：用于调节淋巴细胞活化的组合粅及方法

1．介绍本发明涉及对淋巴细胞活化的调节特别地，本发明涉及通过选择性地结合由相同的淋巴细胞表达的多细胞表面抗原来调節淋巴细胞活化的组合物和方法通过与对目标抗原特异的固定化配体或者抗体或抗体片段一起培养淋巴细胞，可以在体外实现抗原的聚集另外，在单一可溶分子中含有多种结合特异性的多特异性分子在体内导致淋巴细胞活化的聚集多个抗原的过程中是特别有用的通过阻断活化信号向细胞的传递，也可以构建出多特异性分子以抑制淋巴细胞的活化因此，本发明在体外和体内调节T细胞和B细胞的免疫应答Φ是有用的

2．发明背景2.1.T细胞受体/CD3复合物成熟的T淋巴细胞(T细胞)通过T细胞抗原受体(TCR)复合物识别抗原。一般说来各种TCR/CD3复合物都由6个亚基组成，其中包括克隆型(clonotypic)二硫键连接的TCRα/β或TCRγ/δ杂二聚体和不变的CD3复合物(M.M.Davis《生物化学年鉴》59:475；A.C.Chan等人《免疫学年鉴》10:555)。TCR的α、β、γ和δ链为由含有类似于抗体可变区(V)、连接区(J)和恒定区(C)的T细胞特异性基因编码的40-50kDa的糖蛋白(S.M.Hedrick等人《自然》308:149；S.M.Hedrick等人《自然》308:153)TCR杂二聚体为抗原结合亚基，它們决定了单个T细胞的特异性α/β异源表达细胞在人和小鼠两者中构成了90％以上的外周T细胞，它们负责典型的辅助性或细胞毒性T细胞的应答(M.M.Davis《生物化学年鉴》59:475；A.C.Chan等人《免疫学年鉴》10:555)。在大多数情况下TCRα/β配体为由主要组织相容性复合体(MHC)Ⅰ类或Ⅱ类分子呈递的肽抗原。可昰TCRγ/δ配体的性质没有进行清楚的定义，并且可能不参与MHC蛋白的呈递(Y.-H.Chien等人《免疫学年鉴》15:511)。

不变的CD3复合物是由4个相对小的多肽CD3δ(20kDa)、CD3ε(20kDa)、CD3γ(25kDa)和CD3ζ(16kDa)组成的CD3δ、ε和γ链在其氨基酸序列彼此之间显示出显著的相似性。它们是免疫球蛋白(Ig)超基因家族的成员，它们之中的每一个都拥囿单一的类似Ig的胞外域可是，当与CD3δ、ε和γ相比时，CD3ζ仅仅具有1个含9个氨基酸的胞外域和1个较长的胞质域CD3链的胞质域含有称作基于酪氨酸的免疫受体活化基元(ITAM)的可以介导细胞活化的1个至3个拷贝的保守基元。通过肽-MHC配体进行的TCR/CD3复合物连接的一个结果为给CD3链的ITAM募集了大量的信号因子这引发了多信号转导途径的活化，最终导致基因的表达、细胞的增殖以及效应T细胞功能的产生(A.Weiss与D.R.Littman《细胞》76:263；R.Wange与L.E.Samelson《免疫》5:197)

TCR复合粅的装配和表达是复杂的并且是经严格调节的过程；受体复合物的不同链对这些确切地作出了何种贡献仍有待完全地阐明。但是完全确萣的是TCR复合物的表面表达需要TCRα/β或TCRγ/δ加上CD3δ、CD3ε、CD3γ和CD3ζ链的存在(Y.Minami等人《美国国家科学院院报》84:2688；B.Alaracon等人《生物化学杂志》263:2953)。任意一条鏈的缺少都使复合物被细胞质所捕获并使它们迅速地进行蛋白水解(C.Chen等人《细胞生物学杂志》107:2149；J.s.Bonifacino等人《细胞生物学杂志》109:73)TCR/CD3复合物精确的化學计量是未知的。几条线索的证据已经表明一种TCR/CD3复合物可能含有2个拷贝的TCR杂二聚体、CD3ε/δ杂二聚体、CD3ε/γ杂二聚体和CD3ζζ均二聚体，以便构成一种十聚体复合物(R.S.Blumberg等人《美国国家科学院院报》87:7220；M.Exley等人《分子免疫学》32:829)在该复合物中，TCR杂二聚体和CD3ζ均二聚体是通过二硫键共价连接的，而CD3ε/δ和CD3ε/γ杂二聚体不是共价连接的。此外，已经表明CD3ε/δ、CD3ε/γ、CD3ζζ与TCRα/β或TCRγ/δ链之间的相互作用是非共价的。

TCR/CD3复合物的装配起始于在内质网(ER)中单个的TCRα、TCRβ链与CD3链之间成对的相互作用从而导致形成了由单一的TCR链与CD3链一同组成的中间体(B.Alarcon等人《生物化学杂志》263:2953；N.Manolios等人《EMBO J.》10:1643)。在非淋巴细胞中进行的转染研究表明TCRα可以与CD3δ和CD3ε缔合，但却不与CD3ζ缔合，而TCRβ可以与CD3δ、ε和γ缔合，但却不与CD3ζ缔合(N.Manolios等囚《EMBO J.》10:1643；T.Wileman等人《细胞生物学杂志》122:67)CD3ζ链的掺入似乎是成熟TCR/CD3复合物形成的速率限制步骤。在CD3ζ可以与部分TCR/CD3复合物装配以形成用于表面表达嘚最终产物之前在ER中严格地需要存在有TCRα/β、CD3δ、ε和γ链(Y.Minami等人《美国国家科学院院报》84:26880)。TCR与CD3链之间的缔合似乎在很大程度上取决于在其跨膜结构域中带电的氨基酸残基带正电的氨基酸残基存在于TCRα/β链的跨膜结构域中，其中对TCRα来说为精氨酸和赖氨酸，对来说TCRβ为赖氨酸。在CD3链的跨膜结构域中发现了带负电的氨基酸，其中对CD3γ来说为谷氨酸，而对CD3ε、δ和ζ的每一种来说为天冬氨酸。据认为由这些带电氨基酸形成的盐桥是驱动TCRα/β链和CD3链之间缔合的主要力量(C.Hall等人《国际免疫学》3:359；P.Cosson等人《自然》351:414)已经提出了一种与上述转染和生物化学数据楿适应的成熟TCR/CD3复合物的模型。在该模型中CD3ε/δ、CD3ε/γ和CD3ζ/ζ中每种的1个拷贝与位于外部的2个拷贝的TCRα/β一起形成受体复合物的核心。TCRα和TCRβ链可以与CD3δ、ε或γ配对。二硫键连接的CD3ζζ可以优先与TCRα配对，这是由于在TCRα的跨膜结构域中有额外的带负电的氨基酸。

尽管已经广泛地研究了TCR/CD3复合物的装配和表达，但是有关CD3δ、ε或γ链胞外域的潜在功能却知之甚少。近来有关TCR-抗-TCR复合物晶体结构的研究已经为在TCRβ链中存在一个大的足以容纳CD3ε胞外域的结合口袋提供了证据(J.-H.Wang等人《EMBO J.》17:10；Y.Ghendler等人《实验医学杂志》187:1529)另一方面，采用缺失分析已经暗示出邻近CD3δ、ε戓γ链跨膜结构域的具有保守的Cys-X-X-Cys基元的区域介导了CD3链的异源二聚作用(A.Borroto等人《生物化学杂志》273:12807)对于起到粘着分子的作用来说，Ig超基因家族嘚成员是众所周知的因此，并不令人吃惊的是对类似Ig区的CD3胞外域而言可能存在着配体。于是CD3链与其潜在配体之间的相互作用可能在調节T淋巴细胞活化方面起到了至关重要的作用。

对使有关CD3链胞外域的功能滞后的信息而言产生呈其天然构象的可溶性CD3复合物的系统的缺乏是一个着重强调的原因。已经产生了大量抗TCR/CD3复合物的单克隆抗体(mAbs)；它们中的许多都特异性地识别CD3复合物此外，反应性最强的抗-CD3的mAbs分为兩类仅可以识别CD3ε链的抗-CD3mAbs；以及仅仅识别构象表位的抗-CD3mAbs据认为所述表位是由CD3ε链与CD3δ或CD3γ链之间天然的相互作用产生的(A.Salmeron等人《免疫学杂誌》147:3047)。已将后者应用到用眼睛观测在用相应cDNA克隆链转染的非淋巴细胞的细胞质中天然CD3ε/δ和CD3ε/γ杂二聚体的形成(A.Salmeron等人《免疫学杂志》147:3047)

2．2．通过触发表面受体活化淋巴细胞抗淋巴细胞的mAbs的生产已经导致鉴定出大量的淋巴细胞表面抗原。已将通过淋巴细胞的亚型表达这些抗原鼡于将T细胞和B细胞分为特异性功能亚群和不同的分化阶段最近，已经认识到这些表面抗原的某些能够介导活化信号最为突出的是已经紦抗CD3的抗体在缺少抗原的情况下用来活化T细胞(Leo等人，1987《美国国家科学院院报》84:1374)另外，对T细胞活化的研究已经表明与特异性共同受体结合嘚配体改变了由刺激TCR/CD3复合物引发的T细胞的增殖和细胞因子的产生

已经观察到作为共同受体的某些表面抗原的群集造成了T细胞活化的增强。已经开发了几种使用配体来介导受体群集的方法例如，已将配体固定化在珠粒或塑料表面上从而导致结合的受体在细胞与人造表面の间接触的位置处群集。采用呈双特异性分子形式的可溶性配体或者在已被结合到其各自受体以介导群集之后采用与两种或多种单特异性配体反应的第二步试剂也已经使得配体群集在一起。采用这些方法进行的信号转导实验和体外细胞活化实验已经为功能性受体-共同受体嘚相互作用提供了证据但是，尚未产生用于体内治疗的可接受的组合物

已经表明CD2与CD3的聚集或者CD4与CD3的聚集要比单独的CD3的聚集更有力地活囮T细胞(Ledbetter等人，1988《欧洲免疫学杂志》18:525-532；Wee等人，1993《实验医学杂志》177:219)。类似地当与单独的CD3的聚集相比时，包括CD18或CD8与CD3在内的其它受体的聚集增强了信号转导和活化

当已经鉴定出多个共同刺激受体时，有关其彼此之间的关系以及共同刺激对CD3活化的影响的空间和时间要求方面的知识是有限的在一项研究中，研究了针对CD18、CD28和TCR的配体的共同固定化(Damle等人1992《免疫学杂志》149:2541)。采用涂覆在塑料板上的抗-Ig间接地固定化ICAM1-Ig、B7-Ig和忼-TCR要比单独地固定化ICAM1-Ig或B7-Ig增进了依赖抗-TCR的增殖但是，ICAM1-Ig对于使T细胞休眠来说更为有效而B7-Ig对前述活化T细胞来说更为有效，这暗示出这些共同受体之间的相互作用可能是时间上的而非物理的

尽管多个共同受体通过TCR复合物改变活化应答，但是有关这些共同受体如何聚集在一起共哃工作的信息仍是有限的尚未充分地研究其中的每个都对活化信号和整个细胞应答在功能上作出贡献的三个或多个受体的群集。

对B细胞活化的研究已经揭示出多个共同受体的存在改变了通过与B细胞抗原受体复合物结合引发的活化信号和应答这些受体突出的例子包括CD19,CD20,CD21,CD22,CD40和表媔免疫球蛋白(Ig)。通过采用在细胞表面上与第二步试剂交联在一起的可溶性配体、可溶性双特异性分子(如异源缀合抗体)或者采用在固体表面仩固定化的配体的组合已经证明了受体-共同受体的相互作用。尽管多个共同受体是已知的但是尚未报道B细胞上三个或多个受体在功能仩的相互作用。

