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即送15丁当
【求助】急：BrdU腹腔注射问题
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这个帖子发布于8年零153天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
我的实验需要给大鼠腹腔注射BrdU溶液，文献报道需要20mg/kg BW。可我查阅了本站的帖子，多认为可将5mg BrdU溶于50毫升生理盐水中。我试着将15mgBrdU溶于50毫升生理盐水，可即使采用这个浓度，一只300克的大鼠，也要注射20毫升的溶液，大鼠能够耐受吗？还请大家指点。
不知道邀请谁？试试他们
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make it more concentrated...no problem..
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我们用BrdU（sigma，50mg/kg 体重，0.9%NaCl稀释为10mg/ml）腹腔注射，连续注射3天，每日两次，后来作免疫组化和荧光双标，效果还好你试试吧，好运！！
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我们用BrdU（sigma，50mg/kg 体重，0.9%NaCl稀释为10mg/ml）腹腔注射，连续注射3天，每日两次，后来作免疫组化和荧光双标，效果还好你试试吧，好运！！
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丁香园准中级站友
有没有给裸鼠腹腔注射BrdU的啊？注射的剂量和浓度分别是多少？谢谢
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ＢｒｄＵ注射剂量２００μｇ／ｇ体重，浓度25g/2L，你自己换算一下你需要的量，如ug/ml可以注射一次后在4-24h内取材，也可以连续注射2次，每12h一次，12h 取材。好运！！！
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请问楼上的前辈，12h注射一次，连续注射两次，那么实在最后的一次注射后12h取材还是12h之内都可以呢？有关文献可以提供一下吗？谢谢！！
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20mg/kg BW ,是指每次注入的量吗，还是只这么多量平均分次注入
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请问各位大侠如果是不是必须连续注射3天后立即取材？我打算1周取材是不是必须连续打7天啊？多谢啦！
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关于丁香园关注今日：7 | 主题：85872
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即送15丁当
【求助】怎么会是这样子？很奇怪的Brdu+Nestin免疫荧光双染，***帮助
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勇敢的机器猫 cedar1985战友：上图是Brdu的单染，这张图没有做Nestin。请问您染的Brdu是这个样子的吗？呵呵，不好意思，我的brdu还没有做，nestin还没染出唉
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我做冰冻切片也是不修复的，结果感觉还可以，但是我染得不多，就十种左右的多克隆抗体。关于抗原修复，楼上的战友有个“交联说”，我觉得甲醛和多聚甲醛不能混为一谈，两者有着本质的区别，多聚甲醛如果按正确的方法配制，并且现配现用，后固定时间不要过长，交联应该是不严重的，不至影响染色。产生交联可能是多聚甲醛分解成甲醛的原因。通常是4%多聚甲醛，如果染色不佳还可以减到2%。抗原修复应该会提高染色效果，但是不是必须的。大家探讨。这里说的是多聚甲醛固定的标本，不包括其它固定液固定的标本。
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skyskytotop edited on
大家好，请问SVZ的起始和结束位置是如何？如果是按照定义，The lateral wall of the lateral ventricle ，那是好长的一段距离哦，切片很痛苦啊。。。。我是要做brdu的标记的，是否需要切那么长的距离？
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skyskytotop 我做冰冻切片也是不修复的，结果感觉还可以，但是我染得不多，就十种左右的多克隆抗体。关于抗原修复，楼上的战友有个“交联说”，我觉得甲醛和多聚甲醛不能混为一谈，两者有着本质的区别，多聚甲醛如果按正确的方法配制，并且现配现用，后固定时间不要过长，交联应该是不严重的，不至影响染色。产生交联可能是多聚甲醛分解成甲醛的原因。通常是4%多聚甲醛，如果染色不佳还可以减到2%。抗原修复应该会提高染色效果，但是不是必须的。大家探讨。这里说的是多聚甲醛固定的标本，不包括其它固定液固定的标本。我的看法是，如果不修复能够一直出结果，那么很好，但是假如有那么一次，没有出结果，是否不修复就是不出结果的原因之一的呢。所以，我觉得如果最好还是修复一下，至少排除了这一方面的原因，也不差这两个小时的时间了。但就是不知道抗原修复对染色结果的影响到底有多大？？随便说说，供参考！
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个人体会：感觉鼠脑的冰冻切片其实没必要灌注生理盐水+多聚甲醛+蔗糖脱水。（做血管指标的除外）。我的片子直接新鲜取脑，液氮速冻，然后上冰冻切片机，感觉也没有形成多少冰晶。少了多聚甲醛的固定还可以防止蛋白结构的交联，也不用考虑修复的问题。以上是个人的观点，大家多交流交流
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勇敢地机器猫，请问下，你后来是通过什么改进就染出来了呢？
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最后发的这张图片应该是Brdu染色,看起来还可以.
