激光共聚焦显微镜技术在生物学中的应用_pdf_
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激光共聚焦显微镜技术在生物学中的应用_pdf_物理学
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激光扫描共聚焦显微镜操作步骤及注意事项
核心提示： 激光扫描共聚焦显微镜操作步骤及注意事项
激光扫描共聚焦显微镜可测定的样品种类很多．包括生物材料、组织(切片)、细胞(亚细胞)结构等。样品中荧光的来源主要有如下几种：自发荧光(autofluorescence)、荧光染色、免疫荧光、荧光蛋白、诱发荧光(induced fluorescence)及酶致荧光(enzymatically produced fluorescence)等等。其中大部分荧光素的激发和发射波长均可在仪器自带软件的染料信息库中找到。
1．观察步骤及仪器操作 &根据实验要求制备样品完毕后。即可进行观察。基本步骤如下：
(1)开启仪器电源及光源：一般先开启显微镜和激光器，再启动计算机，然后启动操作软件，设置荧光样品的激发光波长，选择相应的滤光镜组块。以便光电倍增管(photo multiplier tube，PMT)检测器能得到足够的信号结果。使用汞灯的注意事项同普通荧光显微镜。
(2)设置相应的扫描方式：在目视模式下．调整所用物镜放大倍数，在荧光显微镜下找到需要检测的细胞。切换到扫描模式，调整双孔针和激光强度参数，即可得到清晰的共聚焦图像。
(3)获取图像：选择合适的图像分辨率，将样品完整扫描后，保存图像结果即可。
(4)关闭仪器：仪器测定样品结束后，先关闭激光器部分，计算机仍可继续进行图像和数据处理。若要退出整个激光扫描共聚焦显微镜系统．则应该在激光器关闭后，待其冷却至少10分钟后再关闭计算机及总开关。
2．获取三维图像 &激光扫描共聚焦显微镜具有细胞&CT&功能，因此，它可以在不损伤细胞的情况下，获得一系列光学切片图像。选用&Z-Stack&模式，即可实现此项功能。其基本步骤是：
①开启&Z-Stack&选项；
②确定光学切片的位置及层数；
③启动&Start&，获得三维图像。
3．获取时间序列图像 &共聚焦显微镜的&Time-Series&功能，可以自动在实验者规定的时间内按照设定的时间间隔获取图像。只需设定所需的时间间隔以及所需图像数量，开启&Start T&功能键，即可进行实验。&Time-Series&功能大大减轻了实验者的劳动强度，对于荧光漂白恢复和钙离子成像等实验非常实用。
4．注意事项及维护保养
(1)仪器周围要远离电磁辐射源；
(2)环境无震动，无强烈的空气扰动；
(3)室内具有遮光系统，保证荧光样品不会被外源光漂白；
(4)环境清洁；
(5)控制工作温度在5～25℃。
编辑：songjiajie2010显微系统 >>
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仪器名称：VisiTech高速激光共聚焦显微镜
英文名称：
国产/进口：进口
产地/品牌：VisiTech 英国
参考报价：2400000
总点击数：1078
本半年点击数：14
产品类别：
高速激光共聚焦显微镜
&&&&&& AOTF与微透镜阵列扫描技术的完美结合： 超快成像，极低的光漂白与光毒性允许对活生物样品的长时间观察
&&& ☆ 实时3D重构&&
&&&&&&&&&&& 50000线/秒（或1000帧/秒）的实时
&&&&&&&&&&& 成像速度
&&&&☆最小的光损伤与光漂白&&
&&&&& 根据共焦级别和光通量智能化选择针
&&&&& 孔大小
&&& ☆用户友好的系统设计&&
&&&&&&&&&&& 全自动对焦系统 ，用户可以自己
&&&&&&&&&&& 现场更换分光镜和滤光片
工作原理：
&&&&&&& 系统基本光路由被一束膨大的激光束照射的固定的微透镜阵列组成。一个检流计反射镜（振镜）扫描样品上的阵列并解扫返回的荧光信号。荧光信号通过一个分色镜从照明光路中分离出来，并通过一个固定的小孔阵列建立共焦图像。图像被位于检流计反射镜（振镜）背面的超灵敏EMCCD以完美的同步性再次扫描。检流计反射镜（振镜）可以非常便捷地选择相机参数，如曝光时间和帧捕获速率。