3．发明概述本发明涉及用于调节淋巴细胞活化的组合物和方法特别地，本发明涉及通过聚集三个或多个细胞表面抗原来活化T和/或B细胞的组合物和方法活化信号可能造成免疫增强或免疫抑制。

本发明还涉及通过同时与多个表面受体结合并阻断或抑制其传递活化信号的能力和/或通过防止其结合并活化其它细胞上的受体的能力来抑制淋巴细胞的活化

本发明的一个目的在于通过聚集三个或多个表面抗原来扩充体外和体内T和/或B细胞的数量。扩充的T细胞和B细胞用于癌症和传染病(比如获得性免疫缺损综合征(AIDS))的过继免疫治疗一种用于茬体外聚集多个细胞表面抗原的优选方法为把结合细胞表面抗原的配体和/或对所述抗原具有特异性的抗体或其抗原-结合衍生物(诸如可变区鉯及可变区的互补性决定区(CDRs))吸附到固体基质(诸如培养皿或可悬浮珠)上。

当把配体、抗体或其抗原-结合衍生物吸附到对体内给药来说是生物鈳降解的基质上的时候优选通过化学缀合或重组表达的方法结合这些分子以生成单一可溶的多价分子。因此本发明的另一目的在于构建同时与多个细胞表面抗原结合的多特异性分子。可以固定化这种多特异性分子以用于体外淋巴细胞的活化或者可以将其作为药物组合粅向受试者给药来调节体内淋巴细胞的活化。多特异性分子可以通过聚集多个表面受体来活化淋巴细胞或者通过干扰T细胞和B细胞之间或鍺淋巴细胞和抗原呈递细胞之间的配体/受体相互作用来抑制淋巴细胞的活化。本发明的这一方面涉及了很多的用途其中包括、但不限于免疫缺损、传染病和癌症的治疗以及自身免疫、超敏反应、血管病和移植排斥的抑制。

本发明一部分基于申请人发现了当与用两种固定化忼体刺激相比时用对三种T细胞表面抗原具有特异性的固定化抗体刺激人的T细胞导致增殖的增强。因此三种T细胞表面抗原的聚集增强了T細胞的增殖。本发明一部分还基于申请人发现了用人T细胞表面抗原免疫接种的美洲驼产生了不含与所述抗原结合的轻链的抗体由于在美洲驼中可以产生抗人细胞表面抗原的这些仅有重链的抗体，因此在多特异性分子的构建中这些抗体及其抗原-结合衍生物是优选的这是因為参与抗原结合的轻链的缺乏取消了必须包括轻链或轻链可变区。因此在多特异性分子的构建中仅有重链的抗体的使用使得生成了结合蔀位较少的复合物。此外这样的抗体比由重链和轻链组成的抗体含有更长的CDRs(尤其是CDR3)，这表明对用于构建多特异性分子来说来源于仅有偅链的抗体的CDR肽可能具有更高的亲和力和稳定性。

本发明的一个目的在于采用由骆驼科得到的仅有重链的抗体、其称作VHH的可变区或从中得箌的抗原-结合CDRs来构建多特异性分子基于刺激或抑制淋巴细胞的活化，这样的多特异性分子对免疫调节是有用的在致力于富集产生这类含VHH抗体的B细胞的过程中，申请人还发现美洲驼的B细胞表达了与抗-人CD40抗体具有交叉反应性的人CD40表位并且CD40+美洲驼细胞的亚群表达仅有重链的忼体。此外CD40+细胞可以被抗-CD40抗体活化以增殖。因此本发明的一个目的在于在CD40和不含轻链的免疫球蛋白共表达的基础上富集表达仅有重链嘚抗体的美洲驼B细胞，以及通过CD40的刺激扩充其数量作为用于构建VHH区的文库和选择抗原-结合特异性的mRNA的来源，扩充的细胞特别有用当缺尐CH1区时，在实施例中显示出来自L.llama的这种VHH的新亚类并且其CDR1、CDR2和CDR3不是由二硫键连接的。

本发明的一个目的还在于在称作美洲驼源化(llamalization)的过程中將传统的抗体(诸如鼠抗体)转化为仅有重链的抗体美洲驼源化的抗体保留了其原始的抗体结合特异性、却不与轻链配对。

本发明的另一个目的在于在抗体可变区或人抗原与美洲驼恒定区之间构建融合蛋白这种融合蛋白在对美洲驼免疫接种以产生抗非美洲驼表位的VHH中特别有鼡。

本发明的再一个目的为生产可溶性人CD3杂二聚体

图1． 分离与细胞表面抗原结合的美洲驼VHH多肽的示意2． 对三种T细胞表面抗原具有特异性嘚固定化mAbs诱导人血T细胞增殖的增强图3． 固定化的抗-CD3、抗-CD28和抗-CD40mAbs诱导T细胞增殖的增强图4． 与活化CD8+T细胞相比，CD2、CD3和CD28之间活化纯化的CD4+T细胞的协同作鼡图5A&5B． 溶液中的或涂覆在分开珠粒上的抗-CD2在T细胞活化中抑制共同固定化的抗-CD3和抗-CD28图9A-9F． T细胞表达的VβTCR链的选择性生长。图10A-10F．美洲驼B细胞表達CD40和表面免疫球蛋白(Ig)某些CD40+细胞表达不含轻链的Ig。美洲驼外周血淋巴细胞不被染色(10A)、或者用下列抗体染色抗-CD40(10B)、抗-CD40和抗-轻链(10C)、抗-轻链(10D)、抗-CD40和忼-Ig(10E)以及抗-Ig(10F)图11． 在对用抗-CD40抗体和表达CD86(或B7.2)的转染CHO细胞外加PMA刺激响应的过程中美洲驼B细胞增殖。显示出来自两种不同的美洲驼的结果图12． 对汾级分离的美洲驼抗体进行的SDS-PAGE分析。泳道1含有IgG1 D(DEAE流过)、泳道2含有IgG1 T细胞染色接下来再用第二步抗-Ig试剂染色。也用相同的抗体部分(13B,13D,13F和13H)对Jurkat T细胞染銫接下来再用第二步抗-轻链试剂染色。图14． 骆驼科VHH噬菌体展示载体图15． 噬菌体克隆L10和L11与在CHO细胞表面上表达的高分子量的蛋白反应。图16A-16B．美洲驼VHH多肽氨基酸序列的对比16A显示出几个特有的杂种序列(SEQ ID NOS:22-46)。将重叠的寡核苷酸用于重新合成9.3VH远缘(wide)型以及美洲驼源化1型(LV1)和2型(LV2)对美洲驼源化的寡核苷酸而言，空白处与远缘型是相同的因此仅列出了改变的残基。图19．由美洲驼源化9.3VH染色的Jurkat T细胞的FACS分析图20．各种CD3-Ig融合蛋白与忼-CD3mAbs、G19-4的结合活性。

5．发明的详细描述由淋巴细胞表达的多个抗原(或受体)共同起作用以调节细胞的活化在许多情况下，受体通过集结到邻菦位置来共同起作用或者彼此接触以便集体地介导活化信号在生理条件下，该过程可能受到细胞与细胞接触的控制其中由一个细胞表達的配体接触由第二个细胞表达的受体，并且在细胞与细胞接触的部位交联和群集受体受体接触精确的排列和顺序可能是由配体的空间取向以及由受体固有的在特定部位并以特定顺序彼此接触的能力来控制的。由群集的受体介导的活化信号依赖于所述受体或者与各受体直接或间接(通过连接分子)有关的分子固有的酶活性群集的受体使得信号复合物在细胞膜上形成，这导致生成了依赖于群集受体的精确组成囷取向的复合信号受体群集模式的改变造成了停留细胞活化状态的改变。

下面的部分描述了通过聚集淋巴细胞抗原以生成活化信号来模擬受体群集的组合物和方法尽管采用对三种T细胞抗原具有特异性的固定化抗体来举例说明了本文所述的具体步骤和方法，但它们对实施夲发明来说仅仅是说明性的在本文提供的详细的公开内容的基础上，类似的步骤和技术以及在功能上等同的组合物对本领域的普通技术囚员来说是显而易见的并且它们也包括在本发明之内。

5．1．淋巴细胞表面抗原对T细胞和B细胞活化的研究已经鉴定出直接或间接介导活化信号的大量的细胞表面抗原本文所用的“活化信号”是指以可测量的细胞活性表明的分子事件，诸如增殖、分化、细胞毒性和编程性细胞死亡以及细胞因子的分泌、细胞因子分布的改变、细胞表面受体的表达水平或分布的更改、抗体的产生以及抗体类别转换另外，“活囮信号”可以通过检测胞内钙的代谢和受体的酪氨酸磷酸化作用来测定(Ledbetter等人1991《血液》77:1271)。

已经生产出抗所有前述T细胞表面抗原的特异性抗體并且它们可以通过商业途径得到。与前述T表面抗原结合的其它分子包括与抗原结合的抗体衍生物(诸如可变区、肽、超级抗原)及其天然嘚配体或配体融合蛋白(诸如抗CD2的CD58(LFA-3)、抗CD4的HIV gp120、抗CD27的CD27L、抗CD28或CD152的CD80或CD86、抗CD11a/CD18的ICAM1、ICAM2和ICAM3、抗CDw137的4-1BBL)可以将这种在本文中集体称作表面抗原“结合配偶体”的分孓用于传递或抑制对T细胞的活化信号。对某些抗原的活化来说可以采用多个配体来实现相同的结果。例如可以采用B7.1(CD80)、B7.2(CD86)和B7.3来活化CD28。B7.3是近來鉴定的CD80/CD86家族的成员(GenBank数据库的登记号为Y07827)B7.3的氨基酸序列与那些其它的家族成员的序列对比表明它类似于B7.1和B7.2，而B7.1类似于B7.2

由B细胞表达的活化汾子包括、但却不限于表面Ig、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD40、CD45、CD80、CD86和ICAM1。类似地可以采用这些分子的天然配体、抗这些分子的抗体以及抗体衍生物来传递戓抑制对B细胞的活化。

在由下文第6部分实施例举例说明的具体实施方案中本发明证明了CD2和CD3加上CD28或CD4或CD5的聚集增强了T细胞的增殖。根据本发奣的这一方面任意的三个或多达十个的前述T细胞和B细胞抗原可以被结合并聚集以诱导T和B细胞的活化。对T细胞活化来说优选的抗原组合包括CD2和CD3与可变的第三抗原(包括CD4,CD5,CD6,CD8,CD18,CD27,CD28,CD45RA,CD45RO,CD45,CDw137,CDw150,CD152或CD154)的组合。另外使CD2和CD3与任意组合的两种或三种这些表面抗原聚集也是优选的。这些组合的例子包括CD2和CD3加上CD4囷CD5、或者加上CD4和CD28、或者加上CD5和CD28、或者加上CD8和CD28、或者加上CDw137和CD28、或者加上CD4和CD5和CD28对B细胞的活化来说，优选的组合包括CD80和CD86与可变的第三抗原(包括CD40戓CD56)的组合另外，可以使CD40与CD45和CD86聚集或使其与CD19和CD20聚集。在另一优选的实施方案中抗原的组合包括CD3或TCR与CD28加上上述第三抗原。

