同科生物同源重组试剂盒如何？有什么特点？_百度知道
同科生物同源重组试剂盒如何？有什么特点？
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重组效率很高，不用重复实验，可以的。同源重组试剂盒产品特点：1、操作简便：无需考虑酶切点限制；2、快速重组：15min实现载体和片段的快速重组；3、效率更高：重组效率为传统酶切连接技术的5-10倍，无载体自连现象，阳性克隆可达90%以上。
基因重组一般可以分为两类,即同源重组和非同源重组.同源重组也称一般重组,多发生于两条DNA链的同源区,同源性愈大,重组愈频繁.非同源重组又包括位点专一重组和非常规重组,位点专一重组只需要很少的顺序同源性,它发生在两种DNA的专一位点上,如入噬菌体整合到寄主大肠杆菌的染色体DNA上,就是发生在入- DNA及宿主DNA的特定位点上.非常规重组不是发生在固定位点上,面是发生在任意位点上,两个DNA分子间可能只有几个碱基对的同源性,通常把由于转位因子引起的缺失、倒位等现象归于此类.重组的种类繁多,分子机制和过程也很复杂,但DNA链的断裂和重接是最基本的重组机制.由于断裂后需要填平缺口和重新连接,这就牵涉到DNA的复制合成,所以一些参与DNA复制和修复的酶都可能与重组有关.基因作为遗传的物质基础应该是相对稳定的,以保持生物的遗传性,作为一种生物而繁衍下去,但生物的基因并不是一成不变的,基因重组为生物的变异和生物进化增添了新的内容.
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分枝杆菌同源重组系统的构建及应用-微生物学专业毕业论文.pdf 49页
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分枝杆菌同源重组系统的构建及应用-微生物学专业毕业论文
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分枝杆菌属包括致病性结核分枝杆菌和麻风分枝杆菌，目前仍然是人类健康
的巨大威胁。分枝杆菌的科学研究都需要有效的分子遗传操作技术，尤其是快速
有效的基因突变及基因敲除的分子操作技术。但是由于分枝杆菌生长缓慢、重组
酶活性较低等原因，在分枝杆菌内的基因操作技术包括基因敲除技术的发展一直
落后于其他模式生物。我们在Xer／dif敲除系统的基础上开发了一种高效、通用、
完善的基因敲除系统。我们在pJV53质粒中引入gfP报告基因，用于快速筛选在
重组后丢失的质粒；构建了出产胁冒一出‘dif-zeo—dif表达盒，在表达盒两边
加了多克隆酶切位点便于上下游同源臂的插入；随后我们利用该系统对耻垢分枝
杆菌的4对毒素一抗毒素基因进行了连续的读码框内敲除，表明该系统可成功用
于分枝杆菌多基因的连续敲除，为分枝杆菌功能基因组的研究提供了新的遗传工
我们对结核分枝杆菌中的毒素一抗毒素系统进行了初步的研究，新发现了6个
在耻垢分枝杆菌中有功能的毒素一抗毒素基因。此外，我们发现12个毒素一抗毒
素基因在耻垢分枝杆菌中具有稳定质粒的功能，这说明它们可能参与调控结核分
枝杆菌基因组的稳定。该研究为进一步研究毒素一抗毒素系统在结核分枝杆菌中
的功能打下基础。
关键词：分技杆菌，基因敲除，毒素一抗毒素系统
tuberculosis
Genus,仃ycobacterium,includingpathogeniCspecies
threattohumanhealth．Bothscientific
7eprae，remains
andmedicalcontr01of
effiCientmoleculartoolSfor
mycobacteriarequire
and deletion．
geneticmanipulation，especiallymutagenesiSgene
lowrecombinase
However，due growth Mycobacterium，the
activity，geneticmanipulationtechniques，includinggene
behindothermodel
technologydevelopmentlagging
organisms．In
study，wedevelopedeffieient，versatile
basedonthe
Xer／dffknockout
system．We pJV53plasmid
ofrecombinant．WealSO
byintroducinggfPgene rapi
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为什么连接转化挑菌做菌液PCR，PCR没有条带啊，全部都是引物二聚体已有7人参与
大家帮忙看看图片，我做连接用的方法是同源重组。而且连接转化做了4次，每次都是同样的结果
IMG_1367.JPG
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你之前酶切载体的酶切你的新质粒，如果正确会得到你的目的片段，如果大小一致，去测序
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我做菌液鉴定用的引物是特异性引物和通用引物，都试了
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连接之前的纯化产物浓度怎样？感受态细胞会出问题吗？
第一行右侧和第二行左侧那个大片段的是连进去的了吧
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既然是连接转化，那就不要PCR验证了，选两个提质粒酶切验证
这么多都是空载的话，说明你前面做的不够好，效率这么低可能做不出来。
加我qq我给你分析一下
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GPR3基因敲除小鼠的构建
硕士学位论文GPR3 基因敲除的小鼠构建姓 学名：邢明哲 号：1132962所在院系：生命科学与技术学院 学科门类：理学 学科专业：生物学 指导教师：裴钢 副指导教师：谢欣，张儒二一四年三月A dissertation submitted to Tongji University in conformity with the requirements for the degree of Master of ScienceConstruction of GPR3 Knockout MouseCandidate: Student Number: School/Department: Discipline: Major: Supervisor:Xing Mingzhe 1132962 School of life Sciences and Technology Master of Science Biology Pei Gang、March，2014基 因 敲 除 小 鼠 的 构 建 邢 明 哲 同 济 大 学GPR3学位论文版权使用授权书本人完全了解同济大学关于收集、保存、使用学位论文的规定， 同意如下各项内容： 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本； 学校有权保存学位论文的印刷本和电子版， 并采用影印、 缩印、 扫描、 数字化或其它手段保存论文； 学校有权提供目录检索以及提供本学位 论文全文或者部分的阅览服务； 学校有权按有关规定向国家有关部门 或者机构送交论文的复印件和电子版；在不以赢利为目的的前提下， 学校可以适当复制论文的部分或全部内容用于学术活动。学位论文作者签名： 年 月 日同济大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，进行 研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位论文 的研究成果不包含任何他人创作的、 已公开发表或者没有公开发表的 作品的内容。 对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集体， 均已在文中以明确方式标明。 本学位论文原创性声明的法律责任由本 人承担。学位论文作者签名： 年 月 日
同济大学硕士学位论文摘要摘要G 蛋白偶联受体（G protein-coupled receptors，GPCRs） ，又称为 7 次跨膜受 体（seven-transmembrane receptors） ，是细胞表面最大的受体蛋白质超家族，广 泛地参与细胞的增殖、分化、迁移和凋亡等各类生理活动的调控。G 蛋白偶联受 体 3 （G protein-coupled receptor 3，GPR3）是一种孤儿受体，近期研究提示它 直接或者间接参与调节脊椎动物神经系统及卵泡的发育过程， 同时 GPR3 参与了 老年痴呆症等神经退行性疾病的发生。 因而 GPR3 是一个潜在的治疗多种神经疾 病和卵巢早衰的药物靶标， 它的生理功能及作用的分子机制等都值得进一步研究。 基于此，本论文的主要内容就是利用 TAL 效应核酸酶（transcription activator-like effector nuclease， TALEN） 技术构建 GPR3 敲除小鼠和 GPR3 条件性基因敲除小 鼠。 本研究针对 GPR3 基因， 设计了数对靶向 TALEN， 构建了 TALEN 打靶载体， 以 BL6/C57 品系为对象，通过受精卵原核注射 TALENs mRNA，对新生小鼠 （Founders）进行 PCR、酶切和测序鉴定，成功获得了因缺失 14 个碱基而导致 开放性读码框移码的 GPR3 敲除小鼠， 为 GPR3 蛋白的功能及药物靶点的研究提 供整体水平上的研究模型。 