基本光路图
应用优势：
&&&&&& VisiTech在技术上突破了传统激光共聚焦显微镜的限制。使用新颖的AOD（声光偏转）技术，VisiTech允许对高分辨率共聚焦成像的超快扫描和捕获，从而在超高速共聚焦显微镜技术方面设立了新的标准。
&&&&&&& VisiTech可以提供更快的扫描速度，而不会产生其它多点扫描技术所固有的帧间变化，它的可变扫描速率使得运用简单的同步来消除图像斑纹成为可能。VisiTech同时具备多点激光共聚焦系统极其低的光漂白性能。
&&&&&&& VisiTech的专利设计使得我们可以在保持低成本的前提下，提供无与伦比的激发效率，极高的分辨率和高速的扫描性能。
&&&&&& VisiTech具有全自动校正功能。 分光镜和滤光片可以现场更换，无需返回工厂来改变分光镜/滤光片的配置。专利的分光镜设计无需特殊的分光镜排列来维持图像不发生漂移。
&&&&&& VisiTech极低漂白率的技术特点对于活细胞实验尤其有利，与传统单点扫描共聚焦显微镜相比，可以在更长的实验时间内维持细胞的可用性。
表达eGFP的Hella细胞
螺旋藻Though Focus图像
典型应用：
&钙离子信号
&分子间相互作用
&细胞内液流研究
&胶体、悬浮物、沉淀物研究
细胞内钙离子波动
光漂白中的荧光损失
典型应用案例：
花粉粒表面结构
&肺动脉内皮细胞
DsRed标记的线粒体
VisiTech介绍
VisiTech International的宗旨是为生命科学和材料科学领域客户提供最先进的高品质成像及相关设备。公司已经越来越接近这个最初目标&&在市场中成为动态荧光成像方面的领导者。
依靠充分地研发调查，VisiTech不仅巩固了现有市场中的地位，而且扩展到各个潜在的应用领域。凭着广受用户赞誉的创新精神，VisiTech不断向市场中引入最新的设备和技术。MagiCal（1988年生产）是市场上第一套达到视频采集速度的钙离子测量系统，在80年代末90年代初的前沿科学研究中发挥了重要作用。QuantiCell（1993年生产）是第一套具有超越视频速度性能的多波段自由离子测量系统。VoxCell Scan（2000年生产）是第一套用于活体成像的模块化实时激光扫描共聚焦显微镜系统。VT-Eye（2003年生产）是唯一的使用AOD技术的超快激光扫描共聚焦显微镜。VT-Infinity（2004年10月生产）是第一套2D阵列激光扫描共聚焦显微镜，它具有VisiTech在共聚焦技术方面的知识产权专利保护。
VisiTech在世界范围内与行业领先的设备供应商建立了广泛的战略联盟。从一开始，VisiTech就在全球建立了20个分销渠道，并与上游制造商，如德国Evotec Technologies和Yokogawa Electric Corporation 建立了紧密的合作关系。
VisiTech总部位于英国的森德兰，拥有20名高素质雇员，平均200人/年的市场活动经验。公司源于Joyce Loebl Ltd&&图像处理技术和生命科学设备应用成像的行业领军公司之一。1999年1月，公司管理层成员从应用成像部门买断并创建了独立的公司VisiTech International。
VisiTech的成功来源于不断地分析市场需求，设计满足市场需求的设备，并为用户提供可靠的售后服务支持。我们的用户包括著名制药企业葛兰素史克GSK和美国国家航空航天局NASA这样的高端客户。公司40%的员工都可以为售后服务提供支持。
Quantum&量子科学仪器贸易（北京）有限公司(暨Quantum Design中国子公司)是世界知名的科学仪器制造商&&美国 Quantum Design 公司在全世界设立的诸多子公司之一。美国 Quantum Design 公司生产的 SQUID 磁学测量系统 (MPMS) 和材料综合物理性质测量系统 (PPMS) 已经成为世界公认的顶级测量平台，广泛的分布于世界上几乎所有材料、物理、化学、纳米等研究领域尖端的实验室。同时美国 Quantum Design 公司还利用自己遍布世界的专业营销和售后队伍打造一个代理分销网络，与世界其他领先的设备制造商合作，为其提供遍布全球的专业产品销售和售后服务网络，2007 年美国 Quantum Design 公司并购了欧洲最大的仪器分销商德国 LOT 公司，使得 Quantum Design 公司全球代理分销和售后网络变得更加完整和强大。
