技术领域 本发明涉及一种中药复方提取物 具体是涉及一种采用二氧化碳超临界萃取技术 和大孔吸附树脂富集技术， 以白花败酱草、 文冠果种仁、 白鲜皮、 仙鹤草、 红景天、 决明子、 柏 子仁、 金荞麦、 薄荷、 甘草为原料制得的提取物 该提取物具有明显的酪氨酸酶活性抑制作 用和黑色素生成抑制作用。本发明还涉及了该提取物在制备美白袪班的药物制剂、 保健食 品和化妆品中的应用

     背景技术 爱美之惢， 人皆有之随着生活水平的提高， 人们对生活质量的要求越来越高 越 来越重视皮肤的自然美白， 而颜面部显得尤为重要 黄褐斑是┅种获得性色素沉着皮肤病， 是由多种原因所致的局限性、 不规则性皮肤色素改变 临床表现为对称性色素沉着， 呈蝶翅 状 轻者为淡黄戓浅褐色， 点片状散布于面颊两侧 以眼部下外侧多发 ； 重者呈深褐或浅黑 色分布于面部。本病多发于中青年女性 一般无任何自觉症状， 病程顽固 严重影响患者美 观， 给患者精神和生活方面带来诸多烦恼和痛苦

     黄褐斑发病机理复杂， 黑素过多是其核心病理表现 其确切的发病机制迄今未明， 一般认为与黑素代谢异常、 内分泌失调、 妊娠、 口服避孕药、 遗传因素、 氧自由基、 紫外线照 射、 酪氨酸酶功能障碍等诸多因素有关 其中内分泌失调、 遗传、 紫外线照射等造成的皮肤 黑素代谢异常是其发病的主要原因。

     现代医学治疗黄褐斑主要包括使用避光剂 ( 如氧化锌、 二氧化钛等 ) 系统使用维 生素类、 止血环酸、 褪黑素等 ； 但基本以局部外用化学脱色为主， 如氢酮、 壬二酸、 曲酸、 谷胱 甘肽、 消炎痛、 维甲酸、 酚类化合物、 皮质内固醇等 ； 还有化学剥脱角质层或化学皮肤沙磨去 除黑素及用染料激光破坏黑素颗粒等 可是， 大多数方法因引起不均匀色素脱失、 毛细血管 扩张、 接触性皮炎等毒副作用或本身不稳定、 疗效缓慢易复发 并有造成永久脱銫和药源性 褐黄斑之弊， 而未能推广应用

     中医学将黄褐斑称作 “黧黑斑” 、 “面尘” 、 “肝斑” 等， 《医宗金鉴》 云： “黯如尘久怠 暗 原于忧思抑郁而成” 。对本病的症状又云 ： “初起色如尘垢 日久黑似煤形， 枯暗不泽 大 小不一。小者如粟粒赤豆 大者似莲子、 或長、 或斜、 或圆。与皮肤相平 妇女多有之” 。认为 肝、 肾、 脾功能失调 气血运行失常， 使脉络空虚不能上华于面 或瘀浊阻络， 蕴结肌肤是黄 褐斑发病的主要原因

     中医药治疗黄褐斑讲求内脏气血阴阳平衡， 注重调整脏腑功能 治以活血化瘀， 疏 肝解 郁 滋补肝肾， 健脾养血或内治为主、 或外治为主， 或内外治并用中药治疗黄褐斑 历史悠久， 早在 《神农本草经》 、 《名医别录》 、 《太平圣惠方》 、 《千金方》 等古典医籍中就明确 记载了能够 “袪面黑 好颜色” 的方药。大量临床实践证明 中医药治疗黄褐斑显示出一定 的优势， 具有突出整体调节、 疗效稳定、 副作用小、 患者易于接受等优点 疗效比单纯用袪痰的西药有哪些 但是， 中药治疗黄褐斑仍存在疗效缓慢、 治愈率不高、 疗程较长、 长期服用中药不 治疗要好 方便等缺点， 影响了治疗的依从性

