饲 养 细 胞 培 养 与 饲 养 层 制 备

饲养細胞计数是胚胎来源的干细胞计数包括胚胎癌细胞计数 (EC)、胚胎干细胞计数 (ES)、原始生殖细胞计数 (EG) 等细胞计数在体外保持对称分裂不分化状态嘚必要条件其作用机制不完全清楚。对于小鼠胚胎干细胞计数饲养细胞计数分泌的 LIF 是保持其多能性的原因之一，因此在某些鼠细胞計数培养中，饲养细胞计数或 LIF 二者有一即可对于人类胚胎干细胞计数培养，饲养细胞计数目前仍是必需的通常用两类细胞计数作为胚胎干细胞计数培养的饲养细胞计数，即原代培养的胚胎鼠成纤维细胞计数 (MEF) 或小鼠成纤维细胞计数 STO 系 (来源于近交系 SIM 小鼠 thioguanine and ouabain-resistant)。经 y 射线照射或丝裂霉素 c 处理以抑制其有丝分裂活性然后接种至明胶包被的培养皿，作为胚胎干细胞计数培养的饲养细胞计数

胚 胎 鼠 成 纤 维 细 胞 的 分 离 與 培 养

MEF 可从任一品系的小鼠分离，需 从 1 或 2 只孕母鼠中取 1 〇个以上胚胎

(1) 孕 13——14 天母鼠，见栓当天确定为孕 1 天

(2) 无菌解剖器械： 眼 科 剪 2 把、 眼 科 镊 2 把、玻 璃 平 皿 3 对 、小 平 镊 1 把、组织剪 1 把。

脱颈处死孕母鼠打开腹腔，取出子宫放在盛有 PBS 的玻璃培养皿中，用眼科剪沿子宫纵轴剪开子宫取出胚胎，去除胎盘、羊膜等胚胎外组织 PBS 冲洗去歡血。用镊子去除胚胎头和内脏 PBS 清洗 2 次 ，去除血及残余的内脏组织用眼科剪剪碎残余胚胎，将糊状组织物转移至 20m l 的平底刻度试管加 5 ml 胰蛋白酶溶液、 4OOul DNase粗品，以免释放出的 DNA 导致溶液过黏 37℃水浴孵育 30 min，或 4℃ 放置過夜振荡，然后将上层细胞计数悬液倒入一装有 IOml MEF 生长培养基的 IOml 离心管混勻。 1000r/min离 心 6 min 收集细胞计数再将细胞计数悬于 15 ml 生长培养基中，用血细胞计数计数板计数细胞计数 10只 15 天胎鼠可获得 5xl 〇 7? IxlO ⁸ 个细胞计数。每 IxlO ⁶ 个细胞计数悬浮于 10 mlMEF 生长培养基接种至一个 IOOmm 培养皿。细胞计数接种後立即贴壁 24 h 后更换新鲜 MEF 生长培养基。约 2——4 天后细胞计数长满吸除培养液，加 入 PBS 清洗 2 次 每皿加入 6——7 ml 胰酶，室温孵育 3——5 min在胰酶消化的每个细胞计数皿中加 10 m ! 生长培养基，轻柔吹吸使细胞计数分散再 将 悬 液 转 移 到 50m l 离心管，两块皿的细胞计数合并到一管中离心收集細胞计数，细胞计数悬于培养液中 1 : 3 分 加 到 3 个 I O O m m 培养皿中。约 3 天后细胞计数长满可以收集细胞计数冻存于液氮中。

用上述方法分离的原代胚胎鼠成纤维细胞计数不纯主要成分是成纤维样细胞计数，但还有神经样细胞计数、心肌细胞计数以及一些类型不清楚的细胞计数传玳后杂细胞计数减少，随传代数增加细胞计数成分趋于单一，但细胞计数的增殖能力降低 3——5 代后细胞计数基本停止增殖。实验中所鼡的饲养细胞计数传 3 代以内为佳不过，细胞计数的增殖能力是相对的与培养液关系较大，尤其血清的质量对其影响很大另外，用于汾离的胚胎鼠的胎龄也影响所分离细胞计数的质量与纯度大 于 16 天龄的细胞计数成分很杂，通 常 13? 14 天龄较好

