一种 MG53突变体及其突变方法和应用

本发明涉及一种 MG53突变体 （也可称为 MG53蛋白突变体）， 以及该 MG53突变体在 保护心赃、 治疗细胞死亡导致的心脏疾病方面的应用， 尤其是 MG53突变体在保护心脏的同 时， 避免了同样具有心脏保护功效的 MG53所带来的同时伴有的胰岛素抵抗、 肥胖、 糖尿病 和代谢综合征等副作用。 背景技术

将这些蛋白带上泛素标记以便降解）， MG53也是一种细胞膜修复机制的重要组 成部分。

在医学应用方面， MG53 治疗 ?细胞凋亡引起的心脏疾病的功效已被接受并成为业内前 沿领域的公知。 MG53能够对心脏产生保护作用， 也就是说可以通过增加 MG53的含量保护 心脏损伤。 但是， MG53 同时存在着不可忽视并被视为一大危害的负面效果， MG53 含量的 增加在保护心脏的同时， 会引起胰岛素抵抗、 肥胖、 糖尿病和代谢综合征。 也就是说 MG53 在保护心脏的同时， 伴有胰岛素抵抗、 肥胖和糖尿病等副作用。 这是业内所关心的且不希望 其: ι 负面作用共存的一个问题， 至今没有解决渠道。 发明内容

本发明提供一种 MG53的突变体， 为 MG53蛋白在其 N端的 RING结构域 7个半胱氨酸 屮的任 个或两个或两个以上的半胱氨酸突变为非极性氨基酸 （例如丙氨酸） 的 MG53蛋白 ?变体。 该 MG53蛋白突变体在保护心脏的同时， 避免了同样具有心脏保护功效的 MG53所 带来的同时伴有的胰岛素抵抗、 肥胖、 糖尿病和代谢综合征等副作用。

G53能够对心脏产生保护作用， 也就是说可以通过增加 MG53的含量保护心脏损伤。 但之后发现， MG53 含量的增加在保护心脏的同时， 会引起胰岛素抵抗、 肥胖、 糖尿病和代 谢综合征。 也就是说 MG53在保护心脏的同时， 伴有胰岛素抵抗、 肥胖、 糖尿病和代谢综合 征等副作用。 为促进 MG53蛋白在保护心脏方面能进一歩去劣存优， 本申请进行大量的科研 工作， 最主要目的是对 MG53蛋白进一歩突变， 希望能在不引起胰岛素抵抗、 肥胖、 糖尿病 和代谢综合征等副作用等前提下， 使突变体保留行使心脏保护功能， 但不伴随相应的副作用。

本发明提供了一种 MG53突变体，该 MG53突变体为 MG53的 N端的 RING结构域 7个 半胱氨酸中的任一个或两个或两个以上的半胱氨酸突变为非极性氨基酸的突变体； 该 7个半 胱氨酸分别是在 RING结构域的第 14位点、第 17位点、第 29位点、第 34位点、第 37位点、 第 53位点、 第 56位点。

上述这 7个半胱氨酸都是 MG53的 RING手指区的重要位点， 而 RING手指区是其行使 E3连接酶活性、 降解其底物、 以及引起胰岛素抵抗、 肥胖、 糖尿病和代谢综合征等副作用所 必需的， 因此发明人选择了这 7个半胱氨酸作为研究对象。

实验和事实证明， 该 7个半胱氨酸的任意一个或者两个或两个以上的组合突变为非极性 氨基酸都能达到本发明的预期目的和有益效果。

本发明提供的上述 MG53蛋白突变体在保护心脏的同时， 能够避免 MG53所带来的问时 伴有的胰岛素抵抗、 肥胖、糖尿病和代谢综合征等副作用， 且心脏保护作用却不受任何影响。

上述的 MG53突变体中， 所述的非极性氨基酸为丙氨酸、 甘氨酸、 缬氨酸、 亮氨酸、 异 亮氨酸、 脯氨酸、 苯丙氨酸、 色氨酸、 或蛋氨酸。 优选地， 非极性氨基酸为丙氨酸、 甘氨酸、 -; 氨酸、 脯氨酸、 纈氨酸和异亮氨酸。 最优选地， 该非极性氨基酸为丙氨酸。

本发明的 MG53 蛋白突变体的改造方法也可参见市售可得到的北京全式金公司的 Easy Mutagenesis System (试剂盒） 的说明书， 其对突变改造方法和歩骤均有详细的说明记载。 本发明还提供了上述的 MG53突变体 （即 MG53蛋白突变体） 在制备治疗心肌细胞损伤 相关疾病的药物中的用途。

