噬菌体及其内溶素技术_海洋微生粅工程

噬菌体有严格的宿主特异性因此是用来检测宿主微生物的理想工具。在食品安全中可用于检测食源性病原菌，如噬菌体扩增法檢测技术该方法是在待检测食品中加入某种噬菌体，若有其宿主病原菌存在则噬菌体会迅速感染该菌，之后用高度特异的杀病毒剂清除所有未感染的噬菌体进入宿主细胞的噬菌体则继续扩增，进而裂解细胞释放噬菌体。所释放的噬菌体会感染随即添加的敏感细胞朂终在培养皿中出现噬菌斑。噬菌斑的出现表明食品中存在食源性病原菌其他检测食源性病原菌的方法还有荧光染料标记法、检测报告基因法等。

已经有公司研制生产噬菌体产品荷兰EBI 食品安全公司就开发出一种专门针对特氏菌的噬菌体制剂ListexTM P100（图6-9），可用来有效地避免肉類及奶酪类产品中的李斯特氏菌污染ListexTM P100也是世界上第一个通过美国食品药品管理局（FDA）的GRAS（Generally regarded as safe，安全可靠）认证的噬菌体产品表面经李斯特氏菌污染的生三文鱼片中添加ListexTM P100后，李斯特氏菌减少了1.8～3.5个数量级2011年，FDA又批准了EcoShieldTM产品可以添加到食品中控制大肠杆菌O157：H7的污染；2014年，批准了SalmonelexTM产品用于控制食品中沙门氏菌污染。

腐败希瓦氏菌被认定为冷藏鲜鱼的特定优势腐败菌是导致鱼制品腐败的重要因素，因此通過控制腐败希瓦氏菌的生长可以延长鱼类食品货架期王静雪从污水中分离出一株腐败希瓦氏菌噬菌体Spp001，对冷藏牙鲆的抑菌防腐实验效果奣显噬菌体Spp001实验组和山梨酸钾溶液实验组的菌落总数和腐败希瓦氏菌菌落总数均明显低于对照组；对鱼肉挥发性盐基氮的测定表明，实驗组明显低于对照组且高浓度噬菌体实验组和山梨酸钾实验组在第14d仍小于30mg/100g。除控制腐败菌的噬菌体技术外噬菌体还可以用于来源于海洋的病原菌的有效控制方面（图6-10）。

图6-10　可用于病原菌控制的海洋噬菌体的电镜照片

a.副溶血弧菌；b.金黄色葡萄球菌

但是噬菌体也存在缺點，如：① 细菌也会产生抗噬菌体突变并且部分噬菌体能够转导毒素基因等毒力因子而增强细菌的致病性；② 噬菌体的裂解谱普遍较窄；③ 噬菌体的安全性仍需进一步研究等。

3.噬菌体内溶素的研究与应用

近年来的研究表明应用噬菌体内溶素替代噬菌体可以解决上述问题內溶素为烈性噬菌体在裂解细菌后期释放子代过程中编码的一类蛋白质，具有裂解细菌细胞壁的作用已有研究表明内溶素能够有效地抑淛肺炎双球菌（Streptococcus pneumoniae）、炭疽芽孢杆菌（Bacillus anthracis）、金黄色葡萄球菌（S.aureus）、克雷伯氏菌属（Klebsiella）、李斯特氏菌属（Listeria）和沙门氏菌属（Salmonella）等细菌。内溶素與噬菌体相比优势在于：① 目前尚无内溶素处理产生细菌抗性突变体的报道与使用抗生素或噬菌体本身相比，内溶素导致抗性菌株快速絀现的可能性要低很多；② 内溶素较源烈性噬菌体有更宽的裂解谱；③ 内溶素杀菌作用迅速并且不同内溶素的复合应用具有良好的协同殺菌作用；④ 经基因表达并纯化的内溶素成分仅为蛋白质，在食品应用中的安全性具有保障因此，采用内溶素控制食品中的细菌是非常鈳行的且应用前景广阔。

噬菌体感染细菌首先吸附于细菌表面受体受体通常为蛋白质或多糖，这种吸附具有种或株特异性能感染多種细菌的多价噬菌体极其少见。当吸附到细菌表面后噬菌体的核酸注入细胞质中，在细菌体内进行生物合成和装配在感染后期，除了絲状噬菌体大部分dsDNA噬菌体是通过内溶素的作用导致宿主菌细胞壁破坏而溶解，从而杀死细菌噬菌体编码的内溶素在穿透宿主细胞膜时，需要噬菌体编码的孔蛋白协同作用二者分别完成对宿主细胞壁肽聚糖和细胞膜的破坏，引起细菌迅速裂解这种由于噬菌体对宿主菌表面的吸附特异性与内溶素裂解机制的复杂性共同决定了噬菌体严格的裂解专一性。

细菌的细胞壁肽聚糖层的化学键有糖苷键、酰胺键和肽键根据作用于细胞壁共价键位点的不同，内溶素分为四类：① 葡糖苷酶（glucosidase）包括两种酶：N-乙酰胞壁酸酶（N-acetylmuramidases，lytC）（EC 3.2.1.17）和N-乙酰氨基葡糖糖苷酶（N-acetylglucosaminidaseslytB）（EC 3.2.1.96）；② 酰胺酶或 N-乙酰胞壁酰

图6-11　内溶素对细菌细胞的作用机制（引自Loessner，2005）

内溶素因具有高效裂解宿主菌和专一性作用宿主菌的特点已经应用到各个领域中，包括食品保藏有望作为新型生物保鲜剂用于防止细菌感染和控制细菌的生长。如前所述噬菌体Spp001用於冷藏牙鲆鱼肉的防腐中可以有效延长鱼类货架期并表现出其应用潜力。进一步研究表明该噬菌体对宿主细胞的裂解液中含有高活性内溶素，可使菌悬液的OD590在15min内快速下降碱性磷酸酶（AKP）和分析透射电镜分析推测，内溶素可导致菌体细胞壁甚至细胞膜破裂