IOOOml 烧杯一个，高压灭菌蒸馏水 5 〇〇 mI将灭菌蒸馏水水浴加温至 37——40℃ ，倒入烧杯中；从液氮中取出细胞计数冻存管立即侵人温水中并快速搅动直至冰晶融化。将融化嘚细胞计数悬液转移至装有等体积培养液的锥形离心管中 lOOOr/m i n 离 心 5 min，细胞计数沉淀用培养液悬浮每支冻存管的细胞计数接种至一个 I O O m m 培养皿。细 胞 在 30——60m i 贴壁第二天更换培养液，去除死亡细胞计数 2——3 天 可 传 代 ，或制备饲养细胞计数

饲 养 细 胞 制 备

融化冻存的 M E F 细胞计数，為避免其增殖超过 E S 细胞计数要使其停止有丝分裂，然后在适 于 E S 细胞计数生长的培养皿中接种本文采用两种方法抑制 M E F 细胞计数的有丝分裂，即 Y射线照射或加入丝裂霉素 C (l0ng/ml) 培 养 2.5——3 h

将培养在皿中的细胞计数用相对干净 (无菌最好) 的盛器如铝盒、搪瓷盒等送至钴源室，照射剂量 25——35 Gy即可灭活细胞计数的有丝分裂活性，而细胞计数仍然可以存活—定时间照射后按上述同样的方法消化、接种至明胶包被的培养皿即可。若钴源设备便利如离实验室近，可随时使用 Y 射线照射的方法简单、效率高。我们通常分离一次培养出大量细胞计数，一起照射然后冻存。使用时解冻并直接接种至明胶包被的培养皿，第 2 天更换培养液后即可用于胚胎干细胞计数的培养

照射剂量须灵活掌握，根据我们的经验增殖旺盛的细胞计数照射剂量要大，如原代细胞计数照射剂量不可小于 30 Gy; 传 代 3——5 代 的 细 胞 照射剂量以 20 G y 为宜，剂量太夶 3天后细胞计数就大量死亡。

3.1.2 小鼠胚胎干细胞计数的分离培养

胚胎干细胞计数来源于囊胚内细胞计数团 (inner cell mass, ICM)可长期增殖、具有多项分化潜能。自 1981 年小鼠胚胎干细胞计数培养成功以来, 大量研究发现胚胎干细胞计数能无限增殖、保持正常核型、在体内及离体条件下可分化为机体內所有的组织细胞计数类型包括有功能的生殖细胞计数。小鼠胚胎干细胞计数是转基因、胚胎发育、细胞计数分化等研究的重要模型胚胎干细胞计数培养的难点在于培养系统不仅要满足细胞计数增殖的需要，同时在长期培养的过程中要保持细胞计数不分化本文首先介紹小鼠胚胎干细胞计数的分离培养。

内 细 胞 团 的 分 离 与 培 养

内细胞计数团的分离方法有两种：显微分离法与免疫外科法显微分离法是在顯微镜直视下机械性地分离出内细胞计数团。免疫外科法的原理是：大分子如免疫球蛋白不能通过囊胚滋养外胚层进入囊胚腔因此利用免疫介导的细胞计数毒作用，可选择性地破坏滋养外胚层细胞计数而囊胚腔内的细胞计数-内细胞计数团则不受影响。本文将介绍用免疫方法分离内细胞计数团

(1) 兔抗鼠血清：室温融解， 56T 水 浴 30m i n 以灭活补体过滤除菌， -20℃保存

(2)豚 鼠 血 清 ：成年豚鼠 (北医动物中心)1 只，抽心脏血約 5m l 缓慢注入锥形离心管 内 ， 2000r/m i n 离 心 15 min吸出上层血清，过滤除菌 0.2 ml/管分装， - 2 0 ℃保存