关键词：G 蛋白偶联受体，GPR3，转录激活因子样效应物核酸酶，基因敲除， 小鼠ITongji University Master of Philosophy AbstractABSTRACTG protein-coupled receptors（GPCRs）, also known as seven-transmembrane receptors, constitute the largest family of cell surface receptors and are involved in various biological events including cell growth, differentiation, migration and apoptosis. GPR3 is an orphan GPCR which is recently discovered to be important in both vertebrate nervous system and follicle development. GPR3 was also reported to be involved in the pathogenesis of Alzheimer's disease. Therefore, GPR3 is a potential therapeutic target for Alzheimer ’s disease and follicle dysfunction. However, the detailed signal transduction and molecular mechanisms governed by GPR3 still remain unclear and need to be further investigated. Based on above, the present study aims to generate GPR3 knockout mice using transcription activator-like effector nuclease （TALEN） . We designed and constructed several pairs of TALENs targeting GPR3 gene. The TALEN mRNAs were microinjected into one-cell embryo of BL6/C57 mouse. The born pups （ Founders） were analyzed by PCR, enzyme digestion and sequencing to identify mice with correct targeting sequence. Finally. a mouse with 14-nucleotide deletion within the GPR3 gene region were obtained. Such deletions led to GPR3 knockout due to an open reading frame shift. The GPR3 KO mouse will provide us a useful tool to investigate the downstream signal transduction and the physiological and pathological role of GPR3.Key Words：G-protein coupled receptors, GPR3, TALEN, Gene editing, MouseII同济大学硕士学位论文目录目录摘要 .................................................................................................................................................. I ABSTRACT ................................................................................................................................... II 目录 ............................................................................................................................................... III 第 1 章引言 ...................................................................................................................................... 1 1.1 G 蛋白偶联受体的概述 ............................................................................................................ 1 1.1.1 G 蛋白偶联受体的结构 ..................................................................................................... 2 1.1.2 G 蛋白偶联受体的空间结构.............................................................................................. 2 1.1.3 G 蛋白偶联受体的分类 ..................................................................................................... 3 1.2 G 蛋白偶联受体 3 的概述 ........................................................................................................ 5 1.2.1 GPR3 的组织分布 .............................................................................................................. 5 1.2.2 GPR3 的配体 ...................................................................................................................... 5 1.3 GPR3 的功能............................................................................................................................. 6 1.3.1 GPR3 促进神经突的生长................................................................................................... 6 1.3.2 GPR3 调节Β 淀粉样肽的产生 ........................................................................................... 6 1.3.3 GPR3 抑制小脑颗粒细胞的增殖 ....................................................................................... 7 1.3.4 GPR3 调控小鼠的情绪样行为 ........................................................................................... 7 1.3.5 GPR3 参与调节神经性疼痛及吗啡诱导的抗痛作用。 ................................................... 7 1.3.6 GPR3 在卵泡发育及卵母细胞成熟中的作用 ................................................................... 8 1.3.7 GPR3 在疾病治疗中的潜在作用 ....................................................................................... 9 1.4 TALEN 的概述 .......................................................................................................................... 9 1.4.1 TAL 效应核酸酶（TALEN）的结构 ................................................................................ 91.4.1.1 TALEN 的识别结构域 .......................................................................................................... 10 1.4.1.2 TALEN 的切割核酸酶 .......................................................................................................... 101.4.2 TALEN 的工作原理.......................................................................................................... 