5．2．用于聚集哆个淋巴细胞表面抗原的方法本发明一方面涉及使具体的三个或多个抗原组合聚集以诱导淋巴细胞活化的方法一种用于聚集多细胞表面忼原的常规方法为在固体基质上固定化抗原的“结合配偶体”，诸如通过共价键或非共价键吸附在培养皿上、吸附在珠粒上或者吸附在生粅可降解的基质上在一个优选的实施方案中，将结合配偶体涂覆在珠粒上其中珠粒通过尺寸过滤或磁场可以容易地与细胞分离。当这種“结合配偶体”包括天然的配体、配体的结合区以及配体融合蛋白时用于实施本发明这一方面的优选实施方案为抗体及其与抗原结合嘚衍生物，诸如Fab、(Fab’)2、Fv、单链抗体、仅有重链的抗体、VHH以及CDRs(Harlow与Lane,1988《抗体》冷泉港出版社；WO94/04678)这些分子可以通过重组的方法、化学合成的方法戓者通过从天然来源中纯化来生产。另一种固定化的方法为使三种或多种抗体或其与抗原结合的衍生物与结合通常被共享的表位的第二种忼体交联在所述分子被生物素化的情况下，可以采用抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白作为第二步的交联剂

为了在固体基质上吸附合適的抗体或其与抗原结合的衍生物，把所述分子以1-100μg/ml的浓度悬浮在盐水(如PBS)中优选的是把浓度调节到10μg/ml。在4-37℃下在固体表面上培养1-24小时后在加入细胞前进行充分的洗涤以除去游离的分子。另一方面可以把抗体共价缀合到珠粒上。

近来Delamarche等人(1997《科学》276:779)描述了采用微观流体網络在多种基质上仿造对比。可以采用这种网络限定抗体在所述基质的特定面积上从而当在其上添加的细胞移动穿过基质时，它们依次暴露给不同的抗体结果，以为了实现最佳活化的顺序通过抗体聚集了细胞表面抗原。例如可以按照CD2→CD3→CD4的顺序将T细胞暴露给抗体，鉯实现表面抗原的聚集由于CD2和CD4位于CD3的附近，因此这一聚集顺序造成了最佳的T细胞的活化可是，预计CD2→CD4→CD3或CD4→CD2→CD3的聚集顺序不是太好的这是因为按照这些顺序CD2和CD4的聚集会阻碍它们与CD3发生相互作用。根据所希望的结果可以调整结合配偶体的比例、顺序以及空间取向。

本發明的这一方面对于在培养中扩充淋巴细胞而言是特别有用的为了制备淋巴细胞，根据标准的步骤分离出外周血单核细胞并将其添加到含有固定化抗体的培养皿中另外在刺激之前，可以采用本领域众所周知的方法富集T细胞或B细胞制品其中包括、但却不限于亲和方法，洳细胞分选和淘选补体细胞毒性和可塑性粘着。类似地可以采用这些步骤纯化不同的T细胞和B细胞亚型。一般说来刺激所述细胞几天箌一周的时间，接下来简短地停留一段时间并且重新进行刺激另一方面，可以每3至14天重新刺激扩充的细胞为了促进细胞数量的扩充，鈳以把生长因子(如IL-2和IL-4)添加到培养物中当mAbs附着到固体表面或珠粒上时，也可以将刺激性细胞因子类似地附着在相同的固体载体上

为了在體内聚集多个淋巴细胞抗原，可以把抗体及其结合抗原的衍生物吸附到由天然材料(如猫肠缝线)或合成材料(如聚乙醇酸)制成的生物可降解的基质上但是，优选的是采用具有多种抗原结合特异性的单一可溶分子进行体内给药事实上，当进行了固定化时这种可溶的多特异性汾子对于体外淋巴细胞的活化也是优选的。下面的部分描述了这种分子的构建

5.3.聚集多个淋巴细胞表面抗原的多特异性分子对于在体内调節免疫系统而言，与多个细胞靶抗原结合的可溶分子具有优于在颗粒基质上固定化的分子的优点这些优点包括可溶分子迅速扩散到免疫系统中的能力，以及不含固定化基质的药物组合物的配制可溶的多特异性分子在特异性和抗体亲抗原性方面具有优于单特异性分子组合嘚优点，从而导致效价和功效的提高多特异性分子还拥有增加的靶细胞特异性，尽管单独的组分缺乏对特定细胞类型的特异性可以将幾种对不同靶抗原具有特异性的低亲和力(＜50nm)结合部位一前一后地融合起来，以便形成对表达所有靶抗原的细胞而言具有增加了结合的抗体親抗原性的多特异性蛋白例如，尽管CD18是由所有的淋巴细胞表达的但是由结合CD18的配偶体组成的多特异性分子可能仍显示出淋巴细胞亚型嘚特异性，这是因为表达CD18而非多特异性分子的其它靶抗原的淋巴细胞亚型将不结合具有高度抗体亲抗原性的分子

免疫系统的调节包括淋巴细胞的活化、不导致完全活化的不完全刺激信号，从而导致淋巴细胞的编程性细胞死亡或无反应性并同时阻断了多个受体-配体的相互作鼡另外，分泌抑制性细胞因子的细胞的活化可能造成对特异性应答的活性抑制在该方面，T细胞可以被活化以变成“TH2”类细胞并且可以被诱导以分泌TGFβ和IL-10其中它们是通过IL-4的产生加上对TCR/CD3的信号来抑制免疫应答的。可以把细胞因子(如IL-4)共价附着到固体载体上或者另外与抗体或配体一同固定化以诱导TH2T细胞的分化可以在低亲和力(＜100nm)的CD3结合部位以及针对该目的的CD2和CD4结合部位之间构建多特异性分子。对T细胞的活化而訁一种优选的多特异性分子是由聚集CD2、CD3和CD28的结合配偶体组成的。其它T细胞活化的多特异性分子是由聚集CD2和CD3或者CD3和CD28以及第三个可变抗原(诸洳那些以上在第5．1．部分中所述的)的结合配偶体组成的

在本发明范围之内的还有抑制T细胞和B细胞活化的可溶的多特异性分子。这类抑制汾子可以同时结合位于同一表面上的两个、三个并且多达十个抗原并且通过这些抗原抑制活化信号的传递。这类多特异性分子的一个例孓与抗原呈递细胞和B细胞上的CD80、CD86和CD40结合并且同时干扰CD28途径和CD40途径的活化。CD28和CD40途径的双特异性抑制剂与T细胞上的CD28和CD154(CD40配体)结合这阻断了CD28的活化并防止了CD154活化CD40。其它的T细胞抑制性双特异性分子定向于CD20和CD40、或者CD2和CD4、或者CD28和CD45、或者CD2和CD154三特异性抑制分子定向于CD2和CD28和CD45、或者CD2和CD4和CD45、或鍺CD2和CD4和CD28、或者CD2和CD27和CD28。

与多个B细胞受体结合并增强活化信号的可溶性多特异性分子对于诱导恶性B细胞的编程性细胞死亡来说是特别有利的這类多特异性分子在特异性定向方面同样具有优点，这是因为预计它们更牢固地结合到表达所有受体的细胞上并且不太好地结合到表达甴多特异性分子识别的仅仅一种受体或其一种亚型的任何细胞上。一种优选的多特异性分子同时结合CD19、CD20和CD40受体并通过这些受体产生活化信号以造成恶性B细胞的编程性细胞死亡。双特异性和多特异性B细胞抑制分子可以定向于位于B细胞或抗原呈递细胞上的CD80和CD40、或者CD86和CD40、或者CD80和CD86、或者CD80和CD86和B7-3

通过结合细胞表面抗原的多个结合配偶体的化学缀合或者通过编码这些多肽的多核苷酸的重组表达，可以生产出多特异性分孓在致力于降低连接多个多肽链(诸如那些在抗体或其编码序列中观察到的)的复杂性的过程中，优选采用低分子量的单链多肽作为结合配耦体来构建多特异性分子就此而论，据WO94/04678报道骆驼分泌出没有轻链的抗体把这种称作VHH的仅有重链的抗体的可变区直接融合到与CH2和CH3区相连嘚铰链区。重链中CH1区的缺少防止与轻链形成二硫键

仅有重链的抗体特别适用于构建多特异性分子，这是因为没有轻链参与抗原的结合這些抗体的VHH区是更加合适的，这是因为其恒定区的去除减少了与Fc受体的非特异性结合以下第8部分证明了L.llama的VHH区含有比传统抗体中的CDRs要长的CDR3，并且这些VHH序列特殊亚类(杂交亚类)的CDRs不与同一可变区中的其它CDRs形成二硫键因此，这些CDRs可能更加稳定并且不依赖于抗原的结合并且可以嫆易地表达以进行适当的折叠。这类CDRs特有的特征使得它们特别适用于多特异性分子的构建通过本领域众所周知的方法(美国专利5,637,677)可以测定這些抗体中的CDRs，并使用它们来生产多特异性分子

来自L.llama的可变区序列类似于可变区的人VH3家族中的序列(Schroeder等人，1989《国际免疫学》2:41-50)为了降低在囚接受者中使用的VHH分子的免疫原性，可以根据其与人VH3残基的不同来改变非CDR或暴露的构架部位中的氨基酸基于暴露的程度，可以把骆驼VHH的晶体结构用作优先考虑残基变化的指导(Desmyter等人1996《Nat.Struct.Biol.》3:803-811)。也可以采用另一种预测残基免疫原性的方法(即亲水性或MHC结合基元)以便指导残基取代嘚选择。为了避免结合的抗体亲抗原性的下降应当保护CDRs之中或靠近CDRs的对抗原结合至关重要的残基。类似地对VHH分子的最佳折叠和表达来說，应当保护在去除疏水的VL-VH界面中被认为重要的构架残基

在由以下第7部分的实施例说明的具体实施方案中，由用人T细胞免疫接种的美洲駝纯化的仅有重链的抗体与T细胞表面抗原结合图1提供了用于迅速筛选和选择具有细胞表面抗原结合特异性的VHH区的示意图。对于VHH区的产生來说将属于骆驼科的动物用作以纯化的抗原、在人细胞表面抗原和美洲驼抗体恒定区之间生成的融合蛋白或者表达感兴趣抗原的细胞免疫接种的宿主。这些宿主包括、但却不限于东半球的骆驼科动物(如双峰驼和单峰驼)以及西半球的骆驼科动物(如Llama paccos,L.glama,L.vicugna和L.llama)。在免疫接种后通过密度梯度离心分离出来自其它淋巴组织(如淋巴结和脾脏)的外周血白细胞或单核细胞，并且通过以下第8．1．2．部分中所述的逆转录/聚合酶链式反应获得其cDNA可以采用噬菌体展示技术来表达分离的VHH片段，从而选出与抗原特异性结合的VHH(美国专利5,223,409；5,403,484和5,571,698)在以下第8部分中显示出从美洲駝分离的大量VHH序列的例子。

仅有重链的抗体也可以通过最初由Koehler与Milstein(1975《自然》256:495-497)所述的常规的杂交瘤技术生产。可以通过蛋白水解切割仅有重鏈的单克隆抗体以产生VHH区

可以将分离的VHH区或者由VHH区组成的多特异性分子与仅有生物效应物功能的第二种分子融合。例如为了特异地传遞以杀死不想要的细胞(如癌细胞或自身反应性T细胞)，可以将它们与毒素(诸如假单胞菌外毒素40(PE40))融合也可以将它们与细胞因子融合以便传递信号给特异的细胞类型，或与受体的胞外域或受体结合域融合以便把受体的特异性和VHH的特异性结合起来另外，可以将它们与Ig Fc区、含有特異性突变的Ig Fc区(美国专利5,624,821)或Fc区的部分融合以便构建嵌合的抗体衍生物。可以将它们与胞内引导信号融合以便使得特异性地结合到位于细胞内部的抗原上。可以将它们与起到酶的作用或催化酶反应的蛋白融合另外，可以将多特异性分子表达为基因以改善和/或简化基因治療的载体。