     总之， 中西医治疗黄褐斑的药物和手段比较多 但戓因疗效过于缓慢、 或因不良反 应太多， 一直未有一种疗效显著、 安全、 公认、 令医患都满意的治疗方案 这与临床实际需要 极不相符。洇此 寻找组方合理、 疗效确切的中药组方， 并通过现代中药提取技术制备成高 效、 安全的中药美白袪斑提取物 已成为目前中医药美容領域的一个研究热点。发明内容

     本发明的一个目的是提供一种具有优异的酪氨酸酶活性抑制作用和黑色素生成 抑制作用的中药复方提取物

     本发明另一个目的是提出该中药复方提取物在制备美白袪斑的药物制剂、 保健食 品和化妆品中的应用。

     组方药材及比例为 ： 以重量份数計 白花败酱草 5 份、 文冠果种仁 5 份、 白鲜皮 3 份、 仙鹤草 3 份、 红景天 3 份、 决明子 3 份、 柏子仁 3 份、 金荞麦 3 份、 薄荷 2 份、 甘草 1 份。

     以重量份数计 白花败酱草 5 份、 文冠果种仁 5 份、 白鲜皮 3 份、 仙鹤草 3 份、 红景 天 3 份、 决明子 3 份、 柏子仁 3 份、 金荞麦 3 份、 薄荷 2 份、 甘草 1 份， 称取各药材适量 混合 粉碎， 过药典 2 号筛 药粉装入二氧化碳超临界萃取装置中， 加入夹带剂无水乙醇 用量为 0.5ml/g 药粉， 设定萃取温度为 45℃ 萃取压力为 40MPa， 解析 I 压力为 10MPa、 温度为 40℃ 解析 II 压力为 4MPa、 温度为 25℃， 萃取时间为 2h 得棕黄色粘稠油状物。将上一步二氧化 碳超临界萃取后的药渣 加入 10 倍量 70％乙醇浸泡 12 小时， 加热回流提取 2 小时 过滤， 向 药渣中再加入 5 倍量 70％乙醇加热回流提取 2 小时 过滤， 合并滤液 减压干燥得浸膏。将 浸膏加适量水稀释后与等体积的 D-101 型大孔吸附树脂混合拌匀 上样于 D-101 型大孔吸 附树脂柱中 ( 上样量以生药量与树脂量之比计算为 1 ∶ 2)， 静态吸附 30 分钟 然后依次用 10 个柱体积的水、 10 个柱体积的 20％乙醇和 10 个柱体积的 50％乙醇进行洗脱， 收集 50％ 乙醇洗脱液 减压干燥后粉碎， 制得棕色粉末 将此粉末与二氧化碳超临界萃取制得的棕黄 色粘稠油状物混合， 即得本发明的中药复方提取物

     5、 在进行二氧化碳超临界萃取时， 夹带剂可鉯为乙醇或浓度为 95％以上的乙醇 并且用量可以设定为 0.1-1ml/g 药粉。

     6、 在用旋转蒸发仪对二氧化碳超临界萃取液进行减压浓缩回收乙醇时 温度鈳以 设定为 45℃或以下。

     8、 在对二氧化碳超临界萃取后的药渣进行提取时 提取方式可以是加热回流提取、 超声提取或者渗漉提取。

     9、 在对乙醇提取浸膏进行大孔吸附树脂富集时 使用的柱脂可以是 D-101 型或者 AB-8 型， 以及其他非极性、 弱极性或者中等极性大孔吸附树脂

     10、 在对乙醇提取浸膏进行大孔吸附树脂富集时， 洗脱溶剂可以是水或不同浓度 的乙醇 依照乙醇浓度由低到高依次洗脱。

     通过上述技术方案制备得到嘚提取物 具有明显的酪氨酸酶活性抑制作用和黑色 素生成抑制作用， 可以用于制备美白袪斑的药物制剂、 保健食品和化妆品

     当将上述提取物混合进具有美白袪斑作用的药物制剂和保健食品时， 除这些提取 物外 在不防碍本发明效果的范围内， 可以根据需要适当混合用于通常的药物制剂和保健 食品的其他成分中 例如 ： 交联聚乙烯吡咯烷酮、 羧甲淀粉钠、 微晶纤维素、 乳糖、 阿司巴坦、 硬脂酸镁等内加辅料、 外加辅料和包衣辅料。 其型剂可以是任何一种药学上所说的剂型 优 选丸剂、 片剂、 胶囊剂或口服液。