11 1.4.3 TALEN 的应用.................................................................................................................. 12 1.4.4 基于细胞的基因修饰 ....................................................................................................... 13 1.5 条件性基因敲除 ..................................................................................................................... 13III同济大学硕士学位论文目录1.6 本研究的目的及小结 ............................................................................................................. 14 第 2 章 材料与方法 ...................................................................................................................... 16 2.1 材料与仪器 ............................................................................................................................. 16 2.1.1 质粒 .................................................................................................................................. 16 2.1.2 细胞株及培养条件 .......................................................................................................... 16 2.1.3 实验动物及饲养条件....................................................................................................... 16 2.1.4 实验仪器 .......................................................................................................................... 17 2.1.5 主要试剂及配方 .............................................................................................................. 17 2.2 实验方法 ................................................................................................................................. 19 2.2.1 分子克隆实验操作 .......................................................................................................... 192.2.1.1 鼠尾基因组 DNA 的抽提 .................................................................................................... 19 2.2.1.2 感受态菌（DH5α）的制备-RbCl 法................................................................................... 19 2.2.1.3 质粒的转化 ........................................................................................................................... 20 2.2.1.4 质粒的提取 ........................................................................................................................... 21 2.2.1.5 琼脂糖凝胶中 DNA 片段的回收纯化 ................................................................................. 22 2.2.1.6 PCR 产物的 TA 克隆及蓝白斑筛选 ..................................................................................... 23 2.2.1.7 InversePCR 法定点突变 ........................................................................................................ 24 2.2.1.8 mRNA 的体外转录 ............................................................................................................... 252.2.2 细胞实验操作 .................................................................................................................. 272.2.2.1 mES 细胞的冻存、复苏及传代培养.................................................................................... 27 2.2.2.2 mES 细胞的 Lipo2000 脂质体转染 ...................................................................................... 29 2.2.2.3 LuciferaseSSA 法检测 TALEN 活性 .................................................................................... 29 2.2.2.4 GFP-Reporter 法检测 TALEN 活性 ...................................................................................... 292.3 数据统计分析 ......................................................................................................................... 30 第三章 结果 .................................................................................................................................. 31 3.1 TALEN 打靶载体的构建 ........................................................................................................ 31 3.2 TALEN 打靶载体体外活性的验证 ........................................................................................ 32 3.2.1 GFP-REPORTER 检测 TALEN 活性 .................................................................................. 32 3.2.2 LUCIFERASE-REPORTER 检测 TALEN 活性 ...................................................................... 33 3.3 打靶载体的体外转录及原核注射 ......................................................................................... 34IV同济大学硕士学位论文目录3.4 KNOCKOUT 小鼠的鉴定 ..................................................................................................... 