNA经亚硫酸氢盐硫化处理后,DNA双链中的“C”转化为“U”,通过随后的PCR,将“U”转化为“T”,但亚硫酸氢盐不能使已发生了甲基化的DNA的“C”发生上述转化,DNA经亚硫酸氢钠处理后，所有未甲基化的胞嘧啶发生脱氨基变为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶无此改变。DNA的甲基化差异转变为序列差异，设计两对分别针对甲基化与非甲基化等位基因的引物，结合PCR扩增就可以将甲基化与非甲基化等位基因...
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&& &&& DNA 甲基化研究方法
原作者：Carlos Guerrero-B Department of Physics, Chemistry and Biology, Link?ping University, Sweden.&翻译者：冰糖.前言DNA甲基化是一种影响CG双碱基的复制后化学修饰反应。在该过程中，甲基基团（CH3）以共价键的方式被修饰到CG碱基的胞嘧啶C上[1]。该修饰是被一种叫做DNA甲基转移酶（Dnmts，DNA methyltransferases enzymes）催化反应的，其发生的部位是CG双碱基的胞嘧啶C的碳5位置，通常称作CpG位点（如上图）。1. Laird P, Jaenisch R. The role of DNA methylation in cancer genetic and epigenetics. Annu Rev Genet. -64 底物的来源由于DNA甲基化是一种酶催化的甲基基团转移到CpG双碱基上的过程，因此这就需要有甲基供体化合物来提供甲基基团。甲基基团一般来源于饮食，常见的有叶酸、甜菜碱（betaine）和维生素B12。这些甲基供体化合物最终可以影响甲硫氨酸和S-腺苷甲硫氨酸（SAM）的代谢[2]，其中SAM是某些甲基转移酶最主要的甲基供体。2. Van den Veyver I. Genetic effects of methylation diets. Annu Rev Nutr. -82. &酶的种类迄今为止人们已经了解了一些甲基转移酶（Dnmts），其作用各不相同但有时候会有某些重叠。Dnmt3A和Dnmt3B涉及到发育早期未甲基化DNA的甲基化谱式的建立，因此被称为从头的甲基转移酶（de novo methyltransferase）。而Dnmt1则倾向作用于半甲基化的DNA，对于维持DNA甲基化谱式至关重要。DNA甲基化复合物机器在一些藻类、真菌、植物、无脊椎动物和脊椎动物中都有被发现 。DNA甲基化的功能对DNA甲基化影响基因表达最广为人知的机制是甲基化影响了促转录因子与DNA的结合，从而抑制了基因的表达。但是，DNA的甲基化也能促进基因的表达，这是因为DNA甲基化可以影响某些绝缘子的结合，从而允许附件增强子发挥作用。DNA甲基化与发育近年来研究比较清楚的是DNA的甲基化和去甲基化对于发育期间的表观遗传调控是必不可少的生物学事件。DNA甲基化谱式在受精到囊胚植入前和胚系分化的早期特别容易被重编程[3]。尽管在子宫内的表观重编程传统认为是不可逆的，但近期一些研究表明母亲饮食介导的表观遗传学变化可以在后代的青少年时期被摄入的叶酸逆转[4]。胚系发育起始大部分表观遗传印记会被擦除[3]，然后在性别决定的起始时期DNA甲基化谱式会被重建。除此之外，在胚系发育的起始期还会涉及其他表观遗传的变化。该表观遗传重编程的时期代表着个体发育对外界因素的敏感时期，而且这一表观遗传谱式可以被诱导且在代际间永久传递 。3. Reik W, Dean W, Walter J. Epigenetic reprogramming in mammalian development. Science. 9-93.&4. Burdge G, Lillycrop K, Phillips E, Slater-Jefferies J, Jackson A, Hanson M. Folic acid supplementation during the juvenile-pubertal period in rats modifies the phenotype and epigenotype induced by prenatal nutrition. J Nutr. 4-60.DNA甲基化与疾病对于成年个体疾病的病原学机制，研究者一般认为其发育过程中的表观遗传学进程是疾病的发源起点。