上述的 MG53突变体的用途，其中所述的治疗心肌细胞损伤的药物还包括治疗 /预防心脏 缺血、 ?灌注损伤所致疾病的药物； 上述疾病进一歩还包括心肌细胞缺损、 心肌缺血、 心脏 缺血 /再灌损伤、 心肌梗塞、 心力衰竭、 心律失常、 心脏破裂等的药物。

本发明尤其提供了 MG53突变体为 MG53C14A时， 即， MG53C14A在制备治疗心脏损 伤或心肌损伤的药物中的用途

关于 MG53 在治疗心脏损伤 /心肌损伤中的应用， 以及其在治疗 /预防心脏缺血、 再灌汴 损伤所致疾病中的用途，可参见 】 .3公开的药学实验部分的实验方法和实验数据。

在心肌细胞中过表达 MG53或 MG53C14A,都能对缺氧引起的心肌细胞损伤产生保护作 。 本中请中所提及的 MG53突变体， 是指 MG53突变蛋白， 或 MG53突变体蛋白。

众所周知， 胰岛素抵抗是肥胖、 2 型糖尿病等多种代谢障碍疾病的根本致病因素之一。 11然骨骼肌在胰岛素刺激引起的糖利用中占 70-90%，但是人们对肌肉胰岛素抵抗的具休机制 个:今仍所知甚少。 本发明以下实验部分先证实， 在小鼠中， 骨骼肌特异性蛋白 mit_SUgurain53 (即本发明所述的 MG53 ) 介导了胰岛素受体 （1R) 和胰岛素受体底物 1 (IRS1 ) 的降解。 上调MG53时， 引起以胰岛素抵抗、 肥胖、 高血压、 脂代谢紊乱为表征的代谢综合汪。 在 胰岛素抵抗动物模型中， MG53表达水平显著升高； MG53过表达可以导致肌肉胰岛素柢抗， 继而引发代谢综合征。 相反， 通过保护 1R和 IRS1 , 保持胰岛素信号通路完整性， MG53的 敲除成功阻止了饮食诱发的代谢综合征的发生。 在机制上， MG53作为 E3连接酶， 泛?化胰 岛素受体 （IR) 和胰岛素受休底物 1 (IRS1 ) , 导致二者通过泛素依赖的途径降解， 构成骨骼 肌中控制胰岛素信号强度的主要机制 _t 这些发现确切地证 ? MG53是一个治疗代谢紊乱和 ffl 关心血管并发症的新靶点。

代谢综合征包含胰岛素抵抗、 中心型肥胖， 脂代谢紊?和高血 等一系列的病 ， 行病比率: 在增加， 已经成为人类健康的重大威胁之一。 代谢综合征使心血管疾病发 几率 h调 2倍， 2型糖尿病发生几率上调 5倍。 胰岛素抵抗是包括代谢综合征、 肥胖、 2型糖尿病 在内的众多代谢紊乱疾病的根本 闪。 I为骨骼肌在胰岛素刺激' i起的糖利用中占 70-90%的 比例， 骨骼肌中胰岛素抵抗可能是代谢综合 ? Π 2型 ^病的 ?要致病机理。 确实； 纵 研 究提供证据表明骨骼肌胰岛素抵抗是代谢综合征和 2型糖尿病病理过程的最早期歩骤。 i， 人们对骨骼肌胰岛素抵抗背后的机制所知甚少。 在 MG53保护小鼠抵抗饮食诱导的代谢综合征的?验中， 用 western blots检测骨骼肌中 MG53 含量平均值 （胰岛素紊乱和代谢疾病大鼠、 非人灵长类模?， 与年龄性别对应的对照 相比）， 数据与 GAPDH相比后标准化， 结果表明， 在高脂喂养 i秀导的肥胖小鼠、 db.'db糖 病模型小鼠、 自发性高血压大鼠和非人灵长类代谢综合征模型中， MG53 丰度均上调。 在肥 胖人类个体中， MG53水平上调也被实验证实 （图暂欠奉 λ 这些结果为未曾预料到的 MG53 和代谢疾病之间的联系提供了揮：要线索。

为了确定 MG53在代谢综合征致病过程中的必要性， 从小鼠出生 3周起， 发明人开始跟 踪监测 MG53敲除 (MG53-/-)小鼠和对应的野生型同窝出生仔在髙脂饮食（60%热量來自脂肪） 和普通饮食情况下的体重和代谢指标变化。 在 3-38周内, VR常饮食情况下, ^野^ ^小 相 比， MG53 敲除小鼠体重、 血 k、. 血清胆固醇、 甘油三酯， 都没有明显变化。 然而， 在不改 变血清胰岛素水平的情况下， MG53敲除小鼠血糖含量明显减少 在 38w检测 。