35 3.5 条件性 GPR3 敲除小鼠的构建 ............................................................................................. 38 3.5.1 FLAG-GPR3-EGFP 的活性检测 ........................................................................................ 38 3.5.2 GPR3-DONOR 载体的构建................................................................................................ 39 3.5.3 打靶载体和 GPR3-DONOR 的 MES 转染 ........................................................................ 40 3.5.4 ES 细胞的鉴定.................................................................................................................. 41 3.5.5 通过同义突变减少对 TALEN 的 GPR3-DONOR 的影响 ............................................. 43 第四章 总结与讨论 ...................................................................................................................... 45 致谢 ................................................................................................................................................ 47 参考文献 ........................................................................................................................................ 48 个人简历、在读期间发表的学术论文与研究成果 .................................... 错误！未定义书签。V
第一章引言第 1 章 引言1.1 G 蛋白偶联受体的概述G 蛋白偶联受体（G Protein-Coupled Receptor，GPCR） ，是人体内最大的细 胞表面受体蛋白家族，大约包含 1000 个成员。这类受体的共同点是其高级结构 中都有七个跨膜 α 螺旋，所以又称 7 个?螺旋跨膜蛋白受体（seven-??helices transmembrane segment receptor,7TM receptor） 。到目前为止，研究发现 G 蛋白 偶联受体只见于真核生物之中，并且参与了大量的细胞信号转导过程。GPCR 通 过感受细胞外的诸如气味、光线、激素、细胞因子和神经递质等信号刺激并将其 跨膜传递到细胞内，GPCRs 激活并启动下游信号通路，从而广泛地参与细胞的 增殖、分化、迁移、凋亡和血管新生等各类生理活动的调控[1-8]（图 1.1）。更 为重要的是，GPCRs 还在多种重要疾病中扮演关键的角色，因而一直是各大药 物研发机构所关注的最具开发潜力的药物作用靶点，目前以 GPCRs 为靶点的药 物几乎占市场销售药物的 4 成以上[9-12]。图 1.1 G 蛋白偶联受体在调节细胞生理功能中的多样性。各种配体和外来刺激诸如生物胺、 氨基酸、离子、脂类、蛋白质和多肽等通过与 GPCRs 结合，并以 G 蛋白依赖或不依赖的方 式激活胞浆和核内的下游信号通路，以此调控细胞的增殖、分化、迁移、凋亡和血管新生等 各类生理活动。1同济大学硕士学位论文 GPR3 基因敲除小鼠的构建1.1.1 G 蛋白偶联受体的结构GPCRs 的肽链结构包括胞外的 N 末端、 7 个 α 螺旋的跨膜结构、 3 个胞外环、 3~4 个胞内环和胞内的 C 末端。 每个跨膜区的肽段通常由 20~27 个疏水性氨基酸 残基组成，这些疏水性氨基酸残基组成的肽段在跨膜区中以 α 螺旋的形式存在； N 末端位于细胞外，有 7~597 个氨基酸残基，其上有 N-糖基化位点；C 末端伸 向细胞内， 有 12~359 个氨基酸残基， 其上有磷酸化位点； 胞内和胞外环各有 5~230 个氨基酸残基， 当 C 末端的半胱氨酸被棕榈酸酰化后会形成第四个胞内环[13, 14]。 序列分析发现， 不同 GPCRs 的 N、 C 末端和胞内、 外环氨基酸序列的差异较大， 而在 7 次跨膜疏水区域处则相对保守。目前人们对于 G 蛋白偶联受体结合配体 之后究竟会发生如何的构象变化还不是很清楚。但是，大家更倾向于认为 G 蛋 白偶联受体有一个在激活和非激活状态之间的平衡状态， 所以配体的结合就是把 平衡态往激活或者非激活的方向引导而已。所以，GPCR 的配体又可以被分为三 大类：让受体平衡状态朝着激活方向移动的激动剂；让受体朝着非激活状态方向 移动的反兴奋剂；和不影响平衡的中性拮抗剂。图 1.2 G 蛋白偶联受体的初级结构模式图。G 蛋白偶联受体镶嵌在双层脂膜中，从胞外到胞 内依次包括 N 末端、3 个胞外环（E1-3） 、7 次螺旋跨膜区、3~4 个胞内环（I1-4）和 C 末端。1.1.2 G 蛋白偶联受体的空间结构由于 GPCRs 是跨膜蛋白，因此不易得到晶体，难以用 X 射线、NMR 等方 法检测其三维结构。自从首个 GPCR（牛 Rhodopsin）被分离并解析出初级结构 后的十多年里[15-17]， 关于 GPCRs 空间结构的研究一直进展缓慢。 直到 2000 年，2第一章引言K.Palczewski 等解析出了第一个 GPCR（牛 Rhodopsin）的精细结构，分辨率达 2.8 A，进一步证实了 GPCRs 是 7 次螺旋跨膜结构的预测[18]。2007 年第一个人 β2 肾上腺素受体（β2AR）的精细空间结构又被成功解析出来[19]，该空间结构显 示 β2AR 可能以二聚体的形式存在，两个单体之间以胆固醇和棕榈酸相连并一起 镶嵌于双层脂膜中， 同时 β2AR 的扩散性配体 carazolol 也被发现与受体结合在一 起（图 1.3） 。随着新型蛋白重组表达方法的建立以及新型去垢剂、膜蛋白纯化和 结晶技术的发展，迄今为止已经有超过 75 种结构包含 18 个不同 GPCRs 的晶体 结构被解析出来，为进一步解析更多的 GPCRs 精细结构以及个性化的药物研发 和治疗奠定了基础[20]。1.1.3 G 蛋白偶联受体的分类GPCRs 按序列和结构的相似性主要分为 A、B、C 三大家族，各自所占总体 的比例分别为 89 %、 7 %和 4 %[21] （图 1.4） 。 A 类家族拥有的 GPCRs 数量最多， 也被称为视紫红质/β 2 肾上腺素受体样 GPCRs，主要的配体有气味分子、神经 肽类和激素以及多巴胺和 5-羟色胺等重要的神经递质。A 类 GPCRs 的一级结构 有以下特征：N 末端氨基酸残基数较少；在 7 次螺旋跨膜区处有多个高度保守的 氨基酸残基；第 1 和第 2 个胞外环之间以二硫键相连；C 末端有棕榈酰化的半胱 氨酸，可形成第四个胞内环。 B 类家族又被称为胰高血糖素样 GPCRs，重要的配体有胰高血糖素、分泌 素和甲状旁腺等激素。它们的一级结构有以下特征：N 末端较长，可达到 100 多 个氨基酸残基，其中含有几个半胱氨酸形成的二硫键网格结构；7 次螺旋跨膜区 的保守氨基酸残基与 A 类 GPCRs 不同；C 末端缺失棕榈酰化。 C 类家族又被称为促代谢型神经递质样 GPCRs，它们的一级结构有以下特 征：N 末端和 C 末端均较长；除了在第一和第二胞外环之间有二硫键外，与其 他两类 GPCRs 没有序列和结构上的相似性； 第三个胞内环很短且高度保守[22]。 此外，按系统和种系发生 GPCRs 可被分为 5 个亚家族，分别是：谷氨酸盐 受体类、视紫红质受体类、粘附受体类、fizzled/taste2 受体类和分泌素类[23]。3同济大学硕士学位论文 GPR3 基因敲除小鼠的构建图 1.3 G 蛋白偶联受体家族的分类和结构模式图。A 类的 7 次螺旋跨膜区呈倾斜和扭结状 （titled and kinked） ，红色圆圈代表 A 类 GPCRs 的保守氨基酸残基；B 类的特点是胞外较长 的 N 末端，并含有大量保守的半胱氨酸形成的二硫键网格结构；C 类拥有较长的 N 末端和 C 末端，但其 7 次螺旋跨膜结构的排序和方向仍未可知。4第一章引言1.2 G 蛋白偶联受体 3 的概述G 蛋白偶联受体 3（G protein-coupled receptor 3，GPR3）是 GPCRs A 类大 家族中的一员，具有典型的 7 次跨膜螺旋结构域，属于视紫红质样受体亚家族。 在小鼠上的研究已经发现，GPR3 能够通过 Gs 蛋白介导的信号通路调控神经系 统发育[24, 25]和卵母细胞的减数分裂阻滞[26]。 小鼠 GPR3 基因由两个外显子和一个内含子组成， 第一个外显子仅含 5’非编 码区，第二个外显子则包含了 3’非编码区和整个编码区。GPR3 基因在进化过程 中高度保守，氨基酸序列对比分析发现，小鼠、猪以及短尾猊与人类 GPR3 的同 源性分别为 93%、95%和 83%。GPR3 蛋白大小约为 35.4 kDa，它的氨基酸含有 一个 N 连接的糖基化位点（N-linked glycosylation site） ，羧基端有数量不定的磷 酸化位点，在第二胞内环和第三跨膜区的交界处含有保守的 DRY（AspCArgC Tyr） 基序[27]。 这些修饰位点对于 GPCR 蛋白的结构和功能具有很重要的作用。1.2.1 GPR3 的组织分布前人已经对 GPR3 的组织分布做了详细的研究。首先，利用 RT-PCR 和 Northern 技术发现 GPR3 基因在小鼠的睾丸中低水平表达，在神经系统中大量表 达，而在其他部位（肺、肾、肠心、肝、脾）未见表达[27]。