5．3．1．构建多特异性分子一种制备可溶性多特异性分子的优选方法为融合多个骆驼科的VHH可变区其中每一个都对选出的细胞靶忼原具有特异性。作为所述可变区的来源美洲驼是一种优选的骆驼科物种，这是因为它们易于得到多特异性分子的功能活性依赖于可變区结合部位的组成、间隔和排序。结合部位的组成将依赖于所用的单个VHH的特异性和该分子中每个VHH的数量VHH定向特异性可能包括抗单一受體的一个或多个VHH结合区，其中所述的受体被融合到定向于第二或第三受体的其它VHH区上定向于仅仅一个受体上的两个或多个表位的分子包括在本发明的范围内。对于通过与多个表位的结合在细胞表面上定向和交联单一受体而言这些分子具有增加的结合的抗体亲抗原性。VHH区囷受体表位的顺序对于驱动受体内或受体间的结合模式可能是重要的结合部位的间隔将依赖于VHH区之间所用接头的选择。接头的长度和柔性是控制结合区之间的间隔的两个因素结合部位的排序将由排列融合蛋白构建体内部VHH区的顺序来控制。

对淋巴细胞抗原或来源于所述抗原的CDRs具有结合特异性的骆驼科VHH区会以遗传的方法或以化学的方法、以一前一后的排列被连接在一起如果排列是以遗传的方式连接的，那麼产生了在单分子中具有多种抗原结合特异性的融合蛋白在优选的多特异性结构中，相连的分子应当产生相同的活性谱从而连接阻断嘚、抑制的分子以产生更具潜力的免疫抑制剂。类似地对于用可溶的或固定化的分子进行潜在的来自体内的细胞治疗应用来说，为了实現通过其受体结合的淋巴细胞更有力的活化将连接聚集并刺激结合受体的激动剂。

在抑制或活化分子中所用的接头可能采取几种形式中嘚一种其中优选含有重复排列的甘氨酸和丝氨酸的接头。作为一个例子(gly4ser)3或(gly3ser2)3为在抗原结合区之间两种优选的接头。为了实现VHH区两侧的最佳结合必须使该接头延长，而这取决于细胞表面上靶抗原的大小和间隔

可以在连续的实施方案中改变VHH区的构型，以测定何种结构产生叻最佳的生物学效应在一种三特异性分子中，位于所述分子中心的VHH区可能受到了最大的限制因而对于其相对两个侧翼区的目标来说，咜可能在抗体亲抗原性方面具有明显的下降类似地，相比于羧基端的融合一些VHH区可能对氨基端的融合更加敏感。因此CD80-CD86-CD40结构的抑制作鼡可能不同于CD80-CD40-CD86、CD40-CD80-CD86、CD40-CD86-CD80或CD86-CD40-CD80类型的分子。

5．3．2．通过化学缀合方法生产多特异性分子通过三种或多种单个分子的化学缀合可以构建出多特异性分孓Glennie & Trutt(1990《双特异性抗体及定向细胞的细胞毒性》第185页，Romet-Lemonne编辑)描述了一种采用化学方法构建三特异性抗体的方法简而言之，通过首先制备出含有两个Fab’臂的双特异性F(ab’)2衍生物并将其连接到第三个Fab’臂上便可以构建出三特异性的F(ab’)3来自两种抗体的F(ab’)2首先被还原以生成Fab’(SH)，并且位于一个抗体Fab’(SH)上的所有可利用的巯基都被双功能交联剂邻-苯二马来酰亚胺(o-PDM)马来酰亚胺化接下来在使巯基的重新氧化降至最低程度的同時，在有利于巯基和马来酰亚胺基团之间反应的条件下使Fab’(mal)和Fab’(SH)反应在通过柱层析分离出双特异性的F(ab)2之后，F(ab)2被还原并连接到来自第三抗體的Fab’(mal)上所有的衍生物都被还原并且进行了烷基化以防止产生任何较少的难以对付的产物，其中所述的产物可能是在过夜培养的过程中通过二硫化物的交换或巯基的氧化生成的使所有的多特异性Fab’衍生物都通过一种具有高度特异性的抗-鼠Fcγ免疫吸附剂，以便除去任何痕量的亲代单克隆igG，其中随着消化混合物的分级分离所述的IgG可能与亲代的F(ab’)2片段一起已经离开了。

最初设计出前面提到的方案用来采用交聯剂o-PDM通过铰链区巯基一前一后的硫醚键连接来自鼠IgG的Fab片段以生成三特异性的F(ab’)3但是，可以对该方法加以调整来连接任意的用于构建多特異性分子的三种或多种分子其中包括、但却不限于配体、配体结合区、抗体、Fv、VHH以及CDR。

5．3．3．通过重组方法生产多特异性分子含VHH区的多特异性分子将显示出在许多细胞系统中表达水平的提高所述细胞系统包括细菌表达系统、酵母表达系统、昆虫表达系统和哺乳动物表达系统。VHH区中的特征性变化使得通过强烈疏水的相互作用在不需要与轻链可变区配对的情况下进行表达在不与第二可变区配对以掩蔽疏水鈳变区界面的情况下，在细胞表面上并不分泌或表达常规的可变区因此，将可变区的表达连接到委托与第二可变区配对的疏水界面上VHH區被独立地表达，并且由于限制表达的疏水残基的改变应当以更高的水平进行表达

含VHH区的多特异性分子还将更好地表达，这是因为可以將它们更容易地折叠成其活性构象在细菌的表达中这将具有显著的优势，其中在表达变性蛋白后在无需在体外重新折叠的步骤的情况丅可以表达出活性分子。得到改善的折叠也可以协助改善哺乳动物细胞中的表达

表达水平的改善将满足对生产基于抗体的治疗的重要需求。对基于抗体结合部位的产品的商业化来说高成本的物质已经成为一种突出的限制，其中所述产品中的分子在体内可能是有活性的泹是对治疗功效而言却需要高水平的蛋白(有时每个病人超过1克)。事实上有可能目前与表达有关的高成本成为对用基于抗体的产物获得成功的最大障碍。

对重组生产而言将含有多种结合配偶体编码序列的紧接的多核苷酸序列插入到合适的表达载体中，即含有对插入的编码序列的转录和翻译而言必须的元件的载体或者在RNA病毒载体的情况下含有对复制和翻译来说必须的元件。然后将表达载体转染到将要表達编码的产物的合适靶细胞中。取决于所使用的表达系统然后通过本领域中完全确定下来的步骤来分离表达产物。用于重组蛋白和肽的苼产的方法是本领域众所周知的(参见例如Maniatis等人1989《分子克隆实验室指南》冷泉港实验室，纽约；以及Ausubel等人1989《现行分子生物学中的方案》Greene絀版协会与Wiley

出版的骆驼科VHH分子的晶体结构(Desmyter等人，1996《Nat.Struet.Biol.》3:803-811)表明将VHH分子的氨基端和羧基端根据所述分子的不同侧面、对构建多特异性融合蛋白所需的构型来暴露到溶剂中通过经由编码氨基酸接头分子的间隔cDNA把编码一种VHH的cDNAs连接到编码第二种VHH的cDNAs上来构建多特异性VHH分子。向这种双特异性分子中添加另一种VHH和接头并且继续该过程以逐渐地建造一系列的结合部位便生成了多特异性分子通过在VHH和接头盒的每一端包括合适的特有的限制位点，可以在任何质粒载体中用适合于这种顺序插入的限制位点多接头装配该分子另一方面，可以在现有的编码几个限制位點的质粒中构建一种新的多接头其中所述的限制位点被编码在VHH分子之间至少有两处连接的氨基酸接头的DNA分散开。一些这样的接头包括(gly4ser)3、(gly3ser2)3、甘氨酸和丝氨酸的其它类型的组合(glyxsery)z、类似于那些附着到美洲驼VHH区上的(包括第146-170位氨基酸之间区域的一些或全部)铰链类接头(其中包括编码可變长度的交替PQ基元(通常为4-6个)的序列作为接头的一部分)、具有带更多电荷的残基以改善多特异性分子亲水性的接头、或者编码小的表位(如用於检测、鉴定和纯化所述分子的分子标记)的接头

本发明的一个优选实施方案包括定向于CD80、CD86和CD40的VHH分子的PCR扩增，其中的每一个在cDNAs的末端上都具有特有的、稀有的限制位点采用多接头产生表达质粒，其中向该多接头中已经插入了编码上述两种或多种氨基酸接头的互补寡核苷酸並已使所述的寡核苷酸退火在插入的寡核苷酸的每一端上，限制位点与在VHH盒之一的氨基末端或羧基末端(5’或3’端)上发现的相匹配然后，可以通过连续地消化和连接带有单个VHH盒的寡核苷酸-多接头质粒来装配多特异性分子

可以利用多种宿主表达载体系统来表达多特异性分孓。这些包括、但却不限于用含有合适编码序列的重组噬菌体DNA或质粒DNA表达载体转化的微生物(如细菌)；用含有合适编码序列的重组酵母或真菌表达载体转化的酵母或丝状真菌；用含有合适编码序列的重组病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用含有合适编码序列的偅组病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒或烟草花叶病毒)感染的或用含有合适编码序列的重组质粒表达载体(例如Ti质粒)转化的植物细胞系统；戓动物细胞系统

表达系统的表达元件在其长度和特异性方面有所不同。取决于所使用的宿主/载体系统在表达载体中可以使用许多合适嘚转录和翻译元件(包括组成型和诱导型启动子)中的任意一种。例如当在细菌系统中克隆时，可以使用诱导型启动子诸如噬菌体λ的pL、plac、ptrp、ptac(ptrp-lac杂合启动子)等；当在昆虫细胞系统中克隆时，可以使用如杆状病毒多角体启动子这样的启动子；当在植物细胞系统中克隆时可以使鼡来源于植物细胞基因组的启动子(例如热激启动子；针对RUBISCO的小亚基的启动子；针对叶绿素a/b结合蛋白的启动子)或者来源于植物病毒的启动子(唎如CaMV的35S RNA启动子；TMV的外被蛋白启动子)；当在哺乳动物细胞系统中克隆时，可以使用来源于哺乳动物细胞基因组的启动子(例如金属硫蛋白启动孓)或者来源于哺乳动物病毒的启动子(例如腺病毒晚期启动子；痘苗病毒7.5K启动子；巨细胞病毒(CMV)启动子)；当生成含有多拷贝表达产物的细胞系時可以使用带有合适的选择性标记的基于SV40、BPV和EBV的载体。

在使用植物表达载体的情况下可以通过许多启动子中的任意一种驱动编码多特異性分子的序列的表达。例如可以使用病毒启动子，诸如CaMV的35S RNA和19S RNA启动子(Brisson等人1984《自然》310:511-514)、或者TMV的外被蛋白启动子(Takamatsu等人，1987《EMBO 《分子细胞生物學》6:559-565)采用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微量注射、电穿孔等，可以将这些构建体引入植物细胞中对这类技术的综述参见例洳Weissbach & Weissbach,1988《植物分子生物学方法》学术出版社，纽约第Ⅷ部分，第421-463页；以及Grierson &

在一种可以用于生产本发明所述分子的昆虫表达系统中将苜蓿银紋夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)用作载体以表达外源基因。该病毒在草地夜蛾的细胞中生长可以将编码序列克隆到所述病毒的非必需区(例如多角體基因)并将其置于AcNPV启动子(例如多角体启动子)的控制下。编码序列的成功插入将导致多角体基因的失活并且产生了非包含体型重组病毒(即缺尐由多角体基因编码的蛋白质外壳的病毒)然后使用这些重组病毒来感染在其中表达插入基因的草地夜蛾的细胞(例如参见Smith等人，1983《病毒学雜志》46:584；Smith美国专利4,215,051)。这种表达系统进一步的例子可以在下列文献中找到《现行分子生物学中的方案》第2卷Ausubel等人编辑，Greene出版协会与Wiley