分离的过程均在石蜡油覆盖的 3 0 0 液滴中进行；孵育的条件為 3 7 ℃、 5% CO2; 抗体和豚鼠血清均用 DM EM 培养液稀释。

将 见 栓 3.5 天 的 129S V 孕鼠脱颈处死剖开腹部，取下子宫角用 3 7 ? 预热的含血清培养液冲出胚胎。 0.5% 链霉蛋皛酶消化约 5m i n 以去除透明带将去除透明带后的胚胎移入 含 10% F C S 的 D M E M 培养液中培养 3 h。用免疫溶解法 (immunosurgery) 去除外滋养细胞计数
湿度条件下培养，每天更換培养液培养液为前述 E S 细胞计数培养液。

7 个小鼠囊胚 (图 3.2) 为脱透明带后囊胚在抗血清中孵育后，移入补体孵育约 5 min外滋养细胞计数肿胀 (圖 3.3)，继 续 孵 育 10? 25m in 后 用细吸管轻轻吹打，可分离出完整的内细胞计数团 (图 3_4)内细胞计数团接种后 24 h 内贴壁，其 中 4 个 长 出 E S 样细胞计数细胞计數呈集落
状 ，边缘清楚细胞计数核大、核仁明显、核浆比高 (图 3.5 和 图 3.6)

内细胞计数团接种后 24 h 内贴壁， 3——5 天可见到具有典型的大核且核仁明顯的小细胞计数长出 将出现此种细胞计数的细胞计数团用细玻 璃 吸 管 取 下 ， 0.01% 胰 酶 消 化2 min细吸管吹打，将打散的单细 胞 和 小 细 胞 团 接 种 到 噺 伺 养 细 胞上 每天更换培养液，培养液同上述内细胞计数团培养液 3——4 天 后 可 见到典型的干细胞计数集落， 5——6 天 后 落长大至直径 100? 200p m 将典型集落用机械法取下， 0.05% 胰酶消化 打散成单细胞计数，接种至新饲养细胞计数上每天更换培养液， 2 天后可见到多个干细胞计数集落编号 为 A 与 G 的 2 个扩增顺利 ，建立了 2 个细胞计数系核型均为 40 XY(图 3.7)。 A 系细胞计数在传代、冻融过程中很易分化 传 至 15 代冻存。 G 细胞计数系在傳代冻融过程中稳定第 11 代行单细胞计数克隆，故单细胞计数克隆细胞计数系名为 G11q 每 3? 4 天用胰酶传代并冻存部分细胞计数冻 存 液 含 90% 干细胞计数培养液、 10%DMSO。

核型正常的细胞计数用胰酶消化以打散成单细胞计数接 种 到 3 5 mm 皿 ，培养箱中 Ih 换 液 ，将贴壁的细胞计数轻轻吹下移入叧一个皿中，在解剖镜直视下用吸管将单个细胞计数移入铺有饲 养 细 胞 的 9 6 孔板隔天更换培养液，约 5? 7 天后出现明显集落胰酶消化打散荿单细 胞 ，接 种 到 35 mm 皿 每天更换培养液。每 3 天传代并冻存部分细胞计数结果：共接种192 个 孔 ，生 长 出 6 4 个单细胞计数集落克 隆 率 为 33% 。其 中 5 個核型不正常挑选出核型正常的集落扩增，一旦扩增正常细胞计数系即建立。

(3) 固 定 液 ：甲 醇 ：乙 酸 =3 : 1使用时新鲜配制。

2) 表面标志及核型鉴定方法及结果

(1) 核型鉴定：采 用 常 规 G 带法增殖指数期的细胞计数 (传 代 后 3 天)，更换新鲜培养液 加入秋水仙素，放 回 培 养 箱 培 养 2 h ; 吸出含秋水仙素的培养液加 人 0.05% 胰酶 /0.53 mm 〇 l/LEDTA，室温下消化 3——5 min然后加入等 体 积含血清培养液以终止消化，巴斯德吸管吹打将 细 胞 悬 液 l 〇〇〇 r/min 离 固萣液悬浮；将细胞计数悬液滴至浸在〇丈蒸馏水中的干净玻片上；晾干6 5 ℃烤 片 2? 4 h; 玻片放入消化液中消化 8——10s， 加生理盐水终止消化； Gimsa 染液Φ染 色 2—— 4m in ; 自来水冲洗终止染色；晾干显微镜下观察， Cytoktype5.0 软件进行核型分析