Eggerickx 等[28]利 用核糖核酸酶测定法（RNase protection assays） 同样的检测了小鼠 GPR3 的 mRNA 的组织分布情况，发现其仅在脑中大量表达，而在睾丸、卵巢和眼睛低 水平表达，但在胃、肠、心、肝、脾、肺、附睾、精囊、淋巴、大动脉、肾上腺、 胸腺、骨髓、脂肪和皮肤中未见表达，这一发现与 Saeki 等的结果一致。近年 来， Mehlmann 等[26]人也利用了原位杂交技术研究了 GPR3 mRNA 在小鼠卵 巢组织中的分布情况，他们发现 GPR3 主要表达于卵母细胞，表达量约是卵泡 体细胞的 14 倍左右。前不久，Tanaka [29]等人利用 Real-time PCR 技术在小鼠组 织中检测 GPR3 mRNA 表达量时发现，它不仅在脑组织和睾丸中大量表达外， 而且在心脏、肾脏和骨骼肌中亦有少量的表达。1.2.2 GPR3 的配体GPR3 具有较高的组成性活性。过表达 GPR3 受体能在不添加任何配体的情 况下显著提高多种细胞内的 cAMP 水平。已有研究发现，hGPR3 转染 HEK293 细胞后，添加 S1P 及 DHS1P 能够使 GPR3 进一步的激活，并且 S1P 还能够诱导5同济大学硕士学位论文 GPR3 基因敲除小鼠的构建GPR3 亚家族成员 Gpr6 的内化，这一发现表明 S1P 及其代谢产物可能是 GPR3 受体的潜在配体[31]。Hinckley 等[32]人利用 EST 数据库搜索、GV 期卵母细胞 mRNAs 微列阵分析、 和 RT-PCR 扩增 3 种独立的策略研究发现， GPR3、 EDG3、 Gpr12 这三者的表达密切相关，并且鞘氨醇及其代谢产物被鉴定为其潜在配体。 将小鼠的卵母细胞在 GPR3/12 潜在配体 SPC 和 S1P 中孵育，可以延迟卵母细胞 的自发成熟。另外，在体外培养小鼠卵母细胞过程中，添加 100 或 500 nmol/L 的 S1P 有利于卵母细胞的成熟、受精及受精卵的形成。1.3 GPR3 的功能1.3.1 GPR3 促进神经突的生长近几年科学家研究发现，GPR3 可以使小鼠小脑颗粒神经元的 cAMP 水平提 高，并且促进神经突的生长[33]。在神经元传递信号转导的过程中，神经突发挥 了十分重要的作用，但是目前科学家对神经突出的研究还不够深入，只是发现神 经突须具备一定浓度的 cAMP 才能维持生长， 仍然不清楚其中的调控机制。 GPR3 在大鼠小脑颗粒神经元中一直保持着高表达，前人已经发现利用 siRNA 减少细 胞内源性的 GPR3 能够抑制神经突的生长；但如果转入外源 GPR3，被抑制的神 经突又会恢复生长[33]。此外，在神经元中表达 Gpr12（GPR3 亚家族的成员） ， 可以通过降低髓磷脂对神经突生长的抑制，从而起到促进神经突生长的作用[33]。1.3.2 GPR3 调节β淀粉样肽的产生??淀粉样蛋白（A?）假说是关于阿尔茨海默症发病原因最主要的假说，该假 说认为，在阿尔茨海默症发病的过程中，淀粉样蛋白斑块的主要成分 Aβ 起着决 定性作用。Aβ 是 I 型跨膜蛋白淀粉样蛋白前体蛋白 APP 经过?-分泌酶和γ 分泌 酶顺序剪切后的产物。一项 2009 年的高通量基因组功能研究证明[24]，GPR3 能 够调剂 A??的生成，他们发现这一受体的过表达都能增强γ 分泌酶的组装，从而 导致 A??的积累，但若通过遗传学手段敲除 GPR3 受体，AD 模型小鼠的海马体 内 A??就会降低。 值得关注的是， GPR3 受体对 A??产生过程的调节不会影响 Notch 的剪切，这也暗示，GPR3 不仅通过组装 A??分泌酶复合体来发挥调节作用，还 可能通过其他方式影响 A??的产生。6第一章引言1.3.3 GPR3 抑制小脑颗粒细胞的增殖在出生后的啮齿类动物小脑发育过程中，GPR3 起到抑制小脑颗粒细胞增殖 的作用[34]。研究发现，在大鼠的小脑颗粒神经元中，表达外源性的 GPR3 能够 局部对抗 Shh（Sonic hedgehog，刺猬蛋白）增殖作用，而利用 RNAi 敲减 GPR3 后，则加强了 Shh 诱导的 CGP（Cartilage glycoprotein，软骨糖蛋白）的增殖。 此外，p27/kip1 是调节颗粒细胞前体增殖的另一重要因子。它在发育的小脑中大 量表达，可以促进 CGPs 退出细胞周期，对抗 Shh 的增殖作用[35]。在 CGPs 中 表达外源性的 GPR3 能够增加 p27/kip 的表达， 而敲减 GPR3 则降低了 p27/kip 的 表达量。这更加证明了 GPR3 具有抑制小脑颗粒细胞增殖的作用。1.3.4 GPR3 调控小鼠的情绪样行为情绪行为主要由位于大脑缰部、海马、杏仁核、皮质及边缘系统中的情绪中 枢控制，cAMP 信号通路的改变会导致情绪行为的紊乱[36]。GPR3 能够调节神 经细胞内的 cAMP 水平，并且在大脑的缰部、海马和皮质部大量表达[37]。而这 些部位恰恰与应激行为紧密相关，通过行为分析可以发现，在无应激状态下， GPR3 的缺失没有影响小鼠正常的运动和协调能力；但在应激条件下，GPR3 缺 失使小鼠表现出情绪异常。它们不仅抵触陌生环境，情绪焦虑不安，并且攻击性 增强[38]； 另一方面， 野生型小鼠则更耐受应激条件， 还能主动回避不良的环境。 由此可见，GPR3 缺失的小鼠应对外界刺激的能力下降，情绪易波动。情绪反应 往往受到下丘脑-垂体-肾上腺轴激素 （如皮质酮） 和单胺类神经递质传递的影响。 此外，最新研究发现[39]，GPR3 的信号通路还参与了可卡因早期的成瘾过程。1.3.5 GPR3 参与调节神经性疼痛及吗啡诱导的抗痛作用。神经性疼痛是指由中枢或外周神经系统原发性病变或功能障碍引起的疼痛 综合征，可由外伤或疾病导致的神经或周围组织损伤而引发。周围神经损伤通常 能够改变神经胶质细胞和星形细胞的形态， 增加 CD11b、 Iba1 和 GFAP 等小神经 胶质标记基因的表达， 并且激活神经小胶质细胞产生并释放一系列的致痛因子作 用于神经元传递疼痛。研究表明，GPR3 能够调节外周神经损伤导致的神经性疼 痛。与野生型小鼠相比，GPR3 缺失小鼠在外周神经受到损伤后，表现出对温热 刺激的过敏反应，并对吗啡抗痛作用的反应性降低，但是没有影响其对机械性异 常疼痛的反应以及坐骨神经损伤引起的脊髓炎症反应[25]。当小鼠脊髓背侧角的7同济大学硕士学位论文 GPR3 基因敲除小鼠的构建神经结扎后，GPR3 缺失和野生型小鼠的小神经胶质细胞和星形细胞的形态并未 呈现明显不同，说明其疼痛的传递可能通过其他的途径进行。1.3.6 GPR3 在卵泡发育及卵母细胞成熟中的作用近几年，研究人员对 GPR3 及其介导的信号通路进行了大量基础性研究，发 现 GPR3 对卵母细胞成熟及减数分裂前期阻滞极其重要。研究人员发现，在 CHO-K1、COS-7、NIH3T3 等细胞系中，AC 能被转染 GPR3 的表达载体持续激 活，而细胞内的 cAMP 水平也能被其提高[28]。之后，Mehlmann 等人[40]研究发 现，在卵母细胞中，维持其减数分裂阻滞的关键因子是 Gs 蛋白。而通过小鼠卵 母细胞中 Gi 和 Gq 家族抑制性对比实验，发现 Gi 和 Gq 都无法引发 GVBD，这 更加证明了在小鼠卵母细胞中，Gs 活性对其维持减数分裂前期阻滞必不可少。 在脱离卵泡的长足的卵母细胞中加入磷酸二酯酶的抑制剂次黄嘌呤， 依然能保持 其减数分裂的阻滞，说明如果防止分离的卵母细胞中 cAMP 自身水解，Gs 的活 性足以使 cAMP 维持在保持减数分裂阻滞状态的水平。然而，Gs 具有很少的持 续活性， 要想维持这种活性， 需要在卵母细胞膜上存在持续激活 Gs 的 GPCRs[26]。 这一受体须具备持续的组成活性， 或者能够被周围卵泡体细胞产生的配体所激活。 研究人员通过对 EST 数据库进行筛选， 在卵母细胞中发现了 15 条 EST 序列， 其 中就包括 GPR3。 而这一受体最为引发关注， 它能提高细胞内的 cAMP 水平[28]， 研究人员据此推测其与 Gs 蛋白偶联，维持卵母细胞减数分裂的阻滞。图 1.4 维持排卵前卵泡中卵母细胞减数分裂的前期阻滞模式图8第一章引言1.3.7 GPR3 在疾病治疗中的潜在作用随着疾病分子机制研究的深入发展，人类发现了越来越多的药物筛选靶标。 目前研究最成功也最大的一类蛋白质药物靶点是 GPCRs，近五成的药物通过它 来发挥作用。药物靶点筛选与 GPCRs 的功能密切相关， GPR3 因其特殊的表达 模式以及对神经和卵巢发育的重要作用， 被列为治疗神经及生殖系统有关疾病的 潜在靶标。研究发现，GPR3 具有调节神经元中β 淀粉样肽产生和淀粉样蛋白斑 形成的作用[24]，脑组织中 GPR3 的积累是产生阿尔茨海默病的主要原因？。另 外，它还能调节外周神经损伤导致的神经性疼痛和吗啡诱导的抗痛作用[25]。因 此可以推断，GPR3 能够作为治疗阿尔茨海默病及神经性疼痛的潜在药物靶标。 还有研究发现，GPR3 的不足导致了小鼠卵巢早衰，并丧失了生殖力[41]，这从 另外一方面为卵巢早衰机理研究及其治疗药物的筛选提供了可资借鉴的动物模 型。1.4 TALEN 的概述继锌指核酸酶（ zinc-fingernuclease ， ZFN ）技术之后， TAL 效应核酸酶 （transcriptionactivator-likeeffectornuclease， TALEN） 是另一种能够对动植物细胞 基因组进行高度特异和高效定点修饰的新兴技术， 备受众多科学家青睐。 TALEN 技术是根据从植物病原体黄单胞菌（Xanthomonas）中发现的一种转录激活子样 效应因子（transcriptionactivator-likeeffectors，TALE）发展而来的新型的靶向基 因操作技术。TALEN 技术不仅具备了 ZFN 技术特异结合目标 DNA 特异性的优 点，同时也消除了它的某些缺点。与传统方法相比，TALEN 技术具有很高的打 靶效率，一般在 60%左右，甚至更高，大大减少了构建基因敲除动物模型的工作 量[42]；另外，它还具有无基因序列、细胞、物种限制等多种优点，实验设计简 单准确、实验周期短、成本低等等。目前，TALEN 技术已经在大鼠、小鼠、猪、 斑马鱼、水稻、拟南芥及酵母等[43-46]多类物种中得到成功应用。