在髙脂喂养情况下， MG53敲除小鼠和野生型小 It有显著不 |H]。 经过 35周的高脂喂养， 野生型小鼠 MG53水平上调， 发生了以肥胖和高血压、 高血糖、 高胰岛素、 脂代谢紊乱、 肝 脂肪化为特征的代谢综合征。 值得注意的是 MG53敲除小鼠不会发生高脂喂养引发的代谢紊 乱。 与正常饮食喂养的野生型和 MG53敲除小鼠相比， 经过 35周高脂喂养 MG53敲除小鼠 的血压、 血糖、 血清胰岛素、 血脂 (胆固醇和甘油 ^: 水、 !^ZH MG53 缺失也 了高脂喂养诱导的肥胖， 脂肪肝骨骼肌脂肪积聚， 脂昉细胞肥大， 白色和棕色脂昉含頻： 调。

为探究全身性胰岛素敏感性与代谢综合征发牛之间的关系， 泎饮食千预后的不 |: 、;', 点 进行了葡萄糖耐量试验（GT s) 和胰岛素耐量试验（ITT_S)。 给予高脂饮食的野生型小?在 7 周时表现出葡萄糖不耐受和胰岛素抵杭， 即， 该现象 ^于 ^周时肥胖的发生。 随着 饮^ 的继续喂养， 野生型小鼠的葡萄糖不耐受和胰岛素抵抗逐渐加剧。 35周后， 高脂饮食导致了 胰岛的代偿性肥大、 血清胰岛素水平较本底升高 7倍， 致使蔔萄糖刺激胰岛素分泌障

但是， MG53 敲除小鼠在高脂饮食下没有表现出 任一表型， 而是维持 常 迎.搪 和胰岛素水平， 即便在经过高脂饮食 30周后， MG53敲除的小鼠, 未出现野生 ?小鼠屮的胰 岛素抵抗 (糖耐量和胰岛素附 MG53敲除小 的胰腺形态变化和胰岛素分泌反 也 H; ?d 改善。 隱， MG53 的敲除 Γ保护小鼠免于高脂饮食诱^的胰岛素抵抗和代谢紊乱， ：: U:表 明， MG53为高脂饮食诱导的胰岛素抵抗和代谢综合征发 ：所必 。

内脏脂肪和睾丸）， 并没有检测到 MG53 , 这说明 MG53的表达受到一种肌肉特 忭方式 的严格调控。即使在没有饮食干预的情况下， 38周龄的 MG53转基因小鼠出现肥胖和高 lilL/K， 并作随着血脂异常、 高胰岛素血症肥胖和禁食后血糖水平升卨。 与同窝出生的野生^小 ?相 比， MG53 转基因小鼠的昼夜能 消耗明显降低， 但 H摄食 不变。 值得一提的 ， 葡霸 耐量试验和胰岛素耐量试验显 ^， MG53 转基因小鼠的 代谢和胰岛素敏感性存在严 ?的损 伤， 并伴随着胰岛肥大和葡萄糖剌激胰岛素分泌的障碍。 解剖学和组织学数据进 · ? - MG53 转基因小鼠出现了中心性肥胖、 脂肪肝、 脂肪细胞肥大和骨骼肌内脂质沉积。 这 ^数 据表明， MG53 的上调对于引发胰岛素祇抗和进一歩发展为代谢综合征既是必要的也^充分 的。 注： MG53的敲除阻断了饮食诱 ^的全身胰岛素抵抗相关实验中， 野 4·:型和 敲除 小鼠， 给予 ?Ε常饮食或高脂饮 后在指定时问点进行葡萄糖耐景试验和胰岛素耐 fi试验。 胰 腺用苏木精和伊红染色。 葡萄糖 按 2克毎千克体重腹陀汴射、 剌激下血淸胰岛素的 变 化。 野生型和 MG53敲除小鼠均给予^常饮食或高脂饮食 35周。 所有数据均显示为 均值 十 /-标准误。

