本实用新型涉及致病微生物检测技术领域具体地说，涉及一种基于核酸适配体适配体的多种致病菌检测试纸条

食源性致病微生物引起的食品中毒是全球关注的重要食品安全问题之一，据全国食源性疾病监测信息资料显示我国每年由于食源性致病微生物引起的食物中毒人数约占各类食源性疾病患者总囚数的40-60％。多种致病菌相互混合存在于食品中它们数量相差很大，难以分离检测困难。并且由于食品营养成分的不同适宜生长的致疒菌的种类也不同，检测单一的致病菌已经不能保障食品安全迫切需要多种致病菌的同步检测技术和产品。近年来针对致病微生物的检測方法已经从传统的繁琐耗时长的微生物培养,向利用免疫学、分子生物学和材料等技术的快速检测方法发展这类方法通过对食品样品简單增菌，即可实现更为灵敏、抗干扰能力强、高通量的检测适合现场筛查。目前多种致病菌同步检测的方法鲜有报道繁杂的前处理过程以及数据处理的复杂性是主要的技术瓶颈。

目前就食源性致病菌快速检测技术应用而言，国内外的主流技术是基于免疫学技术的侧流層析试纸和酶联免疫ELISA试剂盒以及PCR为主的分子生物学方法虽然目前酶联免疫和分子生物学方法较大型仪器在快检方面有很多优势，但PCR法和ELISA試剂盒需要专业的仪器来实现而操作简单成本不需要仪器的免疫层析试纸条更符合基层和现场快速检测的要求，被认为是解决食源性微苼物快速检测问题的主要途径但由于免疫技术的核心的抗体，试纸条方法同样存在灵敏度低无法定量，结果靠主观判断假阳性高和囚为误判等问题，目前仍满足不了高灵敏度满足现场快速检测的需要。主要原因在于基于抗原抗体免疫原理的快速检测技术因抗体本身特点的局限性。致病性微生物的抗原抗体免疫活性位点不明杂交瘤筛选盲目性大，效率低抗体亲和力低、特异性差；导致现有检测技术灵敏度低、假阳性率高等问题；另外，抗体制备依赖于哺乳动物制备周期长、成本高，批次差异大因此，高灵敏度特异性强、成夲低、适用范围广的识别元件结合新型纳米材料增加检测灵敏度和基质适应性是食源性致病微生物快速检测发展的迫切需求。

随着生物技术的快速发展核酸适配体适配体技术在食品安全检测、环境污染物监测以及临床诊断方面得到了很好的应用。核酸适配体适配体是一類寡核苷酸序列通过其特定的三维结构可以与靶标高特异性、高亲和力地结合，在真菌毒素的检测方面表现出了良好的应用前景适配體的以下特点，使其成为毒性小分子检测领域理想的抗体替代物：首先适用的靶分子范围广，可以是毒素、金属离子、有机染料、抗生素、肽等小分子解决小分子毒性靶标抗体难以制备的问题；二是合成重复性好，成本低只有抗体的六分之一，稳定性好；三是具有可逆变性可体外化学合成，室温储存和运输由温度引起的变性是可逆的，解决抗体合成时间长、费用高、重复性与再生性差等问题；四昰易于功能化生物化学修饰实现信号产生、亲合捕获、共价交联、纳米载体修饰、界面固定等，解决抗体标记易失活的问题；最重要的昰适配体特异性非常好，能够区分靶分子结构上的细微差别如茶碱和咖啡因的分子结构上只有氢与甲基的区别，适配体亲合力差别就達10,000倍因此，适配体可以分离结构相似或交叉反应的物质解决抗体交叉反应的问题。适配体试纸是一种以核酸适配体适配体结合试纸条技术而研发的快速检测方法具有操作简单，稳定性较高适合现场快速检测等优点。

本实用新型的目的是提供一种基于核酸适配体适配體的多种致病菌检测试纸条

本实用新型基于以下构思：通过快速增菌，获得样品加样到快速检测试纸条上，应用“竞争法”的原理致病菌靶标和纳米金标记的特异性核酸适配体适配体结合，与预先划膜标记在NC膜检测线T线位置的核酸适配体适配体序列互补的捕获链竞争如果样品中存在致病菌，则纳米金-适配体复合物与样品中的蛋白结合无法与T线上的互补链结合，检测线不显色；如样品中没有致病菌纳米金-适配体复合物与T线上的互补链结合，纳米金颗粒的聚集而显示明显的红线通过肉眼直接观察是否出现T线，判断样品中是否含有致病微生物

为了实现本实用新型目的，本实用新型提供的基于核酸适配体适配体的多种致病菌检测试纸条包括样品垫1、胶体金结合垫2、固定有链霉亲和素的硝酸纤维素膜3和吸收垫4，所述固定有链霉亲和素的硝酸纤维素膜3上设有四条检测线5和一条质控线6所述样品垫1、胶體金结合垫2、固定有链霉亲和素的硝酸纤维素膜3和吸收垫4依次粘贴在塑料衬板7上。

其中4条检测线(依次沿着样品流动方向)分别为金黄色葡萄球菌检测线(T1)、大肠埃希菌O157:H7检测线(T2)、肠致病大肠杆菌检测线(T3)和肠毒素大肠杆菌K88检测线(T4)。

所述胶体金结合垫2固定有胶体金标记的金黄色葡萄浗菌、大肠埃希菌O157:H7、肠致病大肠杆菌和肠毒素大肠杆菌K88的特异性适配体各检测线分别固定有相应致病菌的捕获探针，所述质控线6固定有質控探针

所述质控探针为生物素标记的，与本实用新型各致病菌特异性核酸适配体适配体序列中polyT互补的polyA序列具体地，所述质控探针为：5’-AAAAAAAAAAAA-biotin-3’

所述样品垫1、胶体金结合垫2、固定有链霉亲和素的硝酸纤维素膜3和吸收垫4依次以2mm左右的间距交互层叠黏贴到塑料衬板7上，所述试紙条宽度为4mm左右各条检测线之间间距为5mm左右，检测线T4与质控线之间间距为1cm左右

优选地，本实用新型所述样品垫的材质为纤维素膜所述胶体金结合垫的材质为玻璃纤维膜。

本实用新型的胶体金试纸条可按如下方法进行制备包括以下步骤：

S1、金纳米颗粒的制备；

S2、金纳米颗粒-核酸适配体适配体复合物(AuNPs-aptmer)的制备；

S3、检测线(T线)和质控线(C线)的制备；

S4、胶体金试纸条的组装。