1.4.1 TAL 效应核酸酶（TALEN）的结构TALEN 的组成部分包括中央 DNA 结合域、 N 端分泌信号、 还有 1 个核定位 信号和 C 端 FokI 内切酶的切割区域。 其中最为重要的便是 FokI 的切割域和类似 转录激活物作用的 DNA 特异性识别序列[47]。9同济大学硕士学位论文 GPR3 基因敲除小鼠的构建1.4.1.1 TALEN 的识别结构域TALE 是一种在植物病原菌黄单胞菌属 Xan-thomonas 中发现的菌体蛋白。 1992 年就有研究表明，该类病原微生物可以通过 T3S（typeIIIsecretionsystem） 将 TALE 蛋白传送到植物中， 通过调节细胞特定基因转录使得病原体在植物体中 增殖和扩散并产生毒害作用[48]。更有研究发现，TALE 是一类较为保守的细菌 蛋白，能够识别并能结合特异的 DNA 序列，使得病原菌在感染的过程中通过模 拟宿主基因转录实现对植物基因转录的控制。TALE 蛋白的中间区域是 DNA 特 异结合域（DNA-bindi ngdomain） ，其上下游都有部分信号位点，包括 N-端的 typeIII 传送系统的位点 （translo-cation） ， C-端的定位信号位点 （nuclearlocatization， NLS） 、转录激活信号位点（transcriptionalactivation，AD）等。在天然的 TALE 中，DNA 特异结合域大多数是由串联的重复片段（repeats）组成，每个重复的 片段由 33~35 个氨基酸构成，最后一个重复片段一般大约只有 20 个氨基酸，所 以也被称作半重复片段（half-repeat） 。天然 TALE 一般含有 1.5 到 33.5 个重复片 段，其中每个片段负责一个 DNA 的碱基。研究人员还发现，决定这种特异识别 的是这些片段中的第 12~13 位氨基酸， 也被称为 RVD （repeatvariabledi-residue） 。 RVD 与 DNA 基本处于一一对应的保守稳定关系。 为了能够使 TALE 有效的利用， 科学家首先要定位每个碱基对应的保守的 RVD。早在在 2009 年，就已有两个研 究团队发布了相关报道，首次比较完善地阐释了碱基与 RVD 的关系。如同氨基 酸与密码子的关系， 一些 RVD 更喜欢识别特异性的碱基对， 而另一些的 RVD 则 可以识别多个碱基对，比如 NG 识别胸腺嘧啶、IG 识别胸腺嘧啶、HD 识别胞嘧 啶、NN 识别腺嘌呤、NI 识别腺嘌呤和鸟嘌呤等等[49]。1.4.1.2 TALEN 的切割核酸酶FokI 切割结构域来源于一种限制性内切酶 FokI，这种酶含有两个功能域， N-端的 DNA 结合结构域可以特异识别 GGATG 序列， 然后再用其另一端的 DNA 切割结构域在其结合位点下游的 DNA 链上 9bp 到 13bp 处进行切割，形成一个 长 4bp 的 5′黏性末端。 FokI 的切割活性依赖于它切割结构域的二聚化。 1996 年， 研究者们首次将 FokI 的 C-端切割结构域融和 ZFP 蛋白融合，成了为 ZFN，因此 成功实现了人们对任意位置双链 DNA 的精确切割。而对于 FokI 的切割结构域， 已经有很多科学家对它进行了修饰，来达打增提高特异性、强切割效率和减少毒 性等目的。由于天然的 FokI 只要形成二聚体以后就具有活性，这会导致自身二 聚化后的非特异性切割。为了解决这一问题，科学家们将 FokI 进行了突变，从 而让其只有在形成异源二聚体时才有活性。如今科学家利用两个 TALEN 单体识10第一章引言别 TALEN 靶位点的上下游，只有当这两个 TALEN 都同自身的识别位点精确匹 配后 FokI 才能形成二聚体，这样就保证了切割的精确性。1.4.2 TALEN 的工作原理TALEN 重复单元对不同碱基识别的特异性是由其序列中的第 12 位和第 13 位氨基酸残基决定的，这 2 个氨基酸残基被叫做重复序列可变的双氨基酸残基 （repeatvariabledi-residues，RVD） ，如图（1.5） 。DNA 的特异性识别与 TALEN 重复单元间遵循着一个规则：一个 RVD 对应一个核苷酸。目前的研究已经在黄 单胞菌属中分离出来了至少 20 种 RVD，其中与核苷酸“A” “T” “G” “C”对应 的 NI、NG、NN、HD 是最常见的。正是因为这种特点，人们可以通过自己的需 要随意组装 TALEN 重复单元，从而达到基因定点切割的效果。图 1.5 Talen 定点打靶 DNA 的模型TALEN 的超螺旋重复单元结构域与 DNA 双链的大沟紧密缠绕， 以一个重复 单元连接一个核苷酸的方式与 DNA 序列依次对齐，同时 TALEN 的 N 端到 C 端 与目标 DNA 的 5’末端到 3’末端的方向相对应。构建的 TALEN 即保留着天然的 TALEN 识别特异性双链 DNA 的功能，同时还保留着 FokI 切割结构域的能力从 而在体内或体外环境造成非特异性 DNA 断裂的能力。FokI 切割结构域要高效地 造成 DNA 双链断裂需要形成二聚体，因此需要两个 TALEN 单体。作为一组功 能对，一分子 TALEN 单体连接到一条链上的一个靶位点（也被称为重复单元连 接成分， EBE） ， 同时另一分子 TALEN 单体或异质二聚体连接到临近互补链的靶 位点（EBE）上；两个 TALEN 靶点 EBE 之间由一段适当长度的间隔序列隔开，11同济大学硕士学位论文 GPR3 基因敲除小鼠的构建其长度由连接 FokI 结构域的 TALEN 的 C 端长度所决定，一般在 10-31bp。这样 就能让两个 FokI 结构域相互接近，从而形成二聚体以便最终能切断双链。 DNA 双链断裂会诱发 DNA 修复机制， 从而实现目的基因的特异性修饰。 如 图（1.6）理论上，细胞内 DNA 双链断裂能被下列方式中的一种修复，一种方式 是非同源末端连接（Non-homologousEndJoini ng，NHEJ） ，另一种方式是同源重 组（HomologousRecombination，HR） 。NHEJ 在细胞周期的各个时相（Phase） 均可被采用， 而对处于 G1 时相的细胞而言， NHEJ 是目前仅见的一种 DNA 双链 断裂修复的手段；NHEJ 是在不依赖 DNA 同源性的条件下真核生物细胞为了避 免 D 染色体或者 DNA 断裂（Breaks）造成的影响，避免因此而导致的对生命力 的影响或者 DNA 的降解，强制性的将两个 DNA 断链连接在一起。这通常将导 致 DNA 断裂位点的突变，最常见的突变形式为移码突变，从而导致基因功能的 改变[51]。图 1.6 在基因工程应用上 TALENs 通过 DSBs 介导基因组修饰1.4.3 TALEN 的应用自 2009 年破译 TALE 的秘密以来， TALEN 技术已经应用到人、 植物、 酵母、 斑马鱼、大、小鼠等各种模式生物中。而在未来，TALEN 技术最具有应用价值 的领域非基因治疗莫属。结合目前干细胞领域最新的研究成果，比如先诱导出患 者自身的 iPS 细胞，再利用 TALEN 技术对含有缺陷的基因进行打靶修饰，最后 把改造正常的细胞再次打入患者挺爱，从而可以治愈很多疾病。除此之外，在大12第一章引言动物的转基因方面，通过 TALEN 技术再配合同源重组，可以实现目的基因的敲 入，这也会加快动物乳腺反应器等各领域的研究速度。 利用 TALEN 技术来达到基因组定点修饰的目的需要以下步骤:首先要选定 基因序列，通过生物信息学软件或着人工寻找适合 TALEN 结合的靶位点，然后 在体外组装与其相对应的 TALEN 打靶载体。其次，将构建好的 TALEN 打靶载 体转入培养细胞或者生物题中进行基因组定点修饰。最后，应该分子克隆的手段 检验修饰结果和 TALEN 脱靶情况、筛选突变体等。1.4.4 基于细胞的基因修饰目前 TALEN 技术针对人基因组的操作大部分都只能在体外培养的细胞上进 行，Sun 等人为了找到最有效的 TALEN，利用酵母菌双杂交系统，筛选出了最 优化的 TALEN-AvrXa10 N 末端和 C 末端组合，随后根据这一组合，设计出识别 人镰状细胞病中 HBB 基因的位点的 TALEN。与之前的研究相比较，Sun 等人设 计的 TALEN 能更有效地结合到 HBB 基因位点进行切割，切割后的序列发生同 源重组的能力要比经典的方法高出 1000 多倍，并且没有检测到细胞毒性。他们 的研究说明，改造后的 TALEN 可以是用于基因治疗的强有力工具。此外， Bultmann 等人研究了， TALEN 在人 iPS 和胚胎干细胞上是否如 ZFN 一样有效进 行了检测，他们挑选了 5 个内源性基因，结果发现 TALEN 是可以达到 ZFNs 的 精确程度；Sun 等人还通过改造 TALE 蛋白的 C 端和 N 端氨基酸数目，优化了 TALEN 的效果，并且一对一地比较了 TALEN 与 ZFNs 在人细胞中对内源基因 CCR5 和 NTF3 的敲除效果，发现在效率相同的情况下，TALEN 要比 ZFNs 产生 的细胞毒性小很多[52]。1.5 条件性基因敲除条件性基因敲除（ConditionalKnockout，CKO）指的是在小鼠某些特定类型 的组织或细胞类群， 或小鼠发育的某一特定阶段对某个基因的修饰限制的一种特 殊的基因敲除方法[1-2]。它的设计利用了 Flipe/Frt 或 Cre/LoxP 原理，它们都属于 位点特异性重组酶系统。以 Cre/Loxp 系统为例（图 1.7） ，它是在待敲除的一段 目标 DNA 序列的两端各放置一个 loxP 序列，得到 flox（flankedbyloxP）小鼠。 将带有细胞特异性表达 Cre 的小鼠与 flox 小鼠杂交， 以获得在特定组织里对靶向 基因进行敲除掉的小鼠，这种小鼠便是条件性基因敲除小鼠。此外，若和控制 Cre 表达的其他诱导系统相结合， 还可以对某一基因同时实现时空两方面的调控。13同济大学硕士学位论文 GPR3 基因敲除小鼠的构建Cre/loxP 系统最先在噬菌体中发现，可以使有位点特异性的 DNA 重组。 Cre/LoxP 系统具有两个组成部分：一个是一段长 34bp 的 DNA 序列（简称 LoxP 序列） ，其中含有两个 13bp 长的反向重复序列和一个 8bp 长的核心序列。中间这 8 个碱基决定决定了 LoxP 的方向。这段序列是 Cre 重组酶的识别位点。