胰岛素刺激时，胰岛素受体的内在酪氨酸激海活性可引起受体自身的酪氨酸 15 i:1磷酸 化。随后招募并磷酸化胰岛素受体底物如胰岛秦受体底物 IRS1 )、胰岛素受休底物 2 RS2 ), 并激活下游的磷酸肌醇 -3-激 ?， 以凋节骨骼肌的葡萄糖稳态。 为探究 MG53介导的胰岛 抵 抗的分于机制， 发明人检测了 MG53可能调控的位于胰岛素受体 -IRSl -PI3K-Akt-GSK3p途径 的信号分子。 在胰岛素抵抗和代谢紊乱的 G53转基 小鼠校 屮， 骨骼叽内 ! 胰岛 刺激 引起的胰岛素受体 （β亚基） 和 1RS1 的酪氨酸磷酸化， 以及 Akt473位丝氣酸的磷酸化均被 麵。 |nj时, 这些小鼠骨骼 ?]' ψ， 胰岛素受体和胰岛素受沐底物 1的蛋 Α表达水平 少， 但其 mRNA水平保持不变。 ? 别 MG53过表达的裒 I·调 MG53成 功模拟了 MG53转基因小鼠的典 特征 此， 发明人的体内 ^体外实验数据均 i ;

的 I：调表达足以同时降低胰岛素受体和胰岛素受体底物从而抑制胰岛素信号转导的这两个关 键歩骤。 注： 在过表达 MG53 引发全 岛素?抗和代 ^综合征的试骀中， 通过

MG53转基因小鼠的体重、及 38周龄的野 型和 MG53转荜 W小鼠的收缩 ?和舒张 Ι Ι(Π.请 胆醒、 ti油三酯、 血清胰岛 及在禁食和进食状态 ^ 水平， .及 30 )₍ 脂饮食 ? ^型和 MG53敲除小鼠的葡 ???耐量试验和胰岛素耐 38 !龄的野生 和 MG53 ^ W小鼠胰腺、 38周龄的野生型和 MG53转基因小鼠葡萄糖 t按 2克每千克体重腹腔注射）剌 激下的血清胰岛素的浓度变化，或其相 ?于基线的变化 ?分比来做实验指标和数 ?进 统计。

髙脂饮食喂养的野生型小鼠 MG53表达跫增 ^， 和 MG53过表达 -样， ?骼肌胰 ^發 ·被严重抑制了， 同时 IR和 蛋白水平降低， mR A水平不变。 此外， 伴随着 上 调， IR和 IRS1 后下调在各种川 研究 if^J胰岛素抵抗啮 ^型屮是 ·个普 ?的现象. 應 肥胖或 2型糖尿病动物模型和人 ·样.： 他实验中， 还^ 了即使在高脂饮食导致的代谢 k力下， MG53缺失可以使小 |?维持 IR和 IRS)的完整性以及全身的胰岛紊敏感性。 特别的， 在 MG53敲除小鼠中高脂饮食?法降低 Π 和 IRS1的丰度 ' 际 h， MG53 水

会使骨骼肌中 IR和 IRS1的 积累， 可能导致 MG53敲除小 ! ,相对于 同窝野 对 . 糖水平降低。 相对于野生型正常饮食小鼠， MG53 敲除小鼠 W胰,¹ ?素引起的 1R、 iRSK Akt 和 GSK3P磷酸化会显著增加。 因此， MG53 t调对于卨脂饮食和代谢疾病引起的骨骼 UR 和 IRS1— 调看起来必不可少

之后，寻找决定 MG53介导的骨骼肌特异的胰岛素抵杭发展成为全身的代谢紊乱的 ^。 为 T ? 的，发明人跟踪了 MG53TG小鼠和高脂饮食喂奍的 f生型小 (多种器 '?代谢紊乱发 生的不 R]时期。 结果显示通过过农达 和^脂饮食诱 骨骼肌胰.' ? ?抵杭远 J ^-? f l 谢紊乱的发展 （包括肥胖和多 ?; '胰岛素抵抗）。 6周龄 lii MG53TG体 i和野' k型 ， 但是肌肉的胰岛素信号明显被损伤了 , 而肝脏和腹部脂 的胰岛素信号却没^变化。 W烊^， 高脂饮食喂养 1周的野生型小^会导致 G53显 ！ 肌胰岛素〈i^? ， 这在 ?:：】脂 7周之后才出现的系统性葡萄糖胰岛素不耐受和 1 1周出现 显的肥胖之 。 这之后； 1!：常饮 食的 MG53TG小鼠 ( 38周) 和高 ?饮食的野生型小 ( ?脂喂养 35 的肝 ^fl ''.''^织 才发展为完全的胰岛素抵抗 这 数据和 MG53缺 对于代谢紊乱 ? ?保护作 ? 烈说明 MG53介导的骨骼肌胰 ? ?抗在病理发 过 ·Α:'Τ':要的 '-jZ wii - 致的是， 在人和动物模型上的研究也揭示了肌肉胰岛素信号降低在肥胖和葡萄糖小^受病^ 过程中是 个重要的环节。 ?Γ : MG53 调节的胰岛素信号的 !1关实 ?， 川代表忭 r^fi^均 western blots数据显示 38周 型和 MG53转?闵小 ?或 ι 常饮食或高脂饮食喂养的 MG53 敲除小鼠和他们的野生型 [R]窝小^胰?素诱导的 -β和 Rsi的 ? 氨酸磷酸化，

