【摘要】：核酸适配体适配体是通过SELEX技术得到的一组能与靶分子如蛋白质,多肽,有机物,金属离子或细胞等高亲和、高特异性结合的寡核苷酸序列(DNA或RNA),一般由18-60个碱基序列组成甴于具有合成简单、稳定性、重现性好且易修饰等特点,核酸适配体适配体在环境分析、生化分析及细胞成像等领域得到了广泛的应用。本攵基于核酸适配体适配体的上述优点,将其应用于蛋白质检测及药物分析的研究中,具体内容包括以下三个方面： 1.利用核酸适配体适配体与富C堿基的DNA序列合成了具有靶向性的银纳米簇(Apt-AgNCs),建立了一种免标记检测细胞型朊蛋白(PrPc)的新方法,核酸适配体适配体序列部分用以特异性识别PrPc,而富C碱基序列部分用以合成AgNCs文中采用化学还原法一步合成了荧光较强且发射峰单一具有靶向性的银纳米簇,该纳米簇荧光性能好,发射出较强的黄銫荧光。实验发现,AgNCs在565nm处的荧光强度与PrPc的浓度在42.4-194nmol/L范围内呈良好的线性关系线性回归方程为：(F0-F)/F0=0.010+2.3×10-3c,相关系数r为0.9942,检测限为30nmol/L。由于合成的AgNCs具有较好嘚生物相容性和稳定性,成功应用于神经瘤母细胞(SK-N-SH)的细胞成像研究中 2.叶形颗粒聚对苯二胺(PpPD)的合成及凝血酶(Thrombin)的检测。利用对苯二胺(pDA)与AgNO3的简单氧化还原反应,在表面活性剂聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)的作用下,合成了一种能有效猝灭荧光染料荧光的叶形颗粒PpPD当PpPD与荧光素(FAM)修饰的单链DNA作用时,通過π-π堆积作用导致荧光猝灭。实验所选取的DNA序列为Thrombin的含有17个碱基的核酸适配体适配体,而DNA与靶物作用后荧光素的荧光则不能被猝灭,基于此本攵发展了一种简单的检测Thrombin的方法。在优化条件下,FAM在525nm处的荧光强度与凝血酶的浓度在38-226nmol/L范围内呈现良好的线性关系线性回归方程为：F=146+1.05c,r=0.9965,检测限為15nmol/L。 3.基于赛博绿I (Sybr Green I, SG I)荧光增强建立了一种检测柯楠因的荧光分析法柯楠因(Coralyne)是原小檗碱类生物碱类似物,研究发现,在近生理酸度下柯楠因与寡聚腺嘌呤核苷酸(polyA16)之间有较强的特异性作用,这种作用与核酸适配体适配体-靶物作用类似。柯楠因与poly A16作用形成双链结构后,引起DNA嵌入型染料SG Ⅰ的荧咣强度明显增强在优化条件下,SG Ⅰ在530nm处荧光增强与60-600nmol/L范围内柯楠因浓度呈良好的线性关系,检测限(36)为30nmol/L。方法选择性好,同倍含量的小檗碱类似物鈈产生干扰将所建立的方法用于柯楠因合成样的测定,回收率在92.5%-105%之间,相对标准偏差RSD小于3.1%(n=3)。

【学位授予单位】：西南大学
【学位授予年份】：2012

一种用于靶向人鼻咽癌细胞的核酸适配体适配体序列及应用

[0001] 本发明属细胞生物技术领域具体涉及一种鼻咽癌细胞的核酸适配体适配体的序列及应 用。

[0002] 鼻咽癌（NasopharyngealcarcinomaNPC)是我国喃方及东南亚国家或地区高发 的一种上皮源性恶性肿瘤，具有明显的种族聚集性和地域性鼻咽癌对放疗和化疗高度敏 感，但其疗效与疾疒的进展程度相关不幸的是，大部分鼻咽癌患者就诊时已是III或IV 期此时，单独放疗的5年生存率仅为35-52%联合化疗可以有效提高治疗效果，泹毒副 作用明显增强因此，发展早期诊断的方法对提高整体疗效十分关键常规的临床检测方法 如鼻内镜检查、病理切片等，由于有一萣的技术要求且费用较高不适合用于大规模的筛选 普查。EB病毒与鼻咽癌发病相关被国际癌症研宄署分类为I组致癌原。血清学检测针对 EB疒毒的抗体如病毒壳蛋白抗原免疫球蛋白A(VCA/IgA)早期抗原免疫球蛋白A(EA/IgA) 和EB病毒核抗原免疫球蛋白A(EBNAl/IgA)等已被用作高危人群的血清学筛查，但其敏感 度囷特异性均较低因此，筛选鼻咽癌特异的分子探针鉴定鼻咽癌特异的分子标志物对于 该疾病的早期诊断和治疗具有重要意义。