这套系 统中另一个组成部分是 Cre 重组酶。 它是由噬菌体编码的一种由 343 个氨基酸组 成的蛋白。Cre 可以介导两个 LoxP 位点的重组，从而引起两个 LoxP 之间 DNA 序列的缺失。 如果将 Cre 重组酶 cDNA 通过基因工程的手段置于组织或细胞特异 性启动子之下， 可以得到 Cre 组织/细胞特异性表达的 Cre 小鼠， 也叫 Cre 工具小 鼠。跟 Flox 小鼠交配之后，可以得到条件性基因敲除小鼠。图 1.7 Cre-Loxp 系统原理但是目前条件性基因敲除小鼠的构建方法还存在诸多不足之处， 如操作步骤 多，效率偏低，实验耗时长等特点都使其在应用上具有很多局限性。因此，科学 家们一直在寻找一种可高效且方便地编辑任何基因序列的实验手段。而近几年， 随着 TALEN 技术的逐步成熟，使简单快捷地编译任意基因序列这一愿景成为可 能。1.6 本研究的目的及小结随着疾病分子机制研究的不断深入， 越来越多的药物筛选靶标被人类所发掘。 GPCRs 是目前研究最成功也是最大的一类蛋白质药靶，近一半左右的药物通过 它来发挥作用。药物靶标的筛选和 GPCRs 的功能密不可分，由于 GPR3 特殊的14第一章引言表达模式和对神经及卵巢发育的重要作用， 将其列为治疗神经和生殖系统相关疾 病的潜在靶标。目前研究已经发现，GPR3 能够调节神经元中β 淀粉样肽的产生 和淀粉样蛋白斑的形成，其在脑组织中的积累是导致阿尔茨海默病的主要原因。 此外，它还能够调节外周神经损伤导致的神经性疼痛及吗啡诱导的抗痛作用。基 于此，建立一个 GPR3 基因敲除的小鼠模型对实验者来说会带来很多的方便。 TALEN 打靶技术是近两年来一项新兴的基因编辑技术，以其便捷的组装方式、 较高的切割效率、较低的毒性引起人们广泛的关注，并且也在斑马鱼，小鼠等模 式生物中已获得了成功的应用。 因此我们通过生物信息学技术分析 GPR3 基因的 功能区域和编码序列，选取了最大外显子作为打靶序列，设计了多组 TALEN 打 靶载体。在体外用 GFP-Reporter 和 Luciferase SSA 两种方法检测各组 TALEN 的 打靶效率。利用原核注射技术向小鼠受精卵中注射了 TALEN mRNA，来获得 GPR3 基因敲除小鼠，并通过与野生型杂交的方法验证了这种基因敲除的生殖传 递性。 另外，为了实现对 GPR3 基因在发育不同阶段和机体不同组织的精确控制， 为了更全面地描述 GPR3 基因功能，我们还尝试了构建可以条件性基因敲除的 GPR3 小鼠。我们在细胞水平上进行了试验，制作了用于条件性敲除的同源重组 供体。综上所述，我们的研究不仅为进一步探索卵巢早衰和阿尔兹海默病发病机 理、 筛选治疗阿尔兹海默病的药物提供了良好的动物模型。 也首次为利用 TALEN 技术条件性敲除目标基因打下了基础。15同济大学硕士学位论文 GPR3 基因敲除小鼠的构建第 2 章 材料与方法2.1 材料与仪器2.1.1 质粒? pcDNA3.0，pEGFP-N1 质粒由中科院生物化学与细胞研究所提供。 ? GPR3-TALEN-L、GPR3-TALEN-R（左右臂质粒）及 d-pLucSSA Reporter 质粒；? 条件性打靶骨架载体 Donor 质粒购自北京唯尚立德生物科技有限公司。2.1.2 细胞株及培养条件? HEK293 细胞购自美国模式菌种收集中心（ATCC） ，培养基为加 100 mg/L 青霉素和 100 mg/L 链霉素含 10% FBS 的高糖 DMEM。? 小鼠胚胎干细胞（mouse embryonic stem cell，mESC，C57BL/6 背景）由本实验室提供，培养基的主要成分如下： DMEM 10%FBS 100×MEM NEAA 100×GlutaMAXTM-I 100×Penicillin/Streptomycin β-巯基乙醇 5%CO2 的 37° C 细胞培养箱。 500 ml 57 ml 5.7 ml 5.7 ml 2.9 ml 1.04 ml使用前充分摇匀，分装使用，尽可能避免污染。所有细胞均培养于含有2.1.3 实验动物及饲养条件实验小鼠品系为 C57BL/6，18-22 g，无特定病原菌，购自中国科学院上海实 验动物中心，动物合格证书号：SCXK（沪）。 小鼠饲养于同济大学实验动物中心 SPF （Specific-Pathogen-Free） 级环境中， 室温全年维持在 24± 2° C，湿度 40-60%，光照周期为 12h（光照起止时间为： 9:00-21:00）。小鼠给予充足的食料和洁净饮用水，有足够的自由活动空间。刚16第二章材料与方法从动物中心购买的小鼠，需在操作饲养间饲养至少 7 天，待小鼠完全适应生活环 境后方可用于后续实验操作。2.1.4 实验仪器? Forma Series II CO2 培养箱美国 Thermo 公司 ? BSCIIA2 超净工作台上海上净净化设备有限公司 ? 超低温冰箱美国 Thermo 公司 ? Olympus IX71 倒置荧光显微镜日本 Olympus 公司 ? 酶标仪 Flexstation3 美国 Molecular devices 公司 ? 高速台式冷冻离心机德国 Eppendorf 公司 ? 分光光度计美国 Thermo 公司 ? 超纯水仪上海菲特科学器材有限公司 ? 涡旋振荡器英国 BioCotestuart 公司 ? CO2 细胞培养箱美国 Thermo 公司 ? 微波炉青岛海尔集团公司 ? 核酸电泳仪美国 Amershambiosciences 公司 ? PCR 仪德国 Eppendorf 公司 ? 凝胶成像仪上海 Tanon 公司 ? 振荡培养箱上海知楚仪器有限公司 ? 通风橱上海正申金属制品有限公司 ? 数显恒温水浴锅上海精宏实验设备有限公司 ? p97 型拉针仪德国 Sutter 公司 ? 原核注射仪德国 Eppendorf 公司 ? 立式压力蒸汽灭菌锅上海博迅实业有限公司2.1.5 主要试剂及配方? 鼠尾裂解液的配制（1000 ml 裂解液成分）尿素 EDTA-2Na-2H2O Sarkosyl（十二烷基肌酸钠） Tris/HCl（1M，PH8.0） NaCl ddH2O 定容至 1000 ml，室温保存174 M（240.24 g） 10 mM（3.722 g） 0.5%（5 g） 0.1 M（100 ml） 0.2 M（11.688 g）同济大学硕士学位论文 GPR3 基因敲除小鼠的构建裂解液成 Na2EDTA? 2H2O 主要起着螯合 Mg2+，降低 DNAase 活性的作用； Sarkosyl 可以破坏细胞膜蛋白和核蛋白，从而释放 DNA；Tris/HCl 起着调节溶液 pH 的功效。? 50×TAE 电泳缓冲液（pH8.5）称取 242 g Tris、37.2g Na2EDTA? 2H2O 于 1L 烧杯中，然后把约 800 ml 的去 离子水加入烧杯中，充分搅拌溶解，接着加入 57.1 ml 的乙酸，充分搅拌，最后 用去离子水将溶液定容至 lL 后，室温保存。? TFB1 缓冲液分别称取 RbCl 12.1 g、MnCl2? 2H2O 8.1 g、CaCl2? 2H2O 1.47 g、乙酸钾 2.94 g 于烧杯中用双蒸水溶解，接着加入甘油 150 g，混匀后，倒入 1L 容量瓶中，用双 蒸水定容至 1 L，用乙酸将 pH 调至 5.8，过滤除菌后，常温保存。? TFB2 缓冲液分别称取 MOPS 0.418 g、RbCl 0.242 g、CaCl2? 2H2O 2.2 g 于烧杯中用双蒸水 溶解，接着加入甘油 150 g，混匀后，用双蒸水定容至 200 ml，用 1MNaOH 将 pH 调至 7.0，过滤除菌后，常温保存。? X-Gal（5-溴-4-氢-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）溶液（20 mg/ml）向 50 ml 离心管中加入 lgX-Gal 和 40 ml DMF （二甲基甲酰胺） ， 充分混合溶 解后，定容至 50 ml。小份分装（1 ml/份）后，-20° C 避光保存。? IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）溶液（24 mg/ml）向 50 ml 离心管中加入 1.2 g IPTG 和 40 ml 灭菌水，充分混合溶解后，定容 至 50 ml，用 0.22 ?m 过滤膜过滤除菌，小份分装（1 ml/份）后，-20° C 保存。? 10×PBS 溶液（1L）NaC KC Na2HPO4 KH2PO4 存。l80 g l2 g 14.4 g 2.4 g先用 800 ml 去离子水充分溶解，调 pH 值到 7.4，然后定容至 1 L，室温保18第二章材料与方法? 原核注射缓冲液先用 DEPC 水制备 10 mM Tris， 0.1mM EDTA， 1M HCl 调整溶液 PH 至 7.4， 然后再用 0.22 μM 滤器过滤一下，4° C 或 20° C 储存。2.2 实验方法2.2.1 分子克隆实验操作 2.2.1.1 鼠尾基因组 DNA 的抽提1)小鼠出生后 4 周龄左右，剪取大约 0.5 cm 的鼠尾尖端，每管中加入 0.5 ml 鼠尾裂解液和 5 μl PK 酶（20 mg/ml）置于 50°C 恒温金属浴中振荡约两小 时至鼠尾完全裂解。2)每管加入 700 μl 的酚氯仿漩涡混匀， 于 4°C 离心机中以 9000 rpm 的转速离 心 15 min。 小心取上清 300 μl 至新的 EP 管中，加入 450 μl 异丙醇颠倒混匀，直至看 到白色絮状沉淀产生，再次于 4°C，9000 rpm 离心 15 min。 弃上清，然后加入 500 μl70%乙醇洗涤沉淀 DNA，后放入 4°C 离心机中 13200 rpm 离心 5 min。 充分弃上清， 敞口干燥 2 min 后加入 50 μl ddH2O （超纯去离子水） ， 于 50°C 溶解 5 min 或 4°C 过夜溶解 DNA。3)4)5)2.2.1.2 感受态菌（DH5α）的制备-RbCl 法1)从 37°C 培养 16-20 h 的大肠杆菌平板上挑取一单菌落，接种于 5 ml LB 液 体培养中，37°C 振荡培养 12 h 左右，直至对数生长期。在 100 ml 新制的 LB 液体培养基中加入 1 ml 该菌悬液，37°C 振荡扩大培养。