酸化和他们的总蛋白水平。 憐酸化蛋 H和总蛋 相对 GAPDH标^化， ?为其 1;、」· j''野 z I·:型本底的倍数。代表性的 western印 id 统计数据显不狭 ,? W 起 6 、 38周野 ,！ ·' ?和 VI G53 转基因小鼠骨骼肌、 肝脏、 鹰) ?的 Akt的磷酸化。

因为 1RS1是 IR和胰岛尜祥 长因子 -I受休 ( IGF-IR 号通路共 ^的节点， 发 人还 研究了 MG53 对于肌肉除胰岛 信号之外 IGF-1 信 的！;响 通过比较不^剂量朕? ^或 IGF-I诱导的野生型和 MG53缺陷小鼠 骼肌 IRS1酪?酸? ^化， 发明人发现 N4G5 ' u 在胰岛素信号中的 IRS1作为「i标。 特别地， 尽 MG53缺火增加了胰岛素刺激的 IRS】 酸磷酸化的剂量效应， 这加强了 iGF-I在 β浓度的效果， 而不是低浓度的 1GF-I。 如 \1053 选择性的把胰岛素受体介导的； RS1 ?Η号作为目标，那么 MG53 〖GF-I受休信 ^^ '！功 丁胰岛素受体和 IGF-I受体的 一.聚化或高剂景 1GF-1 ' !?ι' 胰岛素受体交叉激活，

山于 MG53在氨基端包含 - -小经典的 E3泛素化连接 RING finger结构域 (或称 R.i G Γ' 指 [ 域， 或 ING结构域）， 发明人提出 MG53可能作为 -个肌肉特异的 E3泛 化 接 作 用胰岛素受体和 IRS1进行泛察依赖的降解。 多种 I正据支持这个假设。 fi先， 免疫共 ·:';':: 小- 了内源性 MG53和胰岛素受体、 IRS]之问有物理相互作 ，在 HEK293细胞外源性表达 MG53 和 IR、 IRS1也是如此。其二 在 MG5 TG小鼠骨骼肌屮， 过^达 MG53可以提 IR和 1RS1 的泛素化。 另外， 高脂饮食增加了野' k型小鼠骨骼肌胰岛素受体 l IRS1 的泛 化. 不 i MG53敲除。 现有的结果证明了 MG53 E3泛素化连接酶促进了泛素依赖的骨骼肌 IR和 1RS1 降解， 尽管在 (FBXO40 是. 肉特异性的） 特定的 ^胞培养系统和 织其他 S3连 接酶和 IRS1降解有关。相反的，无论足 MG53过表达还 I 除， 血糖稳态有关^卻 iR: \ GLUT1或 GLUT4的蛋白丰度却没冇改变， 说明他们不, G5 的底物 ,

纖， 这证明了 MG53介导的咦^； 信兮通路的抑制是通过蛋 嗨体系统。 MG!32, ·种蛋白酶体抑制剂的实 Ψ??^到了类似结 、之, 们1 体^': ?^ 、外' 〈！ 验结果证明， MG53是 -个新的 F3连接 它能够通 j 泛 ：赖的降解， 接 i ?? IR,:¹' I "SI 的蛋白稳定性。 这个发现证 了 MG53能够 M时 调！R和 IRS1-

抗和代谢疾病的潜在机制， !iij RING手指区域中的半胱氨酸足 MG53介导 1R和 IRS!降解. 产生胰岛素抵抗， 发生全身肥胖和代谢性疾病所必需的。

归纳起来，尽管 MG53作为膜修复和心肌保护已经众所周知， 发明人在这 小了 MG53 足一个在胰岛素抵抗和代谢紊乱的动 ?模型屮 '';勺

MG53 高表达做为启动全身 ?岛素 ?抗和代谢 合^^必 ^的。 MG53 作为

异性 Ε3连接酶能够导致 IR和 IRS】 的泛素依赖性降解, 成为了一个决定性的1'骼肌 信号的负向调节者， 从而引起 的胰岛素信"及代谢的缺陷。 而 RING手指 i 域屮的 胱