近来发现一些列疾病均包含有表观遗传学元素的病因，比如过敏反应、肝癌、胃癌 、哮喘、结肠癌、前列腺癌、HIV的潜伏、代谢性疾病以及心脑血管疾病等。还有些研究描述了DNA甲基化与母系影响，以及社会生物学层面的表现，如行为、抑郁和脑部疾病之间的关系。因此，使用生物信息学以及一些列可靠的生物学研究方法对检测DNA甲基化显得及其重要。DNA甲基化的研究方法在过去30年，随着表观遗传标志物挖掘技术的进步，人们才得以深刻理解表观遗传学在医学和生物学中所扮演的角色。 目前DNA甲基化的研究方法分为三种：全局甲基化（global methylation）、局部甲基化（local methylation），以及基因组尺度的甲基化（genome-wide methylation）。第一种：全局甲基化全局甲基化分析是第一种发展起来的分析方法，其目的主要用来确定基因组整体的DNA甲基化水平。该方法主要涉及用来源于SAM的放射性甲基供体被甲基转移酶Sss1催化修饰到DNA样品之中。还有利用CpG位点甲基化敏感的限制性内切酶的切割活性来区分DNA甲基化与否。近年来用来测量DNA全局甲基化的方法还包括通过胞嘧啶甲基化特异性抗体富集甲基化然后用荧光定量法检测；还有用高效液相质谱结合UV（HPLC-UV）或者串联质谱直接定量甲基化胞嘧啶（LC-MS/MS） ；酶联免疫的方法（ELISA）以及使用短重复序列或者线性原件代表基因组的甲基化状态，然后其中的5mC可以用生物素-链亲和素（biotinstreptavidin）免疫法、ELISA或者焦磷酸测序来检测。第二种：局部甲基化全局甲基化分析方法最主要的限制在于其只能检测整体的DNA甲基化改变，而忽略局部的变化。然而，正是局部DNA甲基化的变化才是相对重要的，这是因为化合物带来的大部分效应都只体现在局部而非全局甲基化的改变。局部甲基化分析是指特异基因或基因组特定区域的甲基化谱式分析。1用甲基化敏感性差异的同列酶对来确定甲基化位点起初利用甲基化敏感性差异的限制性酶切并结合PCR扩增和Southern杂交用来分析特局部甲基化状态。最常用的一对限制性内切酶是HpaII和其同列酶MspI。这两个酶都是识别CCGG并切割CG中间位置。但是，MspI是甲基化不敏感的，这意味着无论是否发生甲基化均可以切割CG。而HpaII，当CG发生甲基化时不能切开CG（如上图）。2亚硫酸盐处理测序确定DNA甲基化位点然而，能够在CpG位点水平分析局部DNA甲基化变化的最常用方法则是亚硫酸盐测序法。这一方法最初由Frommer描述并经过很多研究者的优化。其原理是亚硫酸盐可以把非甲基化的胞嘧啶C转换成尿嘧啶U，但对甲基化的胞嘧啶则没有影响。然后再经过PCR扩增并测序，从而区分这种转换的差异。测序确定甲基化的C依然是C，而非甲基化的C被转变成U，经过PCR扩增变成T（如上图3）。其实亚硫酸盐处理后可以使用不同的方法进行检测，比如COBRA法（组合亚硫酸盐限制性分析），即PCR扩增亚硫酸盐处理的样本，再经过限制性酶切分析；直接测序法；克隆测序；焦磷酸测序或质谱分析。甲基化特异性的引物的设计程序也有现成的，如Methprimer (http://www.urogene.org/methprimer)。如果利用实时荧光定量PCR的方法来分析甲基化特异性的PCR产物则可以分析溶解曲线和Ct值的变化。还有一种基于PCR检测方法的变种，COLD-PCR，利用较低的变性温度来偏向性的扩增非甲基化DNA片段。3SA-HRP介导的显色反应来检测全基因组(A)和特定位点(B)的DNA甲基化近年来研究者开发出了基于甲基结合蛋白（MBD）的快速显色分析法用以分析全基因组或者低丰度特异基因的甲基化状态。首先基因组DNA被限制性内切酶消化，然后用Kelnow聚合酶和生物素标记的dNTPs(biotin-dNTPs)补平DNA的末端，之后用MBD的免疫磁珠分选，最后用链亲和素（SA）标记的HRP（辣根过氧化物酶）（SA-HRP）来定量分析甲基化DNA的量（如上图）。第三种：基因组尺度的甲基化1AIMS（Amplification of InterMethylated Sites）AIMS（Amplification of InterMethylated Sites）方法就是利用甲基化敏感的SmalI及其甲基化不敏感的同列酶PspAI酶切基因组DNA，然后连上接头进一步做全基因组水平的PCR反应。