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这个过程从腹腔注射Brdu开始任何一部出现问题,都可能做不出结果,你做的还挺不错的.
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甲醛 我第一次听说。我们做冰冻切片的没有不修复的。而且修复方法很多很多。想请教您的修复方法望版主不吝赐教
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我试过一种做法，但是没试出来，楼主不妨试试 Enzyme Immunostaining for BrdU1.Wash frozen sections with PBS 2x. 2.Put them in 0.1% Pepsin in 0.1N HCL (in PBS) at 37℃ for 50min. 3.Then in 0.3% hydrogen peroxide in PBS, 30min. Then rinse with PBS 3x5min. 4.Then in 0.5% BSA at RT for 45min. 5.Mouse anti-BrdU diluted to 1:100 (1:200) with 0.5%BSA +0.3 Triton X-100 in PBS, incubate at 4℃ overnight. 6.Rinse with PBS 3x. 7.Goat Biotinylated anti-Mouse IgG 1:200 with 0.5%BSA +0.3 Triton X-100, incubate at RT for 1 hour. 8. Rinse in PBS 3x. 9.Incubate with ABC reagent in PBS containing 0.1% Tween 20 at RT for 1 hour.. (ABC reagent solution: 5ml PBS/0.1% Tween 20 with 1 drop A and 1 drop B, mix well). 10.Rinse with PBS 3x. 11.DAB reaction: 2.5ml of distilled water + 1 drop Buffer + 2 drop DAB solution + 1 drop hydrogen peroxide.
Needs about 8 min to stop DAB reaction. 12. Rinse with distilled water 3x. Counterstain and mount.
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看看我的BrdU细胞免疫荧光，感觉都染在胞浆上面了，胞核反而没有染上
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是不是因为我没有破膜，所以抗BrdU无法很好的和核结合
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还有下文吗，刚关注到
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好热闹啊！呵呵个人体会：1　不论什么样的组织如果经过了甲醛或者多聚甲醛的固定，都要进行抗原修复的。而像楼主这样不经过任何试剂就冰冻切片，那么就不需要抗原修复了，因为抗原修复是会引起假阳性或者抗原弥散的。2　以前我做BRDU，一般ｉｐ了以后3天之内都不影响结果。用的是BD的，按照protocol不是很复杂。因为不是做的脑，不敢多说。3　楼主之前的结果确实不是BRDU阳性，而是称之为人工假象的东西。和wangshirufen后面贴的这个图一样，也是假象。4　楼主后面的这个倒是有点像了，但最好和DAPI的MERGE一下，这样才可以确定是不是。
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1\BrdU 染色结果肯定不对，要与DAPI染核结果重合才行建议用EdU细胞增殖检测方法