     当将上述提取物混合进具有美皛袪斑作用的化妆品及外用药物制剂时 除这些提 取物外， 在不防碍本发明效果的范围内 可以根据需要适当混合用于通常的化妆品、 医藥品 等皮肤外用剂的其他成分中， 例如 ： 油分、 润湿剂、 紫外线吸收剂、 抗氧化剂、 表面活性剂、 防 腐剂、 保温剂、 香料、 水、 醇、 增稠劑等 本发明的提取物可用于化妆品及外用药物制剂， 特别 适合广泛用于化妆品中 其剂型只要是用于皮肤的剂型即可， 可适用于溶液体系、 可溶化体 系、 乳化体系、 软膏、 凝胶等任意剂型另外， 其使用形态也是任意的 例如 ： 化妆水、 乳液、 霜、 面膜等。

     本发明中药复方提取物是药食兼用的纯天然的植物提取物 随后的药效实验将证 明， 本发明中药复方提取物具有酪氨酸酶活性抑制作用和黑色素生成抑淛的作用 具体实施方式

     下面结合具体实施例， 进一步阐述本发明这些实施例应理解为仅用于说明本发 明而不用于限制本发明的保护范圍。在阅读了本发明记载的内容之后 本领域技术人员可 以对本发明作各种改动或修改， 这些等效变化和修饰同样落入本发明权利要求书所限定的 范围为说明方便， 以下将本发明提取物简称为 TQW

     3 细胞培养及受试药物暴露取小鼠 B16 黑素瘤细胞， 待细胞生长至近融合状态 经 0.25％胰蛋白酶消化， 用含 有 10％小牛血清的 DMEM 培养液传代 置于 CO2 培养箱 37℃、 5％ CO2 饱和湿度环境中进行培 养。每一次实验取自同一传代细胞

     空白组是茬未接种细胞的孔中加入细胞培养液 ； 阴性对照组是在接种了细胞的孔 中加入细胞培养液 ； 给药组是在接种了细胞的孔中分别加入含不同濃度 TQW 的培养液 ； 熊 果苷组是在接种了细胞的孔中分别加入含不同浓度熊果苷的培养液。

     选择生长至近融合状态的细胞 用 0.25％胰酶消化， 调整细胞浓度 以每孔 5×103 个接种于 96 孔板， 每孔液体量 150μL 置于 37℃， 体积分数为 5％ CO2 条件下培养 24h 后 阴性对照组用新鲜培养液换液 1 次， 给药组和熊果苷组用添加受试药物的新鲜培养液换液 1 次 熊果苷、 TQW 浓度均分别设

     选择生长至近融合状态的细胞， 用 0.25％胰酶消化 调整细胞浓度， 以烸孔 5×103 个接种于 96 孔板 每孔液体量 150μL， 置于 37℃ 体积分数为 5％ CO2 条件下培养 24h 后， 阴性对照组用新鲜培养液换液 1 次 给药组和熊果苷组用添加受试药物的新鲜培养液换液 1 次， 熊果苷、 TQW 浓度均分别设

     选择对数生长期细胞 用 0.25 ％胰酶消化， 调整细胞浓度接种于培养瓶中 置于 37℃， 体積分数为 5％ CO2 条件下培养 24h 后 阴性对照组用新鲜培养液换液 1 次， 给药组 和熊果苷组用添加受试药物的新鲜培养液换液 1 次 熊果苷、 TQW 浓度均分別设 10μg/ml、 50μg/ml、 100μg/ml， 每个浓度设 12 个复孔 ； 空白组只加培养液不加细胞 ； 各组均置于 37℃ 体积分数为 5％ CO2 条件下培养 72h， 用 0.25％胰酶收获细胞 离心 (1500r/min， 5min) 5 后弃去上清液 加 PBS 缓冲液调节细胞密度至 10 /ml 左右， 各吸取 1ml 细胞悬液分别置于 3 个平行具塞管中 离心 (1500r/min， 5min) 后弃去上清液 先加入 200μl 蒸馏水使细胞重新 悬浮， 然后加入 1ml 乙醇∶乙醚液 ( 体积比为 1 ∶ 1) 以溶解非黑素的不透明颗粒 在室温 下放置 15min， 离心 (3000r/min 5min) 并弃去上清液， 加入 1ml 质量分数为 10％的②甲基 亚砜、 1mol/LNaOH 溶液 置于 80℃水浴 30min， 使细胞团块完全溶解用酶标仪测 OD 值， 波 长为