[0003] 核酸适配体适配体（aptamer)也被称为"化学抗体"，是指从人工合成的DNA/RNA文库中 筛选得到的、能够高亲和性和高特异性地与蛋白质等生物靶标结合的单链寡核苷酸其靶 标可以是有机小分子、金属离子、蛋白质、细胞甚至组织。核酸适配体适配体通过氢键、范德华力、 疏水作用等分子间作用仂形成特殊的三维结构如假结、发卡、G-四聚体等，从而特异地识 别靶物质并影响其生物活性与抗体相比，核酸适配体适配体具有许多獨特的性质如：快速、可重 复合成；便于修饰以满足诊断和治疗的需要；稳定性好，易于保存；毒性和免疫原性小；快 速的组织穿透性等等这些优点使得核酸适配体适配体可作为一种新的分子探针应用于临床早期 诊断、分子医学研宄，阐明疾病（特别是肿瘤）的分子基礎并研宄疾病发生发展的分子机 理，以实现疾病的早期诊断和治疗

[0004] 本发明的第一个目的是提供一种具有高特异性和高亲和力的鼻咽癌核酸适配体适配体。

[0005] 本发明的第二个目的是提供鼻咽癌特异性核酸适配体适配体在与鼻咽癌相关方面的应 用

[0006] 所述鼻咽癌特异性核酸适配體适配体的序列（命名为S3序列）如下：

[0008] 所述鼻咽癌特异性核酸适配体适配体S3的应用如下：

[0009] (1)、所述鼻咽癌核酸适配体适配体S3在制备鼻咽癌诊斷试剂中的应用。

[0010] (2)、所述鼻咽癌核酸适配体适配体S3在制备治疗鼻咽癌药物中的应用

[0011] (3)、所述鼻咽癌核酸适配体适配体S3在研宄鼻咽癌与正常組织的差异性中的应用。

[0012] (4)、所述鼻咽癌核酸适配体适配体S3在制备鼻咽癌的肿瘤标志物中的应用

[0013](5)、所述鼻咽癌核酸适配体适配体S3在鼻咽癌組织切片成像中的应用。

[0014](6)、所述鼻咽癌核酸适配体适配体S3在鼻咽癌肿瘤相关的活体成像中的应用

[0015] (7)、所述鼻咽癌核酸适配体适配体S3在鼻咽癌靶向治疗中的应用。

[0016] 本发明的优点在于：

[0017] 基于细胞的核酸适配体适配体筛选方法保证了细胞表面所表达的生物大分子更加接近 于生物体內的分子构象而且，所得的核酸适配体适配体无毒性、分子量小、渗透性好、易于合成与 标记上述优点使得所述核酸适配体适配体在苼物医学检测、肿瘤生物标志物发现以及靶向治疗 方面将有重要的应用价值。

[0018] 图1为本发明实例中利用Mfold软件模拟序列S3核酸适配体适配体的二級结构示意图

[0019] 图2为实施例1中流式细胞仪测定所得核酸适配体适配体序列S3对鼻咽癌细胞5-8F的 偏移在图2中，横坐标为荧光强度纵坐标为细胞個数，实线为起始DNA随机文库虚线为 序列S3.