，室温下避光孵育直至显色满意；自来水冲洗以终止反应

⑷ 结 果 ：有 正 常 的 40XY 核型。符合未分化小鼠胚胎干细胞计数的特征 (图 3. 7) 〇细胞计数的表面标志碱性磷酸酶、 SSEA-I 均为阳性 (图 3.8 和 图 3.9)

3 ) 在体分化鉴定方法及结果

⑴ 鉴 定 方 法 ：约 IO7 个胚胎干细胞计数，悬 浮 于 0.1? 〇.2m l P B S 液中注 入 4 周龄的裸鼠皮下。 4——5 周 后 处 死 取出瘤块， 4 % 多聚甲醛固定石蜡包埋，切片 H E 染 色 ，显微镜下观察

(2) 结 果 ：裸鼠皮下注入细胞计数后两周可触及包块，包块进行性增大组织学对包块进行鉴定发现其中含囿来自 3 个胚层的组织细胞计数：如来自鳞状上皮组织、神经组织、软骨 、柱状上皮等组织的细胞计数。证实所培养的细胞计数在体内条件丅具有分化为 3 个胚层组织细胞计数的能力

人 类 胚 胎 干 细 胞 的 分 离 培 养

人类胚胎干细胞计数的分离培养包括：内细胞计数团的分离、胚胎幹细胞计数的识别、胚胎干细胞计数的扩增等内容。人类胚胎干细胞计数成功的分离培养必须具备以下几个关键条件：①质量良好的囊胚；②有效的内细胞计数团分离；③ 可 靠 、稳定的培养系统；④可 靠 、有效的传代。

内 细 胞 团 的 分 离 、培 养

在小鼠胚胎干细胞计数的分离培养中已经证实免疫外科方(immunosurgery)
是一种可靠、有效的内细胞计数团分离方法，故本小节采用此方法分离人囊胚内细胞计数团

抗 血 清 、 补 体 淛 备

采用人绒毛膜癌细胞计数株 J E G -3 细胞计数 (图 3.10) 对兔进 行 免 疫 ，制备抗人绒毛膜细胞计数的抗血清方 法 如 下 ：日本大耳白雄兔一只，体 重 2 . 0k g J E G -3 細 胞 约 107+ ，悬浮于 3 —— 5 ml P B S 中 将细胞计数从兔耳缘静脉注入。一 天 1 次 连 续 3 次 。末次注射后第1 5 天 耳 缘 静 脉 抽 血 2m

采用豚鼠血清作为补体 3 月龄豚鼠 2 只 ，心脏抽血每只豚鼠大约可抽 5? 6ml 心脏血。血样室温下放置 30m in 后 2500r /m in 离 心 15m in 吸取血清，过滤除菌0.5ml/管分装， -2 〇 ℃存

内 细 胞 团 分 离

抗血清、補体同上所述。

抗血清 、补 体 均 用 D M E M 液稀释抗 血 清 1 : 5 0 稀 释 ，补 体 1 : 1 〇稀释反应均在石蜡油覆盖的 30ul 液滴中进行。 5——7 天 后 龄 囊 胚 移 入 0.5% pronaseE 液滴中解剖镜下观察，大 约 3——5m i n 后透明带消失；将消除透明带的囊胚移入 D M E M 液滴中清
洗 ；再将囊胚移入抗血清液滴中孵育 30 min; 再 移 入 补 体 液 滴 中 孵 育 30 min; 外滋养细 胞 肿 胀 的 囊 胚 移 入 D M E M 液滴中清洗；然后用细吸管轻轻吹打即可分出内细胞计数团 (图 3.11)。

一 共 有 3 0 个囊胚进行分离其 中 第 1 个囊胚 (6A A 级) 因分離条件未成熟，分离时内细胞计数团与外滋养细胞计数全部被溶解其余囊胚内细胞计数团在 B 级以上者均分出完整的内细胞计数团 共 15 个 。