?：酸是 MG53发挥上述代谢扣关作用必需的，突变 RING ^指 域中的半胱氨酸能够使 丧失引起胰岛素抵抗、 肥胖、 糖尿^ 代谢综合征的作^

这些发现不仅定义了 MG53足- -个骨骼肌胰岛素敏感性的负向^节者， 还 —'、':，' MG53 介导的肌肉胰岛素信号抑制是 ·个导致全身胰岛素抵抗和代谢综介征的 i要的机制 这也标 志着 MG53 Ε3连接酶能够被作为一个治疗各种代谢疾病， 包括肥胖、 2型糖]^病和相关的心 血管并发症的重要潜在靶点。

^血压大鼠） 和同源同龄雄' i:常血！：、:大?来 北); 利^公司 ?:?发 ^ z^^d 代谢综合征的非人灵长类动物模型的幵展和鉴定在之前的文献中已有报迫。

MG53 基因敲除小鼠和饮 ft千 f : 所有动物^序和安乐死术都是桉照中 北京人 'V^j物 研究委 会批准的协议來执行的， 并 符合实验动物护理和使用指南 (iQ85

MG53转基因小鼠： 鼠科 MG53基 ^全长 cDNA编码序列被克隆到 pUC-CAGGS 雌 Xhol位点， 受鸡 beta肌动蛋白 ^动子调控。经 Sail酶切线性化并通过凝胶纯化以后, 这个片 段被显微注射到小鼠的受精卵 A。 PCR W来进 因型鉴〉 i!。

心肌细胞损伤的检测方 :

： 中取出， 放 个: 温待用; 3 细胞培养板中每 样本留取 定 ?的细胞坊养液， 等 的 ΑΤΡ试剂? （叩， 细胞培养液与 ΑΓΡ试剂按照 1:1的比例混合） ； 4 将样太轻摇 2ηι?_η (此^骤中细胞， te 养液和 ΛΓΡ试剂轻混）； 5 室温静置 lOmin后： 6 吸取样本^酶标板屮， _ I：机枪测 Luminesce'^ 对于 LDH浓度， 采用上海景源医疗器械有限公 (LDH0360)。 j?体的实验 法: i LDH试剂盒内试剂， 按照试剂 2和试剂 1 (1:5) 的比例完全混合后， 2-8度保存待 m; 2 嗜 标板中加样本 40ul/孔； 3 与 Ou!/孔的试剂混合后. ?: Λ测定 340nm处的吸光度值。

最后用 RIPA缓冲液洗涤 ?树脂::：'.次， 洗脱 十?疫印迹分析。

组织学分析： 用于组织 分析的 U Oiilj'L 睡, ：：色脂肪 - 内脏脂肪和 '' ·^： ? 定在 4%多聚甲醛 (ρΗ7.4) Φ过夜. 包^在石蜡中， ：： f !:5 u 连续切片。 并对他们 r 准的苏木精和曙红染色以及 ?光?色。

血 ?Κ测量： 收缩压和舒张) k的测 是以 -祌^^ λ' ^万法 Υ 】总识的小^」 -.， 川) 系统加热至 37摄氏度 (Visitech BP- 2000血 分析系统） 成的。小鼠对该设备的适应 为 7-10 天， 之后经历了两个周期的测_ ， 天测 10个动物， 为期 -：天^血 稳^。

代谢测量：在葡萄糖耐量 ?验屮，小鼠禁食过夜（16小吋），然后腹胺注射 D-葡萄糖（2_g/kg 体重）。 在胰岛素耐量实验巾， 小^随机喂养和腹腔注射牛胰岛^ (O.V J kgi^^, Si?n.a-Aldri h 公 π])。 为了检测葡萄糖刺激胰岛素的释放， 小鼠禁食 16 hC 射 D-葡萄塘 (2 /k 收 集注射前和注射后不同时间 '：的尾静脉血。

对于代谢率分析， 小鼠分别独立安 在一个 12小时光照 /黑暗的环境内 一个综合 ft的动 物代谢监控系统（CLAMS;哥伦布仪器公司）被用来评价小鼠迩续超过 72小时的^耗 i! VOI) 和二氧化碳生产 (VC02)。能 的汁 '公式为： .815+:.232V02/VCO'2)><V(.V2。

本发明还提供了一种动物细胞，该细胞转染了 . h述 动物表达载体；该动物细胞力 C2C! 2 肌管细胞。

本发明还提供了上述 MG53突变体在制各应 心肌损伤 的药物^的川途； 乜 括在心肌损伤修复引起的胰 素抵抗、 心赃缺 、 diWi/rt灌损伤、 心肌??、 心力 哀竭、 心律失常、 心脏破裂的 物屮的 迨 太 日 ^了 ^ G5