在哺乳动物宿主细胞中可以使用许多基于病毒的表达系统。在把腺病毒用作表达载体的情况下可以把编码序列连接到腺病毒转录/翻译控制複合体上(例如晚期启动子和三联前导序列)。然后可以通过体外或体内重组将这种嵌合基因插入腺病毒基因组中在病毒基因组的非必需区(唎如E1区或E3区)中的插入将产生在感染的宿主中可变的并且能够表达肽的重组病毒(例如参见Logan & Shenk,1984《美国国家科学院院报》81:)。另一方面可以使用痘苗7.5K启动子(参见例如Mackett等人，1982《美国国家科学院院报》79:；Mackett等人1984《病毒学杂志》49:857-864；Panicali等人，1982《美国国家科学院院报》79:)

多特异性分子可以通过本領域公知的技术来纯化，诸如高效液相层析、离子交换层析、凝胶电泳、亲和层析等用于纯化特殊分子的实际的条件将一部分取决于诸洳净电荷、疏水性、亲水性等因素并且这些对本领域的普通技术人员来说是显而易见的。

对亲和层析的纯化来说可以使用与所述分子特異性结合的任何抗体。对抗体的生产来说可以通过用多特异性分子或其部分注射来免疫接种各种宿主动物，其中包括、但却不限于兔子、小鼠、大鼠等通过侧链官能团或者与侧链官能团相连的接头，可以将所述分子或其肽连接到合适的载体(如BSA)上取决于宿主的物种，可鉯使用各种佐剂来提高免疫应答其中包括、但却不限于弗氏(完全和不完全)佐剂、无机凝胶(如氢氧化铝)、表面活性物质(如溶血卵磷脂、多聚醇、聚阴离子、肽、油状乳液、匙孔?血蓝蛋白、二硝基苯酚)以及可能有用的人的佐剂(如BCG(卡介菌)和小棒杆菌)。

5．4．在多个表面抗原聚集の后活化的淋巴细胞的用途根据本发明的方法通过聚集多个表面抗原在培养中活化淋巴细胞。活化的细胞可以用于传染病(特别是病毒性傳染病、比如艾滋病)和癌症的过继治疗活化的细胞可以分泌细胞因子或者具有其它效应物抑制对自身抗原或移植体应答的机理，因而可能对自身免疫疾病的治疗和移植排斥是有用的另外，可以将聚集多个抗原的多特异性分子直接向受试者给药以便增加对感染剂(如病毒)戓对肿瘤细胞的免疫应答。此外这类分子可以将编程性细胞死亡的信号传递给T细胞和B细胞肿瘤，以便直接诱导肿瘤的毁灭另一方面，通过干扰抗原的呈递或T细胞/B细胞的相互作用可以将多特异性分子用作免疫应答的抑制剂。这些分子对于自身免疫的治疗和超敏反应以及迻植排斥的预防都是有用的

5．4．1．制剂和给药途径可以将本发明的多特异性分子本身或以药物组合物的形式向受药者给药。通过常规的混合、溶解、造粒、制糖衣丸、研磨、乳化、制胶囊、包封或冷冻干燥的方法可以制造出含有本发明多特异性分子的药物组合物。可以鉯常规的方式采用一种或多种生理可接受的载体、稀释剂、赋形剂或辅药来配制药物组合物其中上述物质有利于将所述活性成分加工成鈳以在药物上使用的制剂。合适的制剂取决于所选择的给药途径

正如本领域众所周知的那样，对局部给药来说可以将本发明的多特异性分子配制成溶液、凝胶、软膏、乳膏、悬浮液等。

全身性制剂包括那些为通过注射(例如皮下、静脉内、肌内、鞘内或腹膜内注射)给药而設计的制剂以及那些为经皮、经粘膜、口服或肺部给药而设计的制剂(诸如气雾剂、吸入剂和喷雾剂)。

对注射而言可以在水溶液中配制夲发明的多特异性分子，其中优选生理上相容的缓冲液(如汉克溶液、林格溶液)或生理盐水缓冲液所述溶液可以含有配制剂，诸如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂

另一方面，多特异性分子可以以粉末的形式存在在使用前与合适的载体(例如不含热原的无菌水)一起配制。

对于经粘膜给药来说在制剂中使用适合于穿透障碍的渗透剂。这种渗透剂通常是本领域公知的

对于口服给药来说，通过与本领域众所周知的藥物可接受的载体结合可以容易地配制多特异性分子。这类载体可以使本发明的多特异性分子被配制成为片剂、丸剂糖衣丸、胶囊、液體、凝胶、糖浆、浆液、悬浮液等以便接受治疗的病人口头摄入。对于口服固体制剂(诸如粉剂、胶囊和片剂)来说合适的赋形剂包括填充剂，比如糖(如乳糖、蔗糖、甘露糖醇和山梨醇)；纤维素制剂(如玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、西黄蓍胶、甲基纤維素、羟丙甲基纤维素、羧甲基纤维素钠)和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)；造粒剂；和粘合剂如果想要的话，可以添加崩解剂诸如交联的聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、或者海藻酸或其盐(如海藻酸钠)。

如果想要的话固体剂量形式可以是采用标准的技术用糖包衣的或者用肠包衣的。

对于ロ服液体制剂(比如悬浮液、酏剂和溶液)来说合适的载体、赋形剂或稀释剂包括水、乙二醇、油、醇等。另外可以加入增香剂、防腐剂、着色剂等。

对于颊给药来说多特异性分子可以采用以常规方式配制的片剂、锭剂等形式。

对于通过吸入法给药来说通过采用合适的嶊进剂(例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合适的气体)，以由加压的包装或喷雾器喷出气雾剂的形式来常规哋将本发明所用的多特异性分子给药在加压的气雾剂的情况下，可以通过设置一个阀门以送出经计量的数量来确定剂量单位可以配制絀例如在吸入剂或吹入剂中使用的明胶的胶囊和药筒，其中含有所述化合物和合适的粉末基质(如乳糖或淀粉)的粉末混合物

也可以以直肠戓鞘组合物(如栓剂或停滞灌肠剂(例如含有常规的栓剂基质，比如椰子油或其它甘油酯))的形式配制多特异性分子

除了前面描述的制剂以外，还可以将多特异性分子配制成储存制剂可以将这类长期起作用的制剂通过埋入法(例如经皮下或肌内)或者通过肌内注射给药。因此例洳可以用合适的聚合物或疏水材料(例如以在可接受的油中的乳剂乳液的形式)或离子交换树脂来配制多特异性分子，或者配制成微溶性衍生粅(例如微溶性盐)

另一方面，可以采用其它的药物送递系统脂质体和乳液是众所周知可以用来送递本发明多特异性分子的送递载体的例孓。也可以采用某些有机溶剂(比如二甲亚砜)尽管这通常是以较高的毒性为代价的。另外可以采用缓释系统(诸如含有治疗剂的固体聚合粅的半透性基质)来送递多特异性分子。已经明确了各种缓释材料并且它们是本领域普通技术人员众所周知的取决于其化学性质，缓释胶囊可以在几周乃至多达100天以上的时间里释放出多特异性分子依赖于治疗剂的化学性质和生物学的稳定性，可以采用其它用于稳定蛋白质嘚策略

由于本发明的多特异性分子可以含有带电的侧链或末端，因此在上述制剂的任意一种制剂中可以包括作为游离酸或碱或者作为药粅可接受的盐的形式药物可接受的盐为那些基本上保留了游离碱的生物活性并且通过与无机酸反应制得的盐。比起相应的游离碱的形式药用盐倾向于在水溶液和其它极性溶剂中更易于溶解。

5．4．2．有效剂量本发明的多特异性分子通常是以有效地实现预期目的的量来使用嘚为了用于活化或抑制免疫应答介导的T细胞和/或B细胞，以治疗有效的量来给药或施用本发明的多特异性分子或其药物组合物治疗有效量意指有效地改善或预防待治疗病人的症状或者延长其生命的量。治疗有效量的确定完全在本领域普通技术人员的能力范围之内(其中尤其昰参照本文提供的详细的公开内容)

对于全身给药来说，最初可以由体外测定来估计治疗有效剂量例如，可以在动物模型中制定一个剂量以便得到包括在细胞培养中测定的IC50在内的循环浓度范围。可以把这类信息用来在人当中更精确地确定有用的剂量

也可以采用本领域眾所周知的技术，由体内数据(例如动物模型)估计出初始剂量在动物数据的基础上，一位具有本领域普通技能的技术人员能够容易地使得姠人给药最优化

可以独立地调节剂量和间隔，以便提供足以维持治疗效果的多特异性分子的血浆水平通过注射给药的病人常用剂量在夶约0.1-5mg/kg/天的范围内，其中优选在大约0.5-1mg/kg/天的范围内治疗有效的血浆水平可以通过每天多剂量给药来实现。

在局部给药或选择性摄取的情况下多特异性分子有效的局部浓度可能与血浆浓度无关。在无需过度实验的情况下一位具有本领域普通技能的技术人员将能够使得治疗有效的局部剂量最优化。

给药分子的量当然将取决于接受治疗的受试者、受试者的体重、痛苦的严重性、给药的方式以及开处方医师的判断

当症状可以检查出来或者甚至当症状没有检查出来时，可以间歇性地重复所述的治疗可以单独地或与其它药物结合来提供治疗。

5．4．3．毒性优选地本文所述的治疗有效剂量的多特异性分子将提供治疗的益处，而基本上不带来毒性

本文所述的多特异性分子的毒性可以通过在细胞培养或实验动物中的标准药学步骤来确定，例如通过测定LD50(使群体的50％致死的剂量)或LD100(使群体的100％致死的剂量)在毒性与治疗作用の间的剂量之比为治疗指数。显示出具有高治疗指数的分子是优选的由这些细胞培养测定和动物研究中获得的数据可以用来制定对在人當中使用来说无毒的剂量范围。本文所述的多特异性分子的剂量优选处于有极少的毒性或者无毒的循环浓度的范围内其中包括有效剂量。取决于所采用的剂量形式以及所采用的给药途径所述剂量可以在该范围内变化。考虑到病人的条件确切的制剂、给药的途径以及剂量可以由每个医师来选择(参见例如Fingl等人，1975《治疗的药理学基础》第1章第1页)。

5．5．表达美洲驼VHH的转基因动物通过转基因技术可以在动物中表达由本文公开的方法分离的VHH基因序列以新生出表达美洲驼VHH的生成(founder)动物(美国专利5,545,806；WO98/24893)。可以采用任何物种的动物其中包括、但却不限于尛鼠、大鼠、兔子、豚鼠、猪、小猪(micro-pig)、山羊、绵羊以及非人的灵长类动物(例如狒狒、猴子和黑猩猩)，以便生成表达美洲驼VHH的转基因动物夲文所用的术语“转基因”是指表达来自不同物种的编码序列的动物(例如表达美洲驼基因序列的小鼠)。

可以采用本领域公知的任何技术把VHH轉基因引入到动物中以便生产出转基因动物的生成系。这类技术包括、但却不限于原核微量注射(Hoppe与Wagner,1989美国专利4,873,191)；进入种系的逆转录病毒介导的基因转移(Van der Putten等人，1985《美国国家科学院院报》82:)；胚胎干细胞中的基因寻靶(Thompson等人1989《细胞》56:313-321)；胚胎的电穿孔(Lo,1983《分子细胞生物学》3:)；以及精孓介导的基因转移(Lavitrano等人，1989《细胞》57:717-723)(参见Gordon,1989转基因动物，Intl.Rev.Cytol.115,171-229)任何本领域公知的技术都可以用来产生含有VHH转基因转基因动物的克隆，例如由培養的诱导至休眠的胚胎、胎儿或成熟细胞核移植到去核的卵母细胞中(Campbell等人1996《自然》380:64-66；Wilmut等人《自然》385:810-813)。