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激光扫描共聚焦显微镜
技术在生物学中的应用 1 主 要 内 容
第一部分 光学显微镜基础知识
第二部分 激光共聚焦显微镜技术
第三部分 图像改进技术（补充） 2
第一部分 光学显微镜基础知识 第一节 发展历史 第二节 成像原理 第三节 主要技术参数 主要技术参数 第四节 光学显微镜的基本组成结构 第五节 光学显微镜的调节 第六节 光学显微镜的使用与维护 3
第一节 光学显微镜的发展历史 1590年，荷兰的眼镜制造者造出类似显微镜的放大仪器。 1610前后，意大利的伽利略和德国的开普勒改变物镜 和目镜之间的距离，得出合理的显 微镜光路结构 1665年虎克在显微镜中加入粗动和微动调焦机构、照明系统和承载标本片的工作台，这 些部件经过不断改进，成为现代显微镜的基本组成部分。 年期间列文胡克制成单组元放大镜式的高倍显微镜 1684年惠更斯制造出双透镜目镜：惠更斯目镜 19世纪高质量消色差浸液物镜的出现，使显微镜观察微细结构的能力大为提高，19世纪 70年代阿贝提出显微镜的完整理论 1850年出现了偏光显微术；1893年出现了干涉显微术 1902年艾夫斯建立了双目镜系统 1935年泽尼克发现了相衬原理，并因此获得诺贝尔奖 20世纪60年代微分干涉衬显微镜问世 20世纪80年代共焦激光扫描显微镜开始应用 主要的显微镜厂家主要有：奥林巴斯、蔡司、徕卡、尼康 4 光学显微镜的分类
光学显微镜有多种分类方法：
?按使用目镜的数目可分为双目和单目显微镜；
?按图像是否有立体感可分为立体视觉和非立体视觉显微镜；
?按观察对像可分为生物和金相显微镜等；
?按光学原理可分为偏光、相衬和微差干涉相差显微镜等；
?按光源类型可分为普通光、荧光、紫外光、红外
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标题: 激光共聚焦显微镜与全内反射显微镜在原理及应用方面有哪些区别？
摘要: [激光共聚焦显微镜与全内反射显微镜在原理及应用方面有哪些区别？] 如题！谢谢！ 关键词:[共聚焦显微镜 反射显微镜]……
如题！谢谢！
激光扫描共聚焦显微镜是采用激光作为光源，在传统光学显微镜基础上采用共轭聚焦原理和装置，并利用计算机对所观察的对象进行数字图象处理的一套观察、分析和输出系统。主要系统包括激光光源、自动显微镜、扫描模块（包括共聚焦光路通道和针孔、扫描镜、检测器）、数字信号处理器、计算机以及图象输出设备（显示器、彩色打印机）等。通过激光扫描共聚焦显微镜，可以对观察样品进行断层扫描和成像。因此，可以无损伤的观察和分析细胞的三维空间结构。同时，通过激光扫描共聚焦显微镜也是活细胞的动态观察、多重免疫荧光标记和离子荧光标记观察的有力工具。TIRFM技术依赖于斜射光线在两种不同折射率光学介质表面产生的极浅的消逝波。该效应产生的条件是入射介质折射率大于折射介质，并且斜射照射到光学界面时入射角大于全反射临界角。残余的消逝波扩散进入低折射率介质，并且随着扩散深度的增加，光强成指数递减。利用消逝波极浅的穿透性，可以在光学表面100nm以内照明和激发荧光染料，因此几乎完全排除了细胞体内的自发荧光干扰，与传统荧光照明技术相比，极大的改善了图像的信噪比。
请教, 请问如何排除细胞体内的自发荧光干扰的?
一步一步来。。1。首先要知道自发荧光因为什么而来，是样品本身带来的，还是样品外部的东西造成的。2。比如说有些fixation agent自发荧光比较强。如果是外部的东西造成的，尽量改protocol。3。如果无法避免，那么找一个光谱仪器，读一边样品的光谱，看看激发光谱和发射光谱长什么样。4。然后染色时尽量避免使用和自发荧光发射光谱重合的染料。比如说，如果发射光谱的高峰在520nm段，最好不要用GFP一类的dye。5。如果实在避无可避，找一台可以做光谱扫描的显微镜，做 spectral unmixing。
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