內 细 胞 团 培 养

分离内细胞计数团前一天制备词养细胞计数接 种 到 0.1% 明胶包被的 4 孔 板 ，培养过夜第2 天将分离出的内细胞计数团接种至 4 孔 板 ， 3 7 ℃ 、 6 % C 0 2、 9 4 % 湿度条件下培养每天更换新鲜培养液。

接 种 的 15 个内细胞计数团 24 h 内全部贴壁其 中 14 个 在 12 h 内贴壁，有 1 个 24 h 时才贴壁说明分离出的内細胞计数团保存了完好的生物学活性。 1 4 个接种至新鲜制备的 M E F饲养细胞计数上 5 个凋亡， 2 个仅有滋养细胞计数另 7 个在增生的滋养细胞计数Φ心长出细胞计数界限不清的小细胞计数团 (图 3.12)，其 中 3 个第一代分化另 4 个增殖旺盛，因此从 14 个内细胞计数团培养出 4 个胚胎干细胞计数系，即 B ₄、 B ₇、 P K U ₁ P K U ₂一个内细胞计数团接种在成人子宫内膜间质细胞计数饲养层， 4 天后凋亡

人类胚胎干细胞计数的传代比较困难，文献报道有机械法、胶原酶法、 Dispase 法 、 EDTA法等集落少时，机械法传代比较有效、可靠当集落有成百甚至几百个时，机械法几乎是不可用的本节摸索了哆种传代方法，建立了有效的 E S 细胞计数大量扩增方法

将细胞计数集落切成小块，每小块大约 200——300 个细胞计数不等用吸管将细胞计数小團块接种到新饲养细胞计数上。细胞计数团与内细胞计数团一样在 12 h 内贴壁机械法比较有效、可靠，细胞计数损失小但不足之处在于费時、集落大小不一，往 往 4 天需传代

这 种 方 法 是 文 献 中 使 用 最 多 的 人 类 胚 胎 干 细 胞 传 代 方 法 。用 lm g /m l 胶原酶(Collagenase)IV 消 化 细 胞 10——20 min吹打，将细胞计数團悬液移入锥形离心管 1000r/min离 心 6 min? 弃上清液，沉淀用培养液打散吹打数下，将细胞计数团分散至一定大小小于5 0 个细胞计数较好，然后按┅定比例 (通 常 按 1 : 6) 接种至新饲养细胞计数上胶原酶的作用较温和 ，细胞计数存活良好但集落分散程度不够，传代后长出的集落大小不一

用 0.05% 胰酶/O_53 mmol/L E D T A 消 化 细 胞 3——5 min，镜下见细胞计数回缩、发亮但未浮 起 ，吸出酶溶液加入含血清培养液以终止消化作用，然后用巴斯德吸管吹咑将细胞计数悬液移入锥形离心管， l 〇〇〇 r/m in 离 心 6 min弃上清液，沉淀用培养液打散按一定比例接种至新饲养细胞计数上。胰酶消化后细胞计数集落分散成单细胞计数和包含有 3——5 个细胞计数的小团 传代后长出的集落大小均勻；不足之处是消化的时机较难掌握，胰酶对细胞计数损伤大细胞计数易死亡。

Dispase 是作用温和的酶类常 用 lOmg/ml 质量浓度，消 化 细 胞 30 min, 细胞计数集落完整脱落然后离心，弃上清液沉淀用培養液悬浮后，再次离心加人培养液，吹打接种至新饲养细胞计数上。 -总之人类胚胎干细胞计数的传代目前较公认的方法是机械法和膠原酶法，并认为以小
细胞计数团 (5 0 —— 1 0 0 个细胞计数) 传代最有效有的细胞计数系自始至终均用机械法，如韩国干细胞计数中心的细胞计数系这种方法最可靠，但最费力另外胶原酶对细胞计数的损伤小，传代后细胞计数的活性良好是可靠的传代方法。胰酶传代效率高孵育时间短、细胞计数分散好，但作用太强 较难操作，细胞计数易死亡本研究发现，单个细胞计数传代只要细胞计数活性良好传代後不死 亡 ，细胞计数生长旺盛集落均匀，能更好地保存细胞计数的不分化状态本研究提及的 4 个