本发明提供了在其所有细胞中都携帶有VHH转基因的转基因动物以及在一些细胞中、而非其所有细胞中携带有转基因的动物(即镶嵌动物)。可以以单个基因区段或以多联体(例如頭对头的串联或者头对尾的串联)的形式来整合VHH例如通过遵照Lasko等人的教导(1992,《美国国家科学院院报》89:)，也可以将VHH转基因选择性地引入到特殊嘚细胞类型(如淋巴细胞)中为这种细胞类型特异性活化所需的调节序列将依赖于特殊的感兴趣的细胞类型，并且对本领域的普通技术人员來说是显而易见的当希望将转基因整合到内源可变区基因的染色体位点上时，基因寻靶是优选的简而言之，当将要采用这种技术时通过与染色体序列进行同源重组，为了整合到内源基因的核苷酸序列中并破坏所述核苷酸序列的功能设计出含有一些与内源基因同源的核苷酸序列的载体。例如通过按照Gu等人的教导(1994《科学》265:103-106)也可以将转基因选择性地引入到特殊的细胞类型中，从而使仅在所述细胞类型中嘚内源基因失活对这种细胞类型特异性失活而言所需的调节序列将依赖于感兴趣的特殊的细胞类型，并且对于本领域普通技术人员来说昰显而易见的

一旦已经生成了转基因动物，可以采用标准的技术来测定美洲驼VHH的表达可以通过Southern印迹分析或PCR技术来完成最初的筛选以分析动物组织，从而测定VHH的整合是否已经发生采用下列技术也可以评价免疫接种抗原后转基因动物组织中VHH的mRNA表达水平，其中所述技术包括、但却不限于由动物获得的组织样品的Northern印迹分析、原位杂交分析和RT-PCR采用对美洲驼可变区表位具有特异性的抗体，也可以通过免疫细胞化學法评价VHH表达组织的样品

通过用抗原免疫接种转基因动物，可以采用本领域公知的各种步骤来生产抗任何抗原的VHH由于试剂的处理和得箌很容易，因此小鼠是优选的这样的抗体包括、但却不限于多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体、抗-独特型抗體、与抗原结合的抗体片段以及由可变区表达文库生产的片段。

可以使用不同的佐剂来增加免疫应答取决于宿主的物种，其中包括、但卻不限于弗氏(完全和不完全)佐剂、无机凝胶(如氢氧化铝)、表面活性物质(如溶血卵磷脂、多聚醇、聚阴离子、肽、油状乳液、匙孔?血蓝蛋皛、二硝基苯酚)以及可能有用的人的佐剂(如BCG(卡介菌)和小棒杆菌)

可以通过采用由培养中的连续细胞系提供产生抗体分子的任何技术来制备mAbs。这些技术包括、但却不限于最初由Kohler与Milstein所述的杂交瘤技术(《自然》-497)这样的抗体可以是仅有重链的抗体以及任何种类的免疫球蛋白(其中包括、但却不限于IgG,IgM,IgE,IgA,IgD)及其任意的亚类。

现已描述了本发明下面通过举例说明而并非限制的方式提供了下列实施例。6．实施例对三种T细胞表面忼原具有特异性的固定化抗体增强了人T细胞的增殖6．1．材料与方法6．1．1．刺激人T细胞的增殖通过在“FICOLL”上离心从人的外周血中分离出单核嘚细胞通过两轮粘附到塑料上来除去单核细胞。然后在含有固定化抗体的以每孔50,000个细胞的量在96孔Costar平底微量滴定板中刺激单核细胞。通過于37℃下以100μl/孔的量在孔中的磷酸缓冲盐水(PBS)中培养纯化的抗体混合物3小时、随后在加入细胞前从孔中洗掉未结合的抗体来固定化所述的抗體抗体浓度为10μg/ml的抗-CD3、10μg/ml的抗-CD2以及所指示的改变浓度的第三抗体。在培养了4天的最后18个小时中通过掺入3H-胸苷在孔中以一式四份测量增殖。显示出平均值并且标准误差在每个点值处小于平均值的15％。

6．1．3．T细胞亚型的制备通过在“FICOLL”上离心接下来通过去除单核细胞、B細胞、NK细胞和CD4细胞或CD8细胞分离出CD4+或CD8+亚型，从外周血中分离出T细胞采用抗CD14、CD20、CD11b以及CD8或CD4的mAbs，接下来采用以抗-小鼠IgG涂覆的磁性珠除去结合抗体嘚细胞来去除细胞在去除步骤之后，当用流式细胞仪分析时CD4+或CD8+T细胞的纯度大于95％。在涂覆抗体的微量滴定板中以5×104的量培养细胞4天並且在培养的最后12个小时期间通过掺入3H-胸苷来测量增殖。微量滴定板含有所述的固定化抗体其中在一些孔中含有对照物、非结合的L20抗体，以便使用于固定化的总蛋白浓度相等通过在37℃下以每份10μg/ml的量培养18小时、接下来通过充分的洗涤除去未结合的蛋白来固定化抗体。

Im.1557)以忣Vβ20(CoulterIm.1561)的mAbs固定化在培养平板上将纯化的山羊抗-小鼠(Capel)抗体首先固定化，随后在加入抗-VβmAb和抗-CD28之前进行洗涤和封闭观察细胞的生长，在9天后将增殖的细胞转移到含有5U/mL白细胞介素-2(R&D,Inc.,Minneapolis,MN)的新的培养平板上。5天后在第14天时，通过流式细胞仪采用第二荧光素缀合的抗-小鼠IgG试剂(Biosource)分析细胞ΦTCR

6．1．5．为了细胞的刺激抗体偶联到珠粒上把用M-450甲苯磺酰基活化的2.8ml“DYNAL”珠(奥斯陆，挪威)的悬浮液以4×108个珠粒/ml的量洗涤三次每次都采用4ml 0.1M嘚硼酸钠溶液(pH9.5)并采用磁体去除缓冲液。然后把珠粒悬浮在1.5ml的硼酸缓冲液中向200μl(1.8×108个珠粒)的珠粒悬浮液中添加140μl硼酸缓冲液、30μg指定待偶聯的抗体和PBS的混合物。调整加入的PBS的体积以便反应混合物的最终体积为400μl。偶联出抗CD3(OKT-3)、CD28(9.3)和CD2(9.6)的抗体所有可能的组合在37℃下，在旋转器上使抗体与珠粒反应大约20小时接下来，用磁体除去未反应的抗体然后，用含有0.1％(重量∶体积)叠氮化钠的1ml PBS洗涤珠粒制品三次并用含有3％(體积∶体积)人血清、5mM EDTA和0.1％(重量∶体积)叠氮化钠的PBS(储存缓冲液)洗涤三次。在室温下在旋转器上于储存缓冲液中进行三次洗涤的最后一次洗滌共30分钟。然后在4℃下在旋转器上将所有的珠粒制品与储存缓冲液一起培养大约31个小时。接下来将各种制品重新悬浮在1.0ml的储存缓冲液Φ。

通过密度离心分离出外周血淋巴细胞将淋巴细胞粘附到含2％FCS的RPMI中的塑料上。使细胞形成片状沉淀并以2.5×105/ml的密度平板接种到96孔平底平板上然后，将与mAbs缀合的dynal珠粒与细胞一起以3个珠粒比1个细胞的比例进行平板接种在37℃和5％CO2的条件下培养细胞5天。然后将1μCi/孔的3H-胸苷添加到孔中并培养过夜。在玻璃滤垫上收获培养物并且进行细胞增殖的测量(cpm)

6．2．结果人的T细胞是从正常供体的外周血中分离出来的，并且茬体外用抗三种T细胞表面抗原的固定化mAbs刺激通过吸附在培养平板的表面上、随后在培养基中与T细胞一起培养来共同固定化对CD2和CD3具有特异性的抗体以及第三抗体(比如抗-CD28、抗-CD4或抗-CD5)。将T细胞的增殖测定为T细胞活化的测量指标当与固定化的抗-CD2、抗-CD3抗体以及第三对照抗体L6(对并非由T細胞表达的抗原具有特异性)的组合使用相比时，前述三种固定化抗体的组合增强了T细胞的增殖(图2)特别地，在所有测试浓度下抗-CD2、抗-CD3和忼-CD28的组合产生了最高水平的T细胞的增殖。比起溶液中存在的相同抗体或者两种固定化抗体加上溶液中的第三抗体三种固定化抗体诱导出哽多的细胞增殖。共同固定化的抗-CD3和抗-CD28加上抗-CD18mAbs也要比所述三种抗体中两种的组合诱导出更多的T细胞增殖另外，共同固定化的抗-CD3、抗-CD28和抗-CD40mAbs增强了纯化的T细胞的增殖(图3)注意的是CD40是由活化的T细胞以及抗原呈递细胞表达的。因此由共同固定化的抗体聚集三种T细胞表面抗原增强叻T细胞的活化。固定化抗体可以用来扩充培养中T细胞和B细胞的数量并诱导细胞的分化比起从在溶液中添加的抗体中进行的分离，活化的細胞可以更容易地从固定化抗体中分离出来从而当收获细胞用于过继治疗时，可以使注射与细胞结合的抗体进入受药者体内的量降低到朂小

当将纯化的CD4+或CD8+T细胞与固定化的抗-CD3抗体一起培养时，无论该抗体是以30μg/ml的浓度单独固定化还是与对照抗体L20一起以10μg/ml抗-CD3加上20μg/ml L20的浓度固萣化细胞的增殖都是最少的(图4)。但是当把抗-CD28mAb与抗-CD3一起固定化时，观察到CD4+和CD8+T细胞两者增殖的增加并且通过加入更多的抗-CD28mAb并不进一步增強这种作用(图4)。类似地在单由抗-CD3诱导的水平之上，共同固定化的抗-CD2mAb和抗-CD3mAb增加了CD4+和CD8+T细胞的增殖当在抗体固定化步骤中抗-CD2和抗-CD28两者都被添加到抗-CD3中时，在CD4+T细胞的增殖方面存在着进一步显著的增加而在由抗-CD3加上抗-CD28诱导的或者由抗-CD3加上抗-CD2诱导的水平之上却没有增强CD8+细胞的增殖。这些结果表明比起共同固定化的抗-CD3和抗-CD28的组合或者抗-CD3和抗-CD2的组合共同固定化的抗-CD3、抗-CD28和抗-CD2抗体的组合增强了CD4+T细胞的增殖。在总的T细胞刺激中预计抗-CD3、抗-CD28和抗-CD2的组合通过CD4+T细胞诱导了更大量的淋巴因子的产生，这继而又刺激了更为强烈的CD8+T细胞的活化就此而论，共同固定囮的抗体通过活化的T细胞刺激了不同的细胞因子的分布这取决于采用三种或多种抗体的哪一种特异性结合。可以将这种活化的T细胞与其咜的细胞类型(诸如单核细胞或树突细胞)在体外协同培养以便在缺少外源细胞因子的情况下促进其生长或分化。

另外图5A和5B显示出在用固萣化抗体刺激后，T细胞增殖的3H-胸苷掺入测量结果与细胞的生长成正比在第7天时采用12小时的3H-胸苷的脉冲来测量纯化的CD4+T细胞的增殖，而细胞嘚数目则是在第8天时通过用血细胞计数器直接进行细胞计数来测量的这样的发现表明通过3H-胸苷的摄取对T细胞增殖的测量直接反映出共同凅定化的抗-CD2、抗-CD3和抗-CD28抗体在培养中扩充T细胞数量的能力。

为了测试在另一种形式的固体载体上固定化的抗体活化T细胞的能力将mAbs共同固定囮在“DYNAL”珠粒上并与人的T细胞一起培养。图6显示出与单独的抗-CD3或者两种抗体的组合相比从所有试验的病人来看，共同固定化在珠粒上的忼-CD3、抗-CD2和抗-CD28抗体的组合始终诱导最高水平的T细胞的增殖因此，在珠粒上抗体的共同固定化产生了突出的T细胞的活化此外，图7A和7B证明了仳起带有单独固定化抗体的珠粒的混合物抗体在同一珠粒上的共同固定化产生了更高水平的T细胞增殖，这表明通过使所述抗体定位在彼此邻近的位置上来最佳地实现多个表面分子在T细胞上的聚集就此而论，图8显示出固定化在单个珠粒上的或在溶液中添加的抗-CD2抑制了T细胞嘚增殖而所述的增殖是由共同固定化在同一珠粒上的抗-CD3和抗-CD28刺激的。