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借人气问一个问题：我做小鼠脑片（40um冰冻切片）的Ki67免疫荧光漂片染色，染色前用80度柠檬酸钠（PH6.0）热修复半小时，但之后脑片皱缩严重，请问各位有没有比较好的办法克服这一问题？非常感谢！
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呜呜我跟你一样一样，我在想是不是没洗干净？或者一抗浓度太高？？
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请问你的nestin稀释比例多少呢？
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haowang7204 借人气问一个问题：我做小鼠脑片（40um冰冻切片）的Ki67免疫荧光漂片染色，染色前用80度柠檬酸钠（PH6.0）热修复半小时，但之后脑片皱缩严重，请问各位有没有比较好的办法克服这一问题？非常感谢！半小时太长了，减到10分钟差不多
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您好，我提供一个方法，楼主可以试试，我是做小鼠的脑，没有做过NESTIN BRDU的双标，但是我做过PH3和BRDU的双标，效果非常好，最近准备做NESTIN BRDU双标，如果有结果会及时发上来给楼主看。先看一下我的图。BrdU注射的时间是1.5小时具体的步骤如下：（我用的是胚胎E14.5的小鼠，因此不用灌流）组织是4%多聚甲醛固定过夜，30%蔗糖脱水后OCT包埋，冰冻切片14um.BrdU和别的抗体双标都是分两步，先做普通的抗体，然后再做BrdU,时间会比较长，一般3天。1.PBS洗5分钟。(抗原修复是可选步骤，有的抗体需要修复，有的不需要。我做的PH3需要修复，普通修复液放在微波炉中大火煮沸，换成小火继续煮10分钟，冷却后PBS洗2遍即可)2.PBT 穿透20分钟（如有抗原修复的可以不用再穿透，直接封闭）3.10%（或5%）血清封闭1小时。4.一抗4度过夜5.PBS 洗3遍6 .二抗 37度2小时。7.PBS洗3遍，第三遍的时候加入DAPI衬染细胞核。8.4%多聚甲醛固定10分钟。（这一步很重要，作用有两个，1 把之前的一抗和二抗都固定好，防止盐酸处理时破坏染色。2 固定DAPI的染色，如果不固定的话最终染出来的DAPI是散的)9. PBS 3遍10.1M HCL 45度处理30分钟。（盐酸处理的温度和时间是根据各种Brdu抗体来来确定的，我用的是ABCAM的 RAT BRDU,浓度1:5000，没有假阳性）11.PBS洗3遍12.4%多聚甲醛固定10分钟13. PBS洗3遍。14.5%血清封闭1小时后加一抗，4度过夜15.PBS 3遍，二抗37度2小时16.PBS3遍，封片照相。步骤比较复杂，但是基本上我们做不同的抗体和Brdu双标都能成功。楼主可以参考一下。
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:你的片子染得真漂亮！我也准备近期做BRDU的双染，是脑梗模型，请问石蜡包埋前SVZ取材部位？在博士论文看到是取视交叉前3毫米，后5毫米，的大脑中动脉供血区。这样对吗？请多指教！
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回楼上的朋友，我做的脑子是用OCT包埋的，没有做过石蜡切片，另外也没有做过脑梗的模型，不好意思啊
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谢谢，问题已经解决。咨询学校的同学，取视交叉以后，四叠体以前。应该正确率。