差异性扩增代表着DNA甲基化状态的变化。类似的方法如HELP (HpaII tiny fragments Enrichment by Ligation-mediated PCR)，它利用的是HpaII（甲基化敏感）和其同列酶MspI（甲基化不敏感）。2MeDip(chromatin immune-precipitation of methylated fragments）在全基因组尺度解析区域DNA甲基化变化的最常用的方法之一是一种基于甲基化片段的免疫沉淀（MeDip）的方法。这一方法是利用抗甲基化胞嘧啶的抗体（MeDIP）免疫沉淀（IP）富集甲基化的DNA片段，然后再和芯片杂交用以鉴定DNA甲基化的位点（MeDIP-chip）。这一方法被用来绘制拟南芥、人乳腺癌以及人的主要组织复合物（MHC）的甲基化图谱。MeDIP-chip的方法对于绘制全基因组水平的甲基化变化具有显著的优势。但是，假阳性的问题需要使用局部甲基化的分析方法进行验证。另外一种分析全基因组甲基化状态变化的方法是利用甲基化依赖的内切酶McrBC把甲基化的DNA片段去除，然后通过芯片杂交和对照比较分析哪些片段消失了。最近，有研究者使用Infinium HumanMethylation27 Bead人甲基化芯片来分析疾病相关的DNA片段的甲基化变化。该方法是Golden Gate SNP基因分型分析方法的变种，因为目的位点SNP (C/T转换)就代表CpG甲基化的改变。3深度测序进年来出现了一种极具希望、不但能精准定量而且分辨率可达到CpG水平的全基因组DNA甲基化分析方法---深度测序。这一强大的技术被用来绘制拟南芥和人的甲基化图谱。这一方法也是利用亚硫酸盐处理然后连上接头进行全基因组测序。但是，和DNA甲基化富集再测序的方法相比比较昂贵，这也限制了该方法的应用。最近出现一种称作单分子实时测序（SMRT， single-molecule， real time sequencing）的方法，这一方法是把荧光标记的核苷酸掺入DNA的互补链中。碱基掺入动力学的差异可以用以区分表观遗传标记，比如甲基化、羟基化等，从而跳过了亚硫酸盐转换的步骤。&DNA甲基化动力学研究工具在过去几年，DNA甲基化研究是表观遗传学领域的大热门。在哺乳动物体内，DNA的去甲基化是有TET介导的5mC（5-methylcytosine）氧化成5hmC（5-hydroxymethylcytosine，5羟甲基胞嘧啶），5fC (5-formylcytosine，5甲酰基胞嘧啶)和5caC（5-carboxylcytosine，5羧基胞嘧啶）。对此目前有两种主要的检测方法:一种是亚硫酸盐处理非依赖方法检测，另外一种是甲基化辅助的亚硫酸盐测序法。第一：亚硫酸盐处理非依赖方法检测亚硫酸盐处理非依赖方法检测全基因组水平的5fC。该方法主要是利用化学标记5fC，并偶联生物素用以富集，然后连上接头并用二代测序技术来鉴定5fC位点（化学标记的5fC在PCR过程中会转变成T）。第二：甲基化辅助的亚硫酸盐测序法这一方法是用来在单碱基水平检测5fC和5caC。其原理是在亚硫酸盐处理之前先用基于SAM的甲基转移酶M.SssI处理DNA（这样非修饰的C就转变成5mC），然后再检测5fC 和5caC。一种改进的方法叫做RRMAB-seq（reduce-representation MAB-seq），这一改进可以提高CpG区域的覆盖率，降低成本。读而思duersi在过去30年，研究DNA甲基化改变的技术在稳步的发展，其研究方法也从最初忽略局部改变的全局DNA甲基化研究发展到了针对某个特定基因或基因组区域的可靠定量化的甲基化分析。特别是近几年随着测序技术的爆发式发展，极大的降低了基于DNA测序技术甲基化研究的成本，这使对DNA甲基化的研究在世界范围内的实验室变得越来越流行。可以预见，在不远的将来随着测序成本的进一步降低，对全基因组所有的CpG位点进行分析会变得可行。然而，其挑战也是显而易见的。随着数据的大量产生，对其进行生物信息学分析也变得必不可少，特别是对于基因组尺度的研究尤甚。
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