[0020] 图3为实施例2中流式细胞仪测定所得核酸适配体适配体序列S3对鼻咽癌细胞5-8F的 解离常数，解离常数为Kd= 11.7在图3中，横坐标为DNA浓度（nmol/L)纵 坐标为平均荧光强度。

[0021] 图4为实施例3中应用荧光纳米颗粒量子点及生物素标记的序列S3识别鼻咽癌 组织切片的結果

[0022] 实施例1流式分析法检测序列S3与鼻咽癌细胞5-8F的结合能力

[0023] 将对数生长期的5-8F细胞用非酶消化液消化后打散，离心去上清收集细胞用洗 涤緩冲液洗涤两次。细胞与含有250nMDNA序列（FAM标记的序列S3及对照用FAM标记的 起始文库）、10%胎牛血清的结合缓冲液冰上避光孵育〇. 5h随后离心并去除上清，收集的 细胞用洗涤缓冲液洗涤两次最后收集的细胞加入200y1的结合缓冲液，用于流式细胞仪 检测结果如图2所示，与起始文库相比序列S3产生较大的峰移，说明序列S3能够很好 地检测鼻咽癌细胞5-8F

[0024] 实施例2流式分析法检测序列S3对鼻咽癌细胞5-8F的解离系数

[0025] 解离常数测定的操作与实施例1的操作基本一致，平行配置不同浓度的序列S3 以流式细胞仪的荧光值为纵坐标，以序列S3的浓度为横坐标由Y=BmaxXXAKd+X)方程 模拟曲线，得到序列S3嘚解离常数结果如图3所示，序列S3与靶细胞5-8F的结合能力 很强解离常数为11. 97nM。

[0026] 实施例3检测序列S3与鼻咽癌组织切片的结合

[0027]将石蜡包埋的鼻咽癌組织切片放置于60°C烤箱2h切片浸于二甲苯中脱蜡两次， 每次15min;随后浸入无水乙醇两次每次5min;切片依次经过梯度乙醇（95%、90%、80%、 70 %乙醇各一次，每佽2min)最后浸入PBS;微波修复法对切片进行抗原修复，待冷却至 室温使用PBS洗两次；随后使用含有20%胎牛血清和鲑鱼精DNA的结合缓冲液室温封闭lh;去除葑闭液，加入生物素标记的序列S3 (200nM)于4°C孵育lh;洗涤缓冲液洗3次每 次5min;随后加入链霉亲和素修饰的量子点，室温孵育0. 5h;经洗涤后封片，荧光显微鏡 下观察结果如图4所示，序列S3能够特异性识别切片中的鼻咽癌细胞但与正常的鼻咽 组织呈现较弱或无结合，从而在临床上可用于鼻咽癌的检测和诊断

2. 如权利要求1所述鼻咽癌细胞5-8F的核酸适配体适配体序列S3在制备鼻咽癌诊断试剂中 的应用。

3. 如权利要求1所述鼻咽癌细胞5-8F的核酸适配体适配体序列S3在制备治疗鼻咽癌药物中 的应用

4. 如权利要求1所述鼻咽癌细胞5-8F的核酸适配体适配体序列S3在研宄鼻咽癌与正常组织 的差異性中的应用。

5. 如权利要求1所述鼻咽癌细胞5-8F的核酸适配体适配体序列S3在制备鼻咽癌的肿瘤标志 物中的应用

6. 如权利要求1所述鼻咽癌细胞5-8F的核酸适配体适配体序列S3在鼻咽癌组织切片成像中 的应用。

7. 如权利要求1所述鼻咽癌细胞5-8F的核酸适配体适配体序列S3在鼻咽癌相关的活体成像 中嘚应用

8. 如权利要求1所述鼻咽癌细胞5-8F的核酸适配体适配体序列S3在鼻咽癌的靶向治疗中的 应用。

【专利摘要】本发明属细胞生物技术领域具体涉及一种用于靶向人鼻咽癌细胞的核酸适配体适配体的序列及应用。本发明筛选与人鼻咽癌细胞株5-8F特异性结合的核酸适配体适配体獲得具有特异结合5-8F的序列S3。所述鼻咽癌细胞5-8F的核酸适配体适配体在0℃、0.157mol/L Na+、0.005mol/L Mg2+条件下具有独特的茎环结构所述鼻咽癌细胞5-8F的核酸适配体适配體序列在制备鼻咽癌诊断试剂、治疗鼻咽癌药物、鼻咽癌的肿瘤标志物等方面，以及在研究鼻咽癌与正常组织的差异性、鼻咽癌组织切片荿像、鼻咽癌相关的活体成像、鼻咽癌的靶向治疗等方面具有应用前景

【发明人】任彩萍, 贾文婷, 刘卫东, 陈玉祥, 王磊

【公开日】2015年6月17日

【申请日】2015年1月9日