备治疗胰岛素抵抗、 肥胖、 ftiW病 代谢类疾病的药物 Ψ 川途。 优选 fi:制各 节 ι?ιι. 的药物中的用途。

以及， MG53突变体为 MG53C34A, i述的用途为 MG53C34A在制备治疗心肌损伤的药物 屮的用途。 附图说明

图 1: MG53、 MG53C14A和 MG53 ARING都能够保护缺氧引起的心肌细胞的损伤。 在培养的心肌细胞中， 过细胞 含 (左; 1-1)和细 ?外乳酸脱氢嗨 ( LDH ) U (右图） 检测缺氧引起过表达对照载体 （vector) 的细胞出现明 的死亡， 而在过表达 MG53 或者 MG53C14A的细胞中， 细胞的死亡均明显减少。 同样， 过表达 MG53 ARING 能够降 低缺氧引起的心肌细胞的死亡 （ '

图 2: MG53敲除能够保护高脂饮食引起的代谢疾病。

a 正常饮食或高脂饮食喂养不同时间的野生型和 MG53 敲除小鼠的体電变化。 b-e i 常 饮食或高脂饮食喂养 35周的.野 ^和 MG53敲除小鼠的 ??πΓΚ (b), (c；)、血献 ( d：'、 幢隱 (e) 和血甘油三酯 （f) 数据。

图 3: MG53敲除能够保护高脂饮食引起的胰岛素祗抗。

a iK常饮食或高脂饮食喂养 30周的野生型和 MG53敲除小鼠的糖耐量（ 、和胰岛尜咐 ：? (右)数据。 b 正常饮食或髙脂饮食喂养 30周的野生型和 MG53敲除小鼠屮葡萄糖 起的 胰岛素分泌数据。

图 4: MG53转基因能够引起的^胖和代谢疾病,，

MG53转基因小鼠的血胰岛素、 血糖、 血压和血胆 醇数 Φ；。

图 5: MG53敲除能够保护高脂饮禽引起的胰岛素抵抗

图 6: MG53能够与 和 iRSl相互作用， 并增加其泛素化。

a通过免疫共沉淀实验检测野牛 小; ?的骨骼肌 MG53 '-7 IF. ?， I S 相 仆 . b ;1； 常饮食喂养 38周的野生型和 MG53转基 [?小鼠的骨骼肌中， IR (上） 和 IRS1 「卜) Π勺泛桌 化程度数据。 c IH常饮食或高脂饮食喂养 35周的野生型和 MG53敲除小鼠的骨骼肌屮，IR( 和 IRS1 (下） 的泛素化程度数据。

图 ?·· RNG手指区删除和 C14A突变的 MG53, 不能引起 iR和 1RS1的泛素化增加， 而 且不能抑制胰岛素信号。

图 8: 蛋白酶体抑制剂能抑制 MG53引起的胰岛素信号变化

附图 9: MG53C294与 都能够保护缺氧引起的心肌细胞的损伤。

?变体不能够引起 IRS1的蛋 A 下降。 具体实施方案

2、 以突变质粒 200:?作??！板， 使 高保真 DNA聚含隨， 用特异性突变引物进行 PCR 反应扩增。 反应产物用琼脂 凝胶鉴定。

5、 挑取平板上的单菌落， I A测序检测突变结果。

其他歩骤同 C14A。 或"」参见实施例】?4.

(Incella) 转染细胞， 具体歩骤如下：

( 5 ) .将混合物均匀加入细胞， 培养 6小时， 换成普通培养基。

48小时后， 利用细胞裂解 buffer裂解细胞， SDS-PAGE分离蛋白， 转膜后利用 Flag抗体检 测蛋白表达。 实施例 22. 通过 PCR的方法截断 RING结构域：

酶切位点为 Kpnl 和 Xhol, 以此 MG53全长质粒为模板， 利用这两个引物做 PCR， 反应 体系为：

反应产物经 Kpnl/Xhol双酶切处理， 同时 pcDNA4/TO/myc-His B质粒也用两种酶双酶切 处理。 之后琼脂糖凝胶分离 DNA， 做胶回收， 利用 T4连接酶做连接反应， 连接产物转化大 肠杆菌 ToplO菌株。 验证阳性克隆利用测序验证序列正确。

申请人构建好的 dRING质粒， 表达的蛋白为： 从 N-端 58Ala幵始， 到 MG53全蛋白结 束， 并在 C-端带有 Myc标签。 实施例 23. 不同突变体和 MG53野生型保护心肌细胞缺氧的能力差异

根据实施例 1、 3、 4构建 MG53C14A、 MG53C29A, MG53C34A三种质粒， 根据实施例 21进行心肌细胞表达，在缺氧环境下检测细胞内 ATP含量和细胞外乳酸脱氢酶浓度检测來检 测缺氧引起过表达对照载体 (vector)的细胞出现明显的死亡， 而过表达 MG53C29A 与 MG53C34A两种突变体都能够和 MG53或者 MG53C14A相似，明显减少细胞的死亡。如图 9。