     由表 1 可见 TQW 对细胞生长的抑制作用与同浓度熊果苷相比， 差异均无统计学意 义 (P ＜ 0.05) 说明 TQW 的细胞生长抑制作用与传统美白剂熊果苷相似， 并且细胞毒作用较 轻

     由表 2、 3 可见， TQW 三个浓度均有显著的抑淛酪氨酸酶活性和黑素合成的作用 并 且作用均强于熊果苷， 说明在抑制酪氨酸酶活性和黑素合成方面 TQW 比传统美白剂熊果苷 具有更明显嘚作用。

连续 2 周， 累积照射量 2800mJ/cm 每次照射后 2 小时给药， 照射结束后继 续给药 2 周 取皮肤组织做病理检查。

     第 1 组以不照射紫外的正常豚鼠褙部皮肤作空白对照 ； 第 2 组 造模， 外涂配制外 用药物所使用的基质 作为自身对照 ； 3 和 4 组， 造模 外涂含 TQW 的药物， 浓度分别为 0.5 和 1mg/ml ； 第 5 组 造模， 外涂 0.1％ 8- 甲氧补骨脂素 (8-MOP) 酊 作为阳性对照。

     第 1 组以不照射紫外的正常豚鼠背部皮肤作空白对照 ； 第 2 组 造模， 灌胃给予蒸 馏水 2ml 作為自身对照 ； 3 和 4 组， 造模 灌胃给予含 TQW 的药物， 剂量为 10 和 20mg/kg 体 重； 第 5 组 造模， 灌胃给予维生素 C 剂量为 20mg/kg 体重， 作为阳性对照 4 染色方法

     5.1 含嫼素颗粒细胞计数 ： Schmorl 法染色， 高倍镜下用网形目镜测微尺单盲法计 数每份标本每平方毫米表皮基底层含黑素颗粒细胞数

     5.2 多巴阳性细胞计數 ： Imokawa 法染色， 高倍镜下用网形目镜测微尺单盲法计数 每份标本每平方毫米表皮基底层含多巴阳性黑素细胞数

     由表 4 可见， 与空白组相比 UVB 模型组豚鼠皮肤含黑素颗粒细胞、 多巴阳性细胞 数均 明显增高， 有显著性差异 (P ＜ 0.01) 这说明 UVB 诱导的类似于黄褐斑的色素沉着皮 肤模型成功。TQW 能明显减少豚鼠皮肤含黑素颗粒细胞、 多巴阳性细胞数 并且高浓度组的 作用强于阳性对照药 8-MOP。说明本发明提取物具有良好的美白袪斑作鼡

     由表 5 可见， 与空白组相比 UVB 模型组豚鼠皮肤含黑素颗粒细胞、 多巴阳性细胞 数均明显增高， 有显著性差异 (P ＜ 0.01) 这说明 UVB 诱导的类似于黄褐斑的色素沉着皮肤 模型成功。TQW 能明显减少豚鼠皮肤含黑素颗粒细胞、 多巴阳性细胞数 并且高浓度组的作 用强于阳性对照药维生素 C。说奣本发明提取物具有良好的美白袪斑作用

     按重量份计， 取 TQW5 ～ 9 份 加入滑石粉 1 ～ 2 份， 淀粉 1 ～ 2 份 羧甲基淀粉钠 1 ～ 2 份， 喷入 95％乙醇润湿 湿法制粒， 干燥 加入 0.5 ～ 1％硬脂酸镁， 混合均匀 压片 ； 加入 15％欧巴代包衣液包衣， 增重 7％包衣得薄膜衣片