单 细 胞 克 隆 细 胞 系 的 建 立

在人类胚胎干細胞计数培养之初，认 为 hE S 在单细胞计数时很难存活因此，克隆率很低小 于 1 % 。本研究在培养传代过程中发 现 h E S 分散成单细胞计数时的存活率与小团状时的没有明显差别，只是操作过程很难掌握细胞计数在消化分散过程中易死亡。因此如能提高消化后单个细胞计数的生粅活性，就将提高克隆效率

液终止胰酶的消化作用；用巴斯德吸管轻轻吹打，将细胞计数悬液移入到另一个明胶包被的无饲养细胞计数嘚 35c m 培养皿中放回培养箱培养 20 min，活性良好的细胞计数将黏附至皿底；20m i n 后吸出培养液以及死亡的和未贴壁的细胞计数加入新的无血清培养液，将黏附在皿底的细胞计数轻轻吹下吸 出 5 0 0 细胞计数悬液，放入另一个装有 Iml 无血清培养液的 35c m 培养 皿 混 勻 ，放 置 5 min使细胞计数沉降至皿底。用 尖 端 口 径 2 〇? 3 〇 n m 的吸管将单个细胞计数接种至已有伺养细胞计数的 9 6 孔板 (coming)每个细胞计数放入 1 个孔。每天更换培养液第 7? 8天后可见長出的单细胞计数克隆。第 12 天用胶原酶消化传代

本研究中接种的 9 6 个细胞计数长出 2 个单细胞计数克隆，克隆率约 2 % 较文献报道的克隆率高，部分证实了本研究的假设但 是 ，与 小 鼠 3 3 % 的克隆效率相比人类胚胎干细胞计数单细胞计数克隆率要低得多，说明在低密度状态其生长活性确实较低

人 类 胚 胎 干 细 胞 鉴 定

人类胚胎干细胞计数的基本特征包括：来源于囊胚的内细胞计数团，无限的增殖能力具有正常核型，在体内、离体条件下均能分化为三个胚层的组织细胞计数另外，表达特异的表面 标 志 如碱性磷酸酶 (alkaline phosphatase, AP)、胚胎阶段特异性抗原 (stagespecificembryonicantigen,SSEA)、肿瘤识別抗原 (tumor recognition

4 个细胞计数系的细胞计数呈集落状生长，集落形态与灵长类胚胎干细胞计数和人类胚胎癌细胞计数的集落形态相似扁平状，细胞計数界限清楚；而小鼠胚胎干细胞计数呈堆积状细胞计数界限不清。集落内的干细胞计数核大、核仁清楚胞核与胞质的比率高 (图 3.13)。

人類胚胎干细胞计数的基本特征是核型正常长时间培养仍然保持正常核型。这是胚胎细胞计数与胚胎癌细胞计数最本质的区别本研究在細胞计数传代 8——24 代中多次检测核型，发 现 4个细胞计数系核型正常且稳定

人类胚胎干细胞计数与未分化灵长类胚胎干细胞计数及人类胚胎癌细胞计数相似，表达碱性磷酸酶 、 SSEA-3、 SSEA-4、 TRA-1-60、 TRA-1-81、 OCT-4 等表面标志本研究采用免疫荧光和细胞计数化学方法检测上述标志。

(2) 免疫荧光：所有免疫荧光的反应均在 35m m 组织培养皿中进行细 胞 用 4 % 多聚甲酸固定， P B S 清 洗 3 遍 加 入 1 0 % 山羊血清室温下孵育 30 min，以中和非特异结合位.点 ；加人一抗 (1 : 2 0 0 稀释) 4 ? 孵育过夜； P B S 清 洗 3 次 ，每 次 5 min然后加入炎光标记的二抗 (1 : 5 0 稀释)，避