细胞缺氧的方法是， 把细胞培养在 Ι ΡΜΠ640/5% 胎牛血清的培养基中 48小时以后， 更 换培养基为不含血清的并利用 95%氮气和 5%二氧化碳饱和的 RPMI1640培养基，而后把细胞 放到 37摄氏度的充满 95%氮气和 5%二氧化碳的密封小室 （Ohmeda oxygen monitor, type 5120) ?现细胞缺氧。 对于 JH常的对照， 细胞的培养基换成 RPMI1640/5% 胎牛血清， 放在 37摄氏 度含有 5%二氧化碳的孵箱中。

心肌细胞损伤的检测方法如下：

放置恢复至 ?温待用； 3 细胞培养板中每个样本留取一定量的细胞培养液， 与等量的 ΑΤΡ试剂混合（即， 细胞培养液与 ΑΤΡ试剂按照 1 :1的比例'混合) ； 4 将样本轻摇 2min (此歩骤屮细胞， 细胞培 养液和 ATP试剂轻混）； 5 室温静靑 lOmin后； 6 吸取样本至酶标板中，上机检测 Luminescent 对于 LDH浓度， 采用上海景源医疗器械有限公司 （LDH0360)。 具体的实验方法： 1 LDH 试剂盒内试剂， 按照试剂 2和试剂 1 ( 1 :5 ) 的比例完全混合后， 2-8度保存待用； 2 酶标板中 加样本 40ιι1/孔； 3 与 200ul/孔的试剂混合后， 上机测定 340nm处的吸光度值。

0.11g/L丙酮酸钠和〗％的青 素 链?！素。 ? C2C12成肌细胞 90%密度时， 我们通过腺病毒感染或质粒转染进行四种质粒导入。 之后， 细胞在含有 2%的马血淸的 培养基 ?培养四天分化成肌管 _c

0.1 lg/L丙酮酸钠和 1 %的青 ?素 -链?素。 ?、'1 C2C12成肌细胞 90%密?^ . 我 ?Π通过腺病毒感染或质粒转染进行四种质粒导入。 之后， 细胞在含有 2%的马血淸的 培养某毕.培养四天分化成肌管

SDS-PAGE上样分离蛋白， 转 PVDF fi, 利 川 anti-IRSl -PYlOO的抗体进行蛋白质免疫印迹分析。其他蛋白均利用选相应的特异抗体进行 质免疫印迹分析。

培养的 C2C12细胞中， MG53过表达能够降低细胞内 IRS1的含量， 而与 MG53C14A突 变体类似， MG53C29A和 MG53C34A 变体不能够引起 IRS1的蛋白量下降。 该实施例说明 相较与 MG53过表达，其他 G53 变体不能引起胰岛素抵抗，较小影响机体代谢。见阁 10b。

34位点、 第 37位点、 第 53位点、 第 56 位点的半胱氨酸， 特别 ?第14位点的 C， 是 MG53引起胰岛素抵抗、 肥胖和糖尿病所必需的， 也就是说上述位点的半胱氨酸尤其足第 14位 C发生突变的 MG53突变体 （例如 MG53C 14A 不能 引起胰岛素抵抗、 肥胖和糖尿病， 却仍然能够保护心肌细胞的损伤， 即， MG53突变体（li拈 G53C 14A )能够在不引起胰 ^抵抗、肥胖和糖尿病等副作用等^提下， 行使心脏保护功能。

本发明所述的 MG53突变体， 包括上述实施例的 MG53突变体， 其序列的 种包括灵长 类动物（例如：人）、大 K和小 其中木试验选用原始野^序列为小鼠 MG53(TRIM72)mRNA 的 NCBI编号： NM— 而其他序列可选自人类： mRNA： NM— 相应 酸序列： NP_ c Κ mRNA: NM 相应氨基酸序列： NP .1。 猴子： mRNA:XMJ)011 12866.2 i应氨 ?酸序列： XP_ 且不应局限- ?·所列举的冇限 序列， 包含所涉及物种的所有 IG53相应序列。 以如上序列为棊础得到的 MG53突变体.、 本中请中所提及的突变体， 即突变蛋白或突变体蛋 。

以上旨在进…歩说明本发明， 并不对本发明的范围加以限制。 本领域技术人员对在此公 丌的实施方案可进行并不偏离本发明范畴和精神的改进和变化。

内容提示：第五章-1 大肠杆菌基因工程-9【精品PPT】.22

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