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wuxiaojing0204 您好，我提供一个方法，楼主可以试试，我是做小鼠的脑，没有做过NESTIN BRDU的双标，但是我做过PH3和BRDU的双标，效果非常好，最近准备做NESTIN BRDU双标，如果有结果会及时发上来给楼主看。先看一下我的图。BrdU注射的时间是1.5小时具体的步骤如下：（我用的是胚胎E14.5的小鼠，因此不用灌流）组织是4%多聚甲醛固定过夜，30%蔗糖脱水后OCT包埋，冰冻切片14um.BrdU和别的抗体双标都是分两步，先做普通的抗体，然后再做BrdU,时间会比较长，一般3天。1.PBS洗5分钟。(抗原修复是可选步骤，有的抗体需要修复，有的不需要。我做的PH3需要修复，普通修复液放在微波炉中大火煮沸，换成小火继续煮10分钟，冷却后PBS洗2遍即可)2.PBT 穿透20分钟（如有抗原修复的可以不用再穿透，直接封闭）3.10%（或5%）血清封闭1小时。4.一抗4度过夜5.PBS 洗3遍6 .二抗 37度2小时。7.PBS洗3遍，第三遍的时候加入DAPI衬染细胞核。8.4%多聚甲醛固定10分钟。（这一步很重要，作用有两个，1 把之前的一抗和二抗都固定好，防止盐酸处理时破坏染色。2 固定DAPI的染色，如果不固定的话最终染出来的DAPI是散的)9. PBS 3遍10.1M HCL 45度处理30分钟。（盐酸处理的温度和时间是根据各种Brdu抗体来来确定的，我用的是ABCAM的 RAT BRDU,浓度1:5000，没有假阳性）11.PBS洗3遍12.4%多聚甲醛固定10分钟13. PBS洗3遍。14.5%血清封闭1小时后加一抗，4度过夜15.PBS 3遍，二抗37度2小时16.PBS3遍，封片照相。步骤比较复杂，但是基本上我们做不同的抗体和Brdu双标都能成功。楼主可以参考一下。 好漂亮的片子，浓度那么低也能出来，如果要加染DAPI的话放在哪一步合适？
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谢谢前辈，之前没看清楚 原来帖子已经写有了，多聚甲醛和甲醛固定有区别吗？
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讨论的很详细~~受益匪浅
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前辈们，我想做EDU的 双标，能告知一下详细步骤么，谢谢了
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我也要做Brdu的双染
但是我单染的结果都不是很好
要跪了。。。。。
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我觉得修复还是很关键的，无论那种固定，都会使蛋白发生交联反应从而封闭抗原位点，我一般选择热修复，还有做不出我就去Santa厂家（Tel: 86 021-）那边看看有没有你这个研究蛋白的单抗小样，反正不用费用的，看看做不做来。
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关于丁香园有哪位高手做过Brdu动物体内注射实验的，求帮助(动物体内,小鼠,剂量,腹腔注射) - 动物实验 - 生物秀
标题: 有哪位高手做过Brdu动物体内注射实验的，求帮助(动物体内,小鼠,剂量,腹腔注射)
摘要: [有哪位高手做过Brdu动物体内注射实验的，求帮助(动物体内,小鼠,剂量,腹腔注射)] Brdu小鼠腹腔注射剂量是多少，间隔多长时间取组织可以观察到Brdu整合到DNA中。 关键词:[动物体内 小鼠 腹腔注射 剂量]……
Brdu小鼠腹腔注射剂量是多少，间隔多长时间取组织可以观察到Brdu整合到中。
回复24–48小时即可回复楼主结果怎么样啊？我最近也在做，但是背景很强，整个片子黄一片，不知道是什么问题？楼主可否给点意见？回复120mg/注射后2～4h取材
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电话：021-|/|/|/|/|/|
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【求助】关于BrdU标记的问题(附图，请各位站友共同分析）