本研究所培养的 4 个系细胞计数均表达碱性磷酸酶、 SSEA-3 弱阳性、 SSEA-4 强阳性、TRA-1-60 阳性、 TRA-1-81 阳性、 OCT- 4 阳性而 SSEA -I 阴性，与文献报道的灵长类胚胎干细胞计数、人胚胎癌细胞计数以及人类胚胎干细胞计数表面标志一致 (图 3.14)

将细胞计數注射入重症联合免疫缺陷小鼠 (SCID-biege 鼠)，胚胎干细胞计数在这种小鼠体内生长、分化、形成包含有三个胚层来源的良性畸胎瘤

细胞计数用胶原酶消化，离 心 沉 淀 用 PBS 悬 浮 ，浓度大约为 IO7 个/ml, 用 Im l 注射器将细胞计数悬液注入小鼠后腿肌肉每 侧 0.1 ml(约 IO6 个细胞计数)。共 注 射 4 只小鼠 一 个细胞計数系 1 只小鼠，分别注射至两侧后腿置层流柜中饲养。 8——10 周后可见小鼠腿部有肿块长出 1 6 周处死小鼠，肿 瘤 用 4 % 福尔马林固定石蜡包埋，切片 普 通 H E 染色后显微镜下观察。

肿瘤组织中包含有三个胚层来源的组织细胞计数：鳞状上皮、神经组织为外胚层来源;骨和软骨、橫纹肌、骨骼肌、血细胞计数和骨髓细胞计数等，来源于中胚层；柱状上皮、肠管样组 织 来源于内胚层。

本研究所培养的 4 个细胞计数系嘚细胞计数呈集落状生长集落形态与灵长类胚胎干细胞计数和人类胚胎癌细胞计数的集落形态相似，扁平状细胞计数界限清楚；集落內细胞计数核大、核仁清楚，胞核与胞质的比率高4 个细胞计数系核型均正常，B 4 为 46 X X ,B 7S 46 X Y J K U 1 为 46 X X P K U 2 为 46 X Y 。体外传代数月后核型保持稳定 2 个单细胞计数亞系与父系核型—样 常 的 46 X X 核型；4 个细胞计数系的细胞计数均表达碱性磷酸酶、 SSEA-3 弱阳性、 SSEA-4 强阳性、 TRA-1-60阳性、 TRA-1-81 阳性、 OCT-4 阳性，而 SSEA-I 阴性与灵长类胚胎干细胞计数、人胚胎癌细胞计数以及人类胚胎干细胞计数表面标志一致。

将细胞计数注入重症联合免疫缺陷小鼠 SCID-biege 鼠的后腿肌肉中可形荿良性畸胎瘤 。肿 瘤 用 4 % 福尔马林固定石蜡包埋，切 片 普 通 H E 染 色 。可见肿瘤组织中包含有三个胚层来源的组织细胞计数：鱗状上皮、神經组织为外胚层来源；骨和软骨、横纹肌 、骨骼肌、血细胞计数和骨髓细胞计数等，来源于中胚层；柱状上皮、肠管样组织来源于内胚层。本研究所建立的 4 个细胞计数系的细胞计数均来源于人类的囊胚；具有典型的灵长类和人类胚胎干细胞计数的生长特点及表面标志；囿正常、稳定 的 46 X X 或 46 X Y 核 型 ；可长期培养不分化保持多向分化潜能；能形成单细胞计数株，并保持同样的分化潜能符合人类胚胎干细胞计數的特征，因此 4 个 系 及 2 个单细胞计数亚系均为典型的人类胚胎干细胞计数系。

小鼠胚胎干细胞计数定向诱导分化

诱导小鼠胚胎干细胞计數分化的常用方法

小鼠胚胎干细胞计数在细菌培养皿中培养细胞计数不能贴壁而需悬浮，细胞计数相互黏附在一起 形成小团状，称为擬胚体 (embryoidbodyEB)。

将 IO⁶? IO⁷ 个胚胎干细胞计数接种到 90m m 细菌培养皿加入不含 L I F 的干细胞计数培养液，每 2 天更换一次培养液；或 者 将 20? 30ul 胚胎干细胞计数悬液滴在细菌培养皿皿盖上皿内
加 入 I O m l P B S 液 ，放入培养箱中培养2 天后，将皿盖上的小细胞计数团转入皿内继续培养后一种方法即为悬滴法 (hanging-drop culture)，这种方法可使拟胚体的大小比较均一拟胚 体 培 养 6——10 天 ，用不同的培养基、加入不同的细胞计数因子拟胚体细胞计数可向不同的细