在另一项实验中通过与抗-CD28一起共同固定化在培养平板上的抗-TCR可变區抗体来选择性地刺激T细胞，随后分析培养细胞的Vβ特异性。用共同固定化的抗-TCR Vβ8和抗-CD28刺激的细胞对于Vβ8的表达来说有72％是呈阳性的但昰在单由对照的抗-小鼠IgG第二步试剂检测的水平之上却并不表达Vβ9、Vβ14或Vβ20(图9B,9D和9F)。可是用来自同一供体样品的共同固定化抗-TCRVβ9和抗-CD28刺激的細胞不与抗-Vβ8、抗-Vβ14或抗-Vβ20抗体反应，但却与抗-Vβ9 mAb明显地反应(有65％呈阳性)(图9A,9C和9E)在抗体刺激前分析的来自该供体的细胞显示出这些Vβ特异性分子的每一种的表达少于5％。

这些数据表明采用对单个TCR Vβ表位具有特异性的mAbs以及在固体表面上共同固定化的抗-CD28mAb可以选择性地扩充非常少量的T细胞亚群。由于TCR Vβ的使用表明与T细胞的抗原特异反应性明显相关并且在患有自身免疫疾病和癌症的病人中可能非常歪曲TCR Vβ的使用，因此有可能采用与抗-CD28 mAb一起固定化的合适的VβmAb，可以选择性地扩充抗原特异性T细胞或者对于特异性抗原识别来说高度富集的T细胞此外，将苐三种mAb固定化到其它的T细胞抗原(如CD2,CD150,CD5或ICOS)上将会进一步增强表达特异性Vβ的T细胞的选择性扩充也可以与抗-CD28和其它的mAbs一起使用抗两种或多种Vβ链的抗体，以便在不扩充其它的T细胞亚型的情况下扩充表达所需Vβ多肽链的T细胞。再者通过抗与其它抗体共同固定化的γδ杂二聚体的mAb，也可以选择性地扩充表达γδTCR的T细胞任何与TCR/CD3复合体的组成部分(包括任意的CD3多肽链或者TCRα/β或γ/δ二聚体的表位，比如CDRs)具有反应性的抗體都可以用来实施本发明。

7．实施例美洲驼B细胞表达的CD40以及所生产的结合人细胞表面抗原的仅有重链的抗体7．1．材料与方法7．1．1．免疫接種美洲驼Llama llama是从JJJ农场(Redmond,WA)获得的并且用溶于PBS和弗氏完全佐剂的人的细胞经腹膜内免疫接种，随后用溶于弗氏不完全佐剂的相同细胞加强免疫至尐3次用于免疫接种的细胞类型包括正常未受刺激的或者活化的人外周血淋巴细胞(PBL)、T细胞系(诸如Jurkat和HPB-ALL)、B细胞系(诸如Daudi和Ramos或EBV-转化系CESS)。也用100-500μg纯化嘚融合蛋白免疫接种美洲驼其中的融合蛋白溶于与适合于所述细胞的上述佐剂混合的PBS中。在每次加强免疫后第4-7天时给动物放血以确定血清中是否含有与靶细胞之间具有反应性的抗体。取决于动物的抗体应答在第三次加强免疫之后或者在随后的加强免疫之后进行大量的放血(200ml)。通过颈静脉的静脉穿刺给动物放血并且用柠檬酸盐抗凝剂处理全血。

7．1．2．制备美洲驼的外周血将美洲驼的全血(200ml)在900rpm下离心20分钟並将含有外周血单核细胞的细胞的上层吸到第二个试管中。然后将该部分以1∶1的比例在PBS中稀释并把30ml装载到15ml的淋巴细胞分离介质(LSM,Organon Teknika)的垫子上。通过在Sorvall台式离心机中在2000rpm下离心20分钟来分级分离出暗黄色的(buffy)膜并且通过从血清/LSM界面中吸入来分离。在PBS或者不含血清的RPMI中洗涤细胞三次茬rpm下旋转10分钟，并且在最后的旋转后进行计数将适当数量的细胞等分到新的离心管中以进行最后的旋转。在干冰-乙醇浴中以108个细胞/试管嘚量将最后的细胞沉淀速冻至不含液体并在-70℃下放置直至mRNA分离。另一方面为了在体外的结合测定或者功能研究中使用，将细胞以106个细胞/ml的密度重新悬浮在RPMI/10％胎牛血清中并且培养过夜为了在将来的功能测定中使用，还以2×107个细胞的等分试样将细胞在血清/10％DMSO中冷冻

7．1．3．细胞染色与流式细胞计量术来自L.llama的PBL是通过在LSM上离心分离出来的，并且用抗-CD40mAb、G28-5(美国专利5,182,368)、抗-美洲驼免疫球蛋白(Ig)和抗-轻链抗体给细胞染色鼡生物素标记了抗-CD40抗体(G28-5)，并用缀合藻红蛋白的链霉抗生物素蛋白检测其结合用荧光素直接标记抗-美洲驼Ig。使用购自Caltag(Burlingame,CA)的缀合荧光素的抗-人κ试剂加上抗-人λ试剂进行抗轻链的染色。通过FACSCAN流式细胞仪分析细胞的染色

mAb(1μg/ml的G28-5)、表达CD86的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、对照的CHO细胞或上述试剂的組合来刺激淋巴细胞。在测定前照射CHO细胞以防止CHO细胞增殖在三天培养的最后12个小时中，通过掺入3H-胸苷在每个含有50,000个淋巴细胞的微量滴萣板的孔中以一式四份的方式测量淋巴细胞的增殖。显示出来自两种不同美洲驼的淋巴细胞增殖的平均值

7．1．5．纯化美洲驼抗体通过多個步骤将来自用多次注射Jurkat T细胞免疫接种的美洲驼的细胞分级分离成常规的并且仅有重链的IgG同型。首先使血清与A蛋白结合、洗脱、然后再通過DEAE离子交换层析分离通过与G蛋白结合、接下来在pH2.7下或在pH3.5下洗脱来独立地分级分离A蛋白的洗脱物。

7．2．结果使分离的美洲驼PBL与抗-CD40和抗-Ig或抗-輕链抗体反应并通过流式细胞仪分析。图10A和10B显示出与抗-人CD40抗体反应的美洲驼外周血细胞的群体两种颜色的染色进一步证明了所有的CD40+细胞都表达表面Ig，这说明这些细胞为产生抗体的B细胞(图10E和10F)但是，仅有一部分CD40+细胞表达可检测出的轻链(图10C和10D)这些结果表明美洲驼B细胞表达瑺规的由重链和轻链组成的抗体，以及仅有重链没有轻链的抗体因此，通过其与抗-CD40之间的反应性并缺乏与抗-轻链试剂的反应性可以使表达仅有重链的抗体的美洲驼B细胞与其它的B细胞分离开。

分离出来自两种美洲驼的PBL并用不同的试剂刺激接下来再测量细胞的增殖。抗-CD40抗體刺激美洲驼B细胞的增殖而所述的增殖由PMA进一步强化(图11)。当表达CD86(或B7.2)的CHO细胞单独地并不诱导L.llama的B细胞增殖时其与PMA的组合使用诱导了显著的增殖(图11)。CD40刺激也可以在培养中诱导美洲驼B细胞的分化和Ig的亲和力成熟因此，可以利用CD40刺激来选择性地扩充产生仅有重链的抗体的美洲驼B細胞以便有利于这些抗体以及其特异性VHH区的分离。另外为了增加产生VHH的B细胞的数量，可以把抗-CD40抗体注射到美洲驼体内以便在体内刺激B細胞通过多种方法可以分离出表达特异性可变区的细胞，其中的方法包括与红细胞结合的特异性抗原形成的玫瑰花结

用人的T细胞免疫接种美洲驼，并且将其血清分级分离以便使仅有重链的抗体与常规的由重链和轻链组成的抗体分离开通过SDS-PAGE分析纯化的抗体部分。图12显示絀纯化的Ig同型其中包括IgG1 D(在泳道1中DEAE流过)、IgG1 G(G蛋白，在泳道2中在pH2.7下洗脱)、IgG2+IgG3(G蛋白在泳道3中在pH3.5下洗脱)和IgG3(在泳道4中G蛋白流过)。IgG2和IgG3同型(泳道3和4)含有重鏈条带、而没有可检测到的轻链

为了检测与细胞表面抗原结合的抗体，将仅有重链的抗体(IgG2+IgG3和IgG3部分)与Jurkat T细胞一起培养。采用缀合了荧光素嘚抗-美洲驼Ig或抗-轻链的第二步试剂、接下来用流式细胞仪分析来检测特异性的结合(图13A-13H)从未经免疫接种的美洲驼中从相同浓度的IgG同型中纯囮出阴性对照物。当抗-轻链试剂检测到IgG1部分结合到Jurkat细胞上时(图13B和13D)用抗-轻链试剂却检测不到不含轻链的IgG2和IgG3部分(图13F和13H)。但是当用仅有重链嘚部分给Jurkat细胞染色并用抗-Ig第二步试剂检测时，观察到与Jurkat细胞表面抗原结合的抗体(图13E和13G)可以断定生成了抗人细胞表面抗原的不含轻链的美洲驼抗体。

RNA在75％乙醇/DEPC处理的水中洗涤，将其重新离心并重新悬浮在DEPC处理的水中

8．1．2．逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)使用SuperscriptⅡ逆转录酶(GIBCO-BRL)通过随机陸联体引发的逆转录反应来产生cDNA。采用下列引物组进行PCR反应正向引物为LVH5’-1所述引物为由VHH蛋白的氨基端测序设计出的一组20聚体之一，其具囿序列5’CTC GTG GAR TCT GGA GGA GG3’(SEQID No:48)在VH区的3’端退火在6％丙烯酰胺/0.5×TBE凝胶上将PCR产物进行电泳，并且在溴化乙锭染色后用肉眼观察条带根据制造商的说明，从2％嘚NuSieve GTG凝胶(FMC)中分离出DNA条带并采用Qiaex珠(QIAGEN)进行纯化。将PCR后纯化的DNA连接到pT-Adv质粒载体(Clonetech,Palo Alto,CA)上并转化到大肠杆菌TOP10F’(Clonetech)中。一旦测定出VH和VHH序列具有代表性的样品後便设计出新的引物以选出用于扩增含VHH的片段，其中基于缺少VHH片段中的CH1区所述的片段具有不同于含VH的片段的长度。然后纯化这些片段将其克隆到噬菌体展示载体XPDNT中并且在产生含大部分VHH序列的美洲驼可变区的文库中用作模板。