刚开始做神经干细胞的BrdU标记，结果出不来，请高手指点。具体情况是：brdu 50mg/kg, 皮下注射，每天两次，连续3天，末次注射后24小时灌流取材。据说脾容易出结果，所以同时也取了脾脏作为方法的阳性对照。现在脾脏出来了阳性结果，可以观察到成簇的BrdU阳性细胞，但是海马和室下区却没有出来，即使有少量疑似的，染色也很浅，不好确定。会是什么原因呢？请各位站友多多指点，谢谢。自己顶一下，我考虑可能有两个方面的原因：1. 因为脾脏出来了结果，但脑子没出来，所以可能有BBB的影响。但是，文献当中基本都是这个给药剂量下出来的结果，所以现在比较困惑，不知有没有必要加大剂量。2. 考虑到脑内（海马）神经干细胞的增殖在3，4天时细胞数达峰值，而我的取材时间可能较早而没能等到这些细胞都掺入BrdU，所以下一次实验打算延长brdu 的给药时间至6天，然后在第7天取材。问题是，文献中有很多也是只给3天，甚至更短时间（10h）就出结果的。郁闷ing，请各位在这方面有实战经验的站友不吝赐教啊！！！！谢过先。1. BrdU能通过BBB2. BrdU注射两小时后就能在脑中检出，我们实验室通常是50mg/kg q2h*4注射，24小时后灌注，效果不错。可能你的实验步骤有问题PS：为什么不腹腔注射？BrdU 一般都是ip, 50mg/kg. 注射后2小时，即可见BrdU阳性细胞。不可能是BBB的影响。加大剂量可能会导致死亡。写错了，不是皮下，是腹腔。谢谢小豚鼠和AME。这样的话就不是BrdU的给药剂量和时间的问题。那请大家再帮忙分析下面的步骤：灌流取材部分：麻醉用的无巴比妥纳，之后先用0.1M的PBS，再用溶于0.1M
PB的多聚甲醛先快后慢灌流。取脑，置固定液中，4h后修片，固定过夜。切片：免疫组化部分：脱蜡，0.01M PBS 洗3次，双蒸水洗3次，2M HCl 37度 30 min，含H2O2的PBS泡30min，0.01M PBS 洗3次，血清封闭，一抗（1：500）4度过夜，0.01M PBS 洗3次，二抗（1：50）37度1h，0.01M PBS 洗3次，预温的AB液37度40min，DAB显色1.脱蜡后需抗原修复2.切片多厚？ 如果石蜡片在5um左右可不用HCl变性DNA 如果石蜡切片&10um，建议PBS中加0.3%TritonX-100。3.BrdU我个人喜欢用冰冻切片做to小豚鼠：1.切片厚度25um，请问是免疫组化部分所有步骤中用到的PBS都加0.3%TritonX-100吗？我的抗体稀释液中含0.4%TritonX-100，可以吗？2.另外，能否具体说明一下抗原修复的具体方法。我之前都没有做过这一步，看了相关的书，说是有好多种不同的方法，不知道选哪一种比较好。谢谢。1. 25um的片子为什么不用冰冻切片或者震动切片机切？2. 25um的片子做石蜡切片的话在抗原修复的时候很容易掉片3. 我从封闭开始全部缓冲液均为0.3%-TritonX-100 PBS4. 最简单易配的抗原修复液为：柠檬酸三钠 3g， 柠檬酸0.4g，定容至一升。to 小豚鼠：我今天用冰冻切片做了抗原修复，因为没有办法控制微波炉的温度在92－98度，所以我选择了高温高压修复，修复液用的就是pH6.0的柠檬酸缓冲液。但是从锅里面拿出来以后，切片都皱了。为了使蛋白能够回复原有的空间构型，我还特意让它自己在室温缓慢冷却的。请再指点下，谢谢。结果出来还是不行呢，郁闷。石蜡切片为什么那么厚？微波修复我习惯先预热到90多度，再用小火力15分钟，基本能维持那个温度。不知道你用的brdu和brdu单抗的生产厂家是哪家？当年，我用了国内boster的brdu和brdu单抗，郁闷了3月没有做出来，全部换成sigma的以后，立即出来了，有时候，试剂的选择也很重要。还有，在正常成年鼠的脑中，所谓的“神经干细胞”是很少的，而且增殖速度也很慢，有时不容易检测到。不知道你的实验动物是正常鼠还是实验干预了的？现在已经有很多实验显示：脑缺血/外伤/癫痫等病理状态均可激活体内的neural progenitors。但是，在实验过程中，已经有人发现，即使是给与干预措施，有些动物也无法检测到brdu表达，可能与个体差异有关。good luck！灌流取材部分：麻醉用的无巴比妥纳，之后先用0.1M的PBS，再用溶于0.1M PB的多聚甲醛先快后慢灌流。