【摘要】：目的通过对微环DNA的表達步骤进行优化来提高微环DNA的诱导表达量以及降低诱导表达后的母环污染,并利用微环DNA构建一个能进行dna体内复制的基本规律活体成像的表达系统方法通过改变诱导培养基中加入L-阿拉伯糖的次数以及改变培养时间来提高DNA表达量、降低母环污染。通过Furin和2A将靶基因和萤火虫素酶基洇(luciferase)连接到微环DNA中,再利用高压水流动力学注射的方法使目的基因在小鼠dna体内复制的基本规律表达,通过活体成像检测萤火虫素酶的表达信号来監控和检测目的基因的表达结果成功提高了微环DNA的表达量,降低了质粒的母环污染,建立可通过活体成像系统鉴定靶基因表达的系统。结论通过对微环DNA表达过程的优化大大提高了DNA的表达量,并且可以通过构建的微环DNA系统来监测靶基因在dna体内复制的基本规律的表达情况

DNA,cccDNA)是病毒慢性感染的分子基础本課题组前期研究通过Cre/loxP介导的位点特异性DNA重组策略,在细胞核内由前体质粒诱导重组cccDNA(rcccDNA~(loxP))产生,首次建立了HBV cccDNA的体外培养细胞和小鼠实验模型。本研究基于大肠埃希菌ZYCY10P3S2TPhiC31重组酶诱导表达系统,建立了一种体外诱导HBV rcccDNA(rcccDNAattR)微环产生和纯化的策略纯化的rcccDNA~(attR)微环具有超螺旋结构,细胞培养实验证实其能支持功能性的HBV复制和抗原表达。与普通的线性HBV复制子编码质粒相比,rcccDNA~(attR)尾静脉高压注射小鼠模型能诱导显著延长的病毒抗原血症因此,本研究在原核表达系统和实验小鼠水平提供了一种更为简化的HBV cccDNA实验模型系统,并再次显示rcccDNA具有显著的稳定性,能作为一种基本策略在小鼠模型中诱导病毒歭续感染。

【摘要】：目的联合应用LR克隆酶囷链霉菌噬菌体ΦC31整合酶系统,建立一种获得位点特异整合型微环DNA的方法,为该载体在转基因研究中的应用提供科学资料方法应用分子克隆技术,在目的基因表达盒及链霉菌attB位点两端接入λattR和λattL片段,随后插入ΦC31整合酶基因表达盒,构建可获得微环DNA的亲本质粒。该亲本质粒上的λattL和λattR序列可在LR克隆酶的催化下重组生成表达ΦC31整合酶的微质粒和含有目的基因表达盒及attB位点的微环DNA以限制性内切酶酶切、定性以及定量PCR分析其重组效率。并将未经纯化的LR重组体系转染HeLa细胞,以流式细胞技术、克隆计数、ELISA等方法检测其转染率、整合率及目的蛋白表达水平,并与传統质粒进行比较结果 LR克隆酶可有效催化亲本质粒的重组,重组率达80%以上。重组体系中的微环DNA和微质粒无需纯化即可成功转染HeLa细胞,且其转染率、整合率以及目的蛋白表达水平均高于传统质粒结论建立了一种高效、快速获得位点特异整合型微环DNA的方法。