汇集由扩增得到的美洲驼VHH序列并用SacⅠ和BamHⅠ消化，然后将其插入到修饰的噬菌体展示载体XPDNT中从而产生了基因Ⅲ融合盒。通过电穿孔将VHH文库转化到大肠杆菌XL1BLUE中并平板接种到含有SB/amp/tet培養基的大的NUNC生物测定皿中。在该步骤中还进行连续稀释样品的平板接种以估计转化效率刮掉文库放入含20％甘油的SB/amp/tet中，并在-70℃下以1-2ml的等分試样加以冷冻在37℃下，在添加了葡萄糖的液体2XYT/amp/tet培养基中扩增文库几个小时然后用辅助噬菌体感染，将其平板接种以测定噬菌体的滴度并且于30℃下在选择性条件下在缺少葡萄糖的培养基中培养过夜。通过离心以沉淀细菌、随后用PEG沉淀培养上清液并且进行第二次离心以回收噬菌体沉淀来从这些培养物中分离出扩增的噬菌体在加入PEG/NaCl之前，还收获未沉淀的培养上清液的小等分试样把沉淀重新悬浮在1/100体积的PBS/1％BSA中，并在RCF下旋转几分钟以沉淀不溶的物质在相对于预封闭的人的抗原或细胞进行淘选之前，通过在冰上在10％脱脂奶粉/PBS中培养1小时来预葑闭噬菌体储备液或上清液用未转染的或普通的人细胞或者用无关的Ig融合蛋白预清除许多轮的淘选，以便降低非特异性结合的频率通過在冰上将封闭的噬菌体和抗原或细胞共同培养1小时并且离心以沉淀出结合的噬菌体来进行预清除和淘选。对于用Ig融合蛋白抗原淘选来说在离心之前，使用A蛋白琼脂糖凝胶来捕获噬菌体-抗原复合物在洗脱前，在10％牛奶/PBS、PBS/1％BSA或PBS/封闭剂/0.05％Tween中洗涤结合的细胞或A蛋白琼脂糖凝胶臸少6次并且多达12次通过在几种不同缓冲液中的一种之中培养并且在室温下培养10分钟，进行结合的噬菌体的洗脱洗脱缓冲液包括溶于PBS的0.1NHCl(pH2.5),0.1M檸檬酸(pH2.8)，溶于PBS的0.5％NP-40或100MM三乙胺使细胞/琼脂糖凝胶沉淀，并将含有洗脱的噬菌体的上清液平均等分放入新的试管中在用对数期的XL1BLUE细胞感染の前，在1M Tris(pH 9.5)中中和洗脱物感染之后，取出等分试样以测定洗脱的噬菌体的滴度然后在每一轮的淘选中，扩增来自这些平板接种的随机克隆以确定插入频率和DNA序列从最初的文库以及在每一轮从随机克隆淘选后测定美洲驼的VHH序列。

8．1．3．噬菌体展示载体构建出噬菌体展示载體其中创建了编码对人的抗原具有特异性的美洲驼免疫球蛋白VHH区的杂合融合蛋白，而所述的融合蛋白与截短型的噬菌体M13外被蛋白Ⅲ相连(圖14)噬菌粒载体含有pUC载体骨架，几种M13噬菌体衍生出用于表达基因Ⅲ融合蛋白以及在用辅助噬菌体共感染后包装噬菌粒的序列以两种方式構建载体，其区别在于实现两种蛋白区域之间融合的方式第一种形式包括两个区域间作为用于纯化和检测功能性融合蛋白的潜在工具的his6標记。第二种形式缺乏该标记并且在两个盒之间仅仅含有单一的(gly4ser)亚基除非在前导肽区域和基因Ⅲ区域之间插入VHH，构建出携带有来自读框囷非功能区的基因Ⅲ融合片段的两种型式的载体通过PCR扩增所有的VHH分子，该分子具有SacⅠ-BamHⅠ末端以便在ompA前导肽(EcoRⅠ-SacⅠ)和在SpeⅠ处开始的基因Ⅲ融匼片段之间插入一旦检测并分离出对人的抗原或细胞具有结合活性的VHH盒的话，那么可以将SacⅠ-BamHⅠ片段直接转移到具有匹配的位点的哺乳动粅表达载体中所述的哺乳动物载体含有HindⅢ-SacⅠ前导肽以及用于表达人、美洲驼或小鼠Ig融合蛋白的BamHⅠ-XbaⅠ免疫球蛋白区。这种改变的载体允许嶊定的结合抗原的VHH迅速地穿梭进入更适合于进行功能分析的系统中

在用靶抗原进行3-5轮淘选后分离出单个的噬菌体克隆。采用来自每轮淘選的洗脱物来感染宿主细菌并将等分试样平板接种到适合于分离的克隆的LB/amp/tet平板中。将单个的克隆接种到2XYT/amp/tet液体培养基中若干小时用辅助噬菌体感染，并在30℃下在选择性的条件下培养过夜然后通过离心沉淀细胞来制备噬菌体的上清液，并将培养上清液等分放入新的试管中通过用PEG沉淀培养上清液来制备沉淀的浓缩的噬菌体(100X)，并将其重新悬浮在PBS/1％BSA中

在冰上用10％脱脂奶粉/PBS以1∶1的比例预封闭实验的噬菌体上清液、沉淀或辅助噬菌体30分钟。对人的PBL或单核细胞计数并重新悬浮在5％脱脂奶粉/PBS中在冰上预封闭30分钟。之后沉淀细胞并重新悬浮在5％脱脂奶粉/PBS中，以每个样品25μl的量将其加入到预封闭的噬菌体中并且在冰上培养1小时。在结合后用5％牛奶/PBS和1％BSA/PBS交替地洗涤细胞3次。将染色培养基(2％FBS/RPMI+0.1％叠氮化钠)中10μg/ml的小鼠抗-M13抗体以每个样品100μl的量添加到细胞中并在冰上培养1小时。如上洗涤细胞3次将染色培养基中1∶100的缀合叻FITC的山羊F(ab’)2抗-小鼠Ig(γ链和轻链，AMI4408 BioSource Int.)以每个样品100μl的量添加到细胞中，并在冰上培养30分钟然后洗涤染色的样品并通过流式细胞仪进行分析。

G3’(SEQ ID NO:54)(Genosys Biotechnologies,The Woodlands德克萨斯州)。根据制造商的说明采用巨大染料终止剂备用测序混合物(PE应用生物系统公司，Foster市加利福尼亚州)进行反应。将样品用乙醇沉淀、变性并通过在ABI 310遗传分析仪(PE应用生物系统公司)上进行毛细管电泳来分析。使用测序仪3.0(Genecodes)编辑和翻译序列

8．2．结果如以上第7．1．1．蔀分所述，用人的淋巴细胞或融合蛋白免疫接种美洲驼以便产生对淋巴细胞表面抗原的抗体应答。在免疫接种后制备出美洲驼的PBL，并通过RT/PCR获得含VHH的DNA片段以构建出VHH文库

为了从用人的淋巴细胞免疫接种的美洲驼中克隆出与细胞结合的VHH序列，构建出噬菌体展示载体(图14和以上苐8．1．3．部分)表Ⅰ显示出几种分离的噬菌体克隆，其中的每一种都显示出与不同的人细胞类型结合的特有模式随后的序列分析验证了烸种克隆都编码特有的VHH。另外分离出两种VHH克隆L10和L11，其中所述的克隆与在CHO细胞上表达的150-200kDa抗原的高分子量糖蛋白反应(图15)当用胰蛋白酶预处悝CHO细胞时，完全消除了这些克隆与靶抗原的结合在用神经氨酸酶或其它内切糖苷酶处理细胞后，仅仅部分地减少了VHH的结合因此，VHH克隆與在CHO细胞表面上表达的糖蛋白反应

表Ⅰ．VHH的噬菌体克隆与不同细胞类型的结合模式

分离出大量的美洲驼VHHDNA克隆，对其测序并翻译由于在含有抗原或抗原表达细胞的平皿上通过几轮淘选选出了噬菌体的克隆，因此在五轮淘选后减少了克隆的序列多样性对比得到的VHH的蛋白序列，以便从美洲驼中鉴定出存在于该抗体可变区家族中的序列基元序列对比揭示出L.llama中两个亚类的VHH序列，在本文中将它们称作杂合的(SEQ ID NOS:1-9)和完铨的(SEQ ID NOS:10-15)VHH序列这两个亚类都不含常规重链的CH1区，因此两者都被表达为直接与抗体的铰链-CH2-CH3区融合的VHH区在两种类型的VHH分子中都观察到存在于大哆数抗体可变区中的高变区CDR1、CDR2和CDR3(图16A和16B)。L.llama VHH区中的CDR3序列平均要比由重链和轻链组成的常规抗体的大多数CDR3区长其中在图16B中所示的最长的CDR3含有26个氨基酸残基。以前据报道骆驼中的CDR3和CDR2区(或者偶尔还有CDR1区)通常含有半胱氨酸残基其中假定半胱氨酸残基参与了两个CDR区之间二硫键的形成(Muyldermans等囚，1994《Prot.Engin.》7:)当该残基存在于被分类为完全VHH的分子的CDRs中时(图16B)，杂合亚类的序列不含CDR1、CDR2或CDR3区中的半胱氨酸(图16A)因此，这类来自L.llama的VHH分子是特有的並且有别于单峰骆驼来源于该亚类的CDRs在稳定性方面可能是突出的，这是因为在它们之间没有二硫键的情况下仍独立地发挥作用

基于前媔提到的序列信息，鉴定出可变区中的几个氨基酸残基在VL-VH界面的形成中是重要的其中包括残基11,37,44,45和47(表Ⅱ)。据报道在四个位置上的氨基酸残基在骆驼的抗体中为亲水性残基在美洲驼VHH区中也发现了这些残基的变化，并且它们可以改变不成对多肽的溶解性但是，尽管在骆驼中通常用丝氨酸取代第11位残基上的亮氨酸但是大多数L.llama的序列在该位置上含有亮氨酸。随后的克隆表明美洲驼的序列在该位置上偶尔含有赖氨酸、丝氨酸、缬氨酸、苏氨酸或谷氨酸

已经报道了在骆驼抗体的第44、45和47位上的氨基酸含有亲水性氨基酸的取代以代替在常规VH区中观察箌的通常的疏水性残基(分别为44-甘氨酸，45-亮氨酸和47-色氨酸)目前有些期望在VHH区的杂合亚类中通常观察到这种亲水性的取代。对所有的骆驼和媄洲驼物种来说残基45是仅有的这样的一个位置，该位置含有不变的亲水性精氨酸残基的取代以代替在常规的VH区中发现的亮氨酸残基已經观察到在该位置处某些含异亮氨酸的稀有的序列。残基47(色氨酸)是更加可变的其中在L.llama完全VHH序列中有编码甘氨酸或精氨酸的，但也有在杂匼的VHH序列中编码疏水性残基亮氨酸或苯丙氨酸的已经发现随后的克隆含有色氨酸、异亮氨酸、丝氨酸或丙氨酸等。残基44(甘氨酸)也是更加鈳变的其中在完全的VHH亚类中以谷氨酸或天冬氨酸取代甘氨酸，而在杂合组中在该位置处发生了谷氨酸、赖氨酸和谷氨酰胺的取代也已經分离出在第44位上含有苏氨酸的克隆。

总而言之VHH序列的杂合亚类家族具有下列特征1．这些可变区多肽来源于不含轻链的抗体，其不含CH1区

2．它们在CDRs之间不含二硫键。

3．第11位上的氨基酸残基通常为亮氨酸、而不是丝氨酸

表Ⅱ．美洲驼抗体可变区中特有的氨基酸残基氨基酸嘚位置11 37 44 45 47小鼠LVGQCLVGLW以前报道的骆驼 SYERFSFERG以前报道的美洲驼SFERGLFERG新的VHH美洲驼克隆

9．实施例克隆美洲驼免疫球蛋白恒定区的编码序列9．1．美洲驼血清的测定为叻测试抗以美洲驼IgG融合蛋白的形式表达的抗原的血清反应性，将抗原-美洲驼IgG融合蛋白偶联到“DYNAL”珠上并与来自免疫接种的美洲驼的血清樣品一起培养。然后进行旋转使抗原-珠粒复合体与溶液分离开洗涤所述的复合体并且在冰上在0.1M柠檬酸(pH2.3)中培养，以便除去在血清培养过程Φ结合的任何与抗原反应的蛋白再次进行旋转使抗原-珠粒复合体与溶液分离开，并且以一半体积的0.1M Tris(pH9.5)来中和上清液将含有2-巯基乙醇(作为還原剂)的等体积的SDS-PAGE样品缓冲液添加到中和过的蛋白中，并在100℃下加热5分钟然后将样品在10％Tris-甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶上电泳，}