取脑，置固定液中，4h后修片，固定过夜,能问一下取脑后你是在甲醛这种固定液中固定的么？，是４小时么？，然后再在甲醛中固定过夜？４小时时间是否长？1.用多聚甲醛灌流之后，本来也是要用多聚甲醛固定的，但是配好的多聚甲醛不够了，由于配多聚甲醛比较花时间，所以用的中性甲醛固定的。90ml 0.1M PB+10ml 甲醛＝中性甲醛。2.固定4小时修片，时间不长的啊。做BrdU的免疫组化一段时间了，现将拍摄图片贴出，与各位站友一起讨论。1. 这张图中，沿着侧脑室边缘染色很深的细胞，与文献中所附BrdU＋染色的图片很相似，判断为阳性细胞。2. 其他一些细胞，染色浅，且深染部分看起来不是胞核，而是胞质边缘。请问是阳性细胞吗？3. 我看过有的文献报导细胞多次分裂后，由于BrdU被稀释而出现浅染，我的给药时间是3天（twice daily）， 末次给药24h就取材，在这样的周期中会出现BrdU稀释成这样的可能吗？4. 还有文献报导由于免疫组化处理过程中核膜破裂，DNA溢出等原因，染色部分可能并不是定位于核，而出现胞质深染的可能，各位站友在自己的实践过程中有否出现这种情况呢？
3hh.tif (38.36k)图片似乎有问题，大不开附图如下：
screen.width-333)this.width=screen.width-333" width=475 height=333 title="Click to view full Image1.jpg (475 X 333)" border=0 align=absmiddle>就你的图片来看，所谓的“阳性细胞”不像是BrdU阳性细胞。1，BrdU阳性细胞应该定位于胞核，呈扁圆形（因“干细胞”不成熟所致）；2，根据你给出的图片来看，该部位应该不是SGZ，如果是SVZ的话，细胞应该成簇排列，呈小圆形，典型的阳性细胞不是你给出图片中这个样子；3，对于brdu阳性细胞是不是就是'干细胞'，这个要看你给予brdu的浓度及动物模型，其实只要体内处于增殖状态的细胞均可以表现为brdu阳性，至于阳性细胞的种类就要具体看你的模型了。实验过程中的影响因素很多，既然你在脾脏中已经检测到“brdu”阳性细胞，那说明你的IHC方法是没有问题的。如果要说问题的话，可能还是在给药方式、剂量或动物模型上。btw，我用的sigma的brdu单抗，上面推荐石蜡切片采用酶修复。祝你好运。谢谢lits版主，我又修改了一下实验方法，昨天做出来感觉还行，下面这张应该是了吧^_^开心ing补充：这是沿着侧脑室边缘拍摄的照片。放大倍数：40倍物镜。
screen.width-333)this.width=screen.width-333" width=507 height=570 title="Click to view full a.jpg (507 X 570)" border=0 align=absmiddle>这张做的还是很不错的。你用的是冰冻切片？灌注没有？抗原修复方法是什么？1. 这批做的还是石蜡切片，我切的也有冰冻切片（厚25um），但可能刚开始的时候实验方法摸的不好，做出来的结果也不好，后来在4度冰箱放了3，4个礼拜的样子就放坏掉了，切片很脆弱，免疫组化过程中就都碎掉了。这里提醒各位站友，该放－80度保存的冰冻切片一定要放－80度，除非你能在2周内把它都做完。不过我想我的冰冻切片可能太厚了，因为看到一个国外的类似的坛子有人说，一开始冰冻切片做BrdU效果很好，但后来切片机出了问题，切的片子&10um,就不行了。2. 灌注了的。还是先PBS,再多聚甲醛，先快后慢灌注的。3. 抗原修复用的是pH6.0的柠檬酸缓冲液（配方前面有说明）。先将缓冲液加热到95度，然后放入切片，维持该温度15min（有资料说是20－40min，具体到每个人的实验还需要在摸索一下吧），自然冷却到室温。注意一定要自然冷却，不能用冷水淋，让蛋白能回复到原来的结构。^_^实验总结基本上就是这样了，谢谢各位站友，祝大家实验顺利啊^_^弱弱的问一句，有那位有关于Brdu的介绍资料。非常感谢。还有个问题。各位用哪些指标测脑部血管再生的？？谢谢※※※※※非常有帮助！
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