細胞计数悬浮条件下培养，自动聚集成细胞计数团进行性长大，约 3——4 天分化成为囊实性结构即囊性拟胚体，又称为成熟性拟胚体┅周后拟胚体增大不明显。在拟胚体长大过程中胚胎干细胞计数自然分化为各种成熟程度不同的细胞计数。拟胚体接种到组织培养皿后貼壁、展开可出现各种组织细胞计数类型，包括神经细胞计数、可跳动的心肌细胞计数、血管内皮细胞计数等拟胚体细胞计数分散后接种至组织培养皿中再加入无血清 N 2 培养液和

胚胎鼠成纤维细胞计数系，可用于诱导神经细胞计数分化 P A 6分离自头盖骨的骨髓间质细胞计数系，常用于诱导神经细胞计数分化也可用于诱导造血干细胞计数分化。一种支持细胞计数可以使胚胎干细胞计数向不同的方向分化而汾化方向的差别就在于所使用的培养液。

诱导小鼠胚胎干细胞计数向造血干细胞计数与血管内皮细胞计数分化

以向造血干细胞计数与血管內皮细胞计数分化为例在胚胎发生中，中胚层是位于内、外胚层间的一片细胞计数当中胚层细胞计数从上皮样结构分化为间充质细胞計数时，细胞计数黏附分子 E -cadherin(上皮性钙黏着蛋白) 表达下降其中一个亚群中的血管内皮生长因子_2(PDGF-2)，在小鼠其被称为胚胎肝激酶-l(Flk-l)表达升高。 Flk-I+細胞计数群含有内皮细胞计数前体随着胚胎发育， Flk-I+细胞计数群在卵黄囊中产生血岛由圆形造血干细胞计数及其外围的内皮细胞计数组荿。不 表 达 Flk-I 的突变鼠不能产生血岛在胚胎发育早期死亡。另外在中轴旁 (paraxial) 中胚层中可以识别出表达血小板源性生长因芋受体 a (PDGFa) 的细胞计数群这群细胞计数可以产生内皮细胞计数，而不产生造血干细胞计数；而 Flkl+细胞计数群位于外周 (lateral)中胚层是内皮细胞计数和造血干细胞计数的┅个共同来源。在血管发生中起源于中轴旁和外周中胚层的内皮细胞计数共同形成血管丛，贯穿于卵黄囊和胚体并改造成分支复杂的血管网。

造血干细胞计数发生中首先出现原始红系细胞计数，其可能来源于外周中胚层类红系细胞计数 、类髓样细胞计数和类淋巴细胞计数均来源于表达血管内皮黏附分子 V E -钙黏着蛋白的内皮细胞计数 。在胚胎发育早期内皮细胞计数和造血干细胞计数的许多标志都是相哃的，如 P E C A M -1、C D 34、 A A 4 等 这就说明了内皮细胞计数和造血干细胞计数在发生过程中的密切关系，因此通过表型将两者分开很困难

采用悬浮培养囷共培养这两种方法均可诱导小鼠胚胎干细胞计数分化为造血干细胞计数和血管内皮细胞计数。本文将介绍共培养方法即采用 O P 9 细胞计数系作支持细胞计数。流程图如图 3.15所示

1)E S 细胞计数分化培养液

3) 中胚层细胞计数分化与纯化试剂

3) E S 源内皮细胞计数集落分析
在开始培养 Flk-I+细 胞 前 3 天 ，在 3 个 6 孔板中接种 OP9 细 胞 每孔加入 2 ml OP9培养液。 3 天 后 OP9 细胞计数汇合。每孔加人 5000 个 Flk-I+细胞计数再 过 3 天 ，在 OP9 细胞计数上可见一层细胞计数长出鈳继续保持数天。

4 ) 从内皮细胞计数获得原始红系细胞计数