当培养液开始 出现混浊后，每 20-25 min 测一次 OD600nm，直至 OD600nm 在 0.2-0.35 时停止培养。2)迅速将培养液转入无菌离心管中，在冰上冷却 2 min，于 4°C，2500g 离心 15 min。 弃去上清培养液， 用 30 ml 冰冷的 TfB1 缓冲液轻轻悬浮细胞， 冰浴 45 min， 于 4°C，2500 g 离心 15 min。 弃去上清液， 用 3 ml 冰冷的 TfB2 缓冲液轻轻悬浮细胞， 冰浴 15 min。 0-4°C，193)4)同济大学硕士学位论文 GPR3 基因敲除小鼠的构建5000 rpm 离心 10 min。5)分装感受态细胞悬液到预冷的 Eppendorf 离心管中，每管分装 50 μl，液氮 速冻后，置于-80 ℃条件下保存。2.2.1.3 质粒的转化? LB 液体培养基的配制（1L）胰蛋白胨（Tyrptone） 酵母菌提取液（YeastExtract） NaCl10 g 5g 10 g分别称取上述试剂加入到 1 L 的蓝盖试剂瓶中，加入约 800 ml 的超纯去离 子水充分搅拌溶解，调 PH 值至 7.0 定容至 1 L 高温高压灭菌，注意瓶盖拧松， 灭菌后拧紧瓶盖，4 ° C 保存备用。? 含氨苄青霉素、卡那霉素的 LB 固体培养基的制备分别称取胰蛋白胨 2g、酵母提取物 1 g、NaCl 2 g、琼脂粉 3 g 加入到 500 ml 的蓝盖试剂瓶中，用量筒量取纯水加入到试剂瓶中定容至 200 ml，充分摇匀，高 温高压灭菌后，充分摇匀后放在 50° C 的恒温水浴槽内，在超净台内准备好细菌 培养皿并在培养皿上做好黑色（氨苄青霉素）或红色（卡那霉素）标记，保留塑 料包装袋，在冷却到 50° C 的 LB 琼脂中加入 200 μl 的氨苄青霉素（100 mg/ml） 或卡那霉素（40 mg/ml）后混合均匀，在迅速在做好标记的细菌培养皿中铺制平 板（10 ml 培养基/60 mm 培养皿） ，平板凝固后装入塑料袋中，4° C 冷库内避光 保存。? 转化操作具体流程1) 从要转化的质粒中每管取 1-2 μl 到新的 1.5 ml 离心管中，置于冰上。 2) 从-80° C 冰箱中取出感受态大肠杆菌，立即置于冰上，待大肠杆菌复苏（溶 化即可） ，此过程大约 30 min。 3) 将每管 50 μl 感受态大肠杆菌加入各自 1 μl 的质粒中，小心将其混匀，放在 冰上 30 min。 4) 将各管 1.5 ml 离心管插入浮标中， 提前水浴锅 42 ° C， 然后将其放入水浴锅， 立刻计时 90 s。 5) 小心取出离心管，然后插入冰上 3-5 min，过程中最好不要晃动它。 6) 在通风橱中，每个离心管加入 450 μl 不含氨苄抗生素的 LB 液体培养基。 7) 将各管离心管插入摇床中， T=37° C （一定要等机器降温至该温度） ， 750 rpm，20第二章材料与方法t=60 min。 8) 从每个离心管中取出 30 μl 菌夜滴入 6 cm 规格的氨苄青霉素（100 mg/ml） 或卡那霉素（40 mg/ml）板中。 9) 先在 37° C 培养箱中正放置 20 min， 让其干燥， 然后 37 ° C 倒置培养 12-16 h， 观察有无菌落生成。 10) 若有菌落，暂时不进行下一步实验，则可将培养皿用封口膜封住，4 ° C 保存 备用。2.2.1.4 质粒的提取? 摇菌阶段1) 用 15 ml 离心管加入 3-4 ml 的 LB 液体培养基。 2) 按 1:1000 比例加入氨苄青霉素（100 mg/ml）或卡那霉素（40 mg/ml） 。 3) 挑单一菌落放入离心管中，然后开始摇菌，280 rpm，t=12-16h。? 质粒提取流程（AxyPrep 质粒 DNA 小量试剂盒）1) 取 1-4 ml 在 LB 培养基中培养过夜的菌液（若使用丰富培养基，菌液体积应 减半或更少） ，12000 g 离心 1 min，弃尽上清。 2) 用 250 μl 已加入 RNaseA 的 BufferS1 （第一次使用时， 将试剂盒携带的 RNaseA 全部加入到 BufferS1 中， 混合均匀， 4° C 保存） 悬浮细菌沉淀， 悬浮需均匀， 不应留有小的菌块。 3) 加入 250 μl BufferS2，温和并充分地上下翻转混合 4-6 次均匀使菌体充分裂 解，直至形成透亮的溶液。此步骤不宜超过 5 min。 4) 加入 350 μl BufferS3， 温和并充分地上下翻转混合 6-8 次， 12000 g 离心 10 min。 5) 吸取步骤 4 中的离心上清并转移到 DNA 制备管 （置于 2 ml 离心管中） ， 12000 g 离心 1 min。 6) 将制备管置回离心管，加 500 μl Buffer W1，12000g 离心 1 min，弃滤液。 7) 将制备管置回离心管，加 700 μl Buffer W2，12000g 离心 1 min，弃滤液；以 同样的方法再用 700 μl Buffer W2 洗涤一次，再弃滤液（确认在 BufferW2 中 已按试剂瓶上的指定体积加入无水乙醇） 。 8) 将制备管置回 2 ml 离心管中，12000g 离心 1 min。 9) 将制备管移入新的 1.5 ml 离心管（试剂盒提供）中，在 DNA 制备膜正中央 加 60-80 μl 超纯水 （事先加热至 65° C） ， 室温静置 1 min， 12000g 离心 1 min。21同济大学硕士学位论文 GPR3 基因敲除小鼠的构建2.2.1.5 琼脂糖凝胶中 DNA 片段的回收纯化琼脂糖凝胶电泳后，需将产物回收纯化，以便后续实验。本实验采用的是北 京艾德莱琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒。 1) 在长波紫外灯下，用干净刀片将所需回收的 DNA 条带切下，尽量切除不含 DNA 的凝胶，得到凝胶体积越小越好。 2) 将切下的含有 DNA 条带凝胶放入 1.5 ml 离心管，称重。先称一个空 1.5 ml 离心管重量， 然后放入凝胶块后再称一次， 两次重量相减， 得到凝胶的重量。 3) 加 3 倍体积溶胶液 DD。如果凝胶重为 100 mg，其体积可视为 100 μl，则加 入 300 μl 溶胶液。 4) 56° C 水浴放置 10 min（或直至胶完全溶解） ，每 2-3 min 涡旋震荡一次帮助 加速溶解。 5) 将上一步所得溶液加入吸附柱 EC 中 （吸附柱放入收集管中） ， 室温放置 1 min， 12000 rpm 离心 30-60s，倒掉收集管中的废液。 6) 加入 700 μl 漂洗液 WB，12000 rpm 离心 30s，弃掉废液。 7) 加入 500 μl 漂洗液 WB，12000 rpm 离心 30s，弃掉废液。 8) 将吸附柱 EC 放回空收集管中，12000 rpm 离心 2 min，尽量除去漂洗液，以 免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。 9) 取出吸附柱 EC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加 50 μl 洗 脱缓冲 EB（洗脱缓冲液事先在 65-70° C 水浴中加热效果更好） ，室温放置 2 min，12000 rpm 离心 1 min。 Taq 酶及 KOD-plus-PCR 扩增体系：? Taq 酶反应体系（20μl） ：10× PCRBuffer（含 mg2+） 10 mM dNTP Primer1（10 μM） Primer2（10 μM） DNA Template Taq Enzyme dd H2O? PCR 反应程序设置：2 μl 0.4 μl 0.5 μl 0.5 μl 1 μl 0.2 μl 15.4 μl94 ° C 预变性5 min22第二章材料与方法94 ° C 变性 65 ° C 退火 72 ° C 延伸30 s 60 s以上变性，退火，延伸重复 30 个循环。最后在 72° C 保持 5 min，使产物延 伸完整，10 ° C 保存。? KOD-Plus-PCR 反应体系（20 μl） ：10× PCR Buffer（含 mg2+） 10 mM dNTP Primer1（10 μM） Primer2（10 μM） DNATemplate mgSO4 KOD-PlusddH2O? PCR 反应程序设置：2 μl 2 μl 0.5 μl 0.5 μl 1 μl 0.8 μl 0.5 μl 12.7 μl94 ° C 预变性 94 ° C 变性 65 ° C 退火 68 ° C 延伸5 min 30 s 60 s以上变性，退火，延伸重复 30 个循环。最后在 68 ° C 保持 5 min，使产物延 伸完整，10 ° C 保存。2.2.1.6 PCR 产物的 TA 克隆及蓝白斑筛选? PCR 产物的 TA 克隆为了能够保证较高的连接效率，根据 TA 克隆试剂盒说明书（Invitrogen）要 求，用于 TA 克隆的 PCR 产物最好是当天所得的，否则 PCR 产物 3’末端的 A 碱基会被降解从而降低连接效率。这样能保证较高的连接效率。具体实验步骤如 下： 1) 将装有 pCR?2.1 载体的离心管离心，收集离心管底部的所有液体。 2) 根据插入 PCR 产物的片段大小以及 DNA 与 pCR?2.1 载体摩尔比值在 3:1 左右的要求计算出需要加入 PCR 产物的体积。必要的时候可用超纯水稀释 PCR 样品。23同济大学硕士学位论文 GPR3 基因敲除小鼠的构建3) 10μl 连接反应体系按照上述计算的用量分别加入超纯水、10× T4 连接酶缓冲 液、pCR?2.1 载体、PCR 产物和 T4 连接酶 4) 在 14 ° C（温度过高或过低都会降低连接效率）下至少连接 4 h，最好过夜。 在转化反应开始之前，可以将连接产物储存于-20 ° C。? 蓝白斑筛选1) 将上述连接产物的离心管轻轻离心，然后将其置于冰上。 2) 从-80° C 冰箱中取出感受态大肠杆菌，立即置于冰上，待大肠杆菌复苏（溶 化即可） ，此过程大约 30 min。 3) 将每管 50 μl 感受态大肠杆菌各自加入 2 μl 的连接产物，小心将其混匀，放 在冰上 30 min。将剩余的连接产物储存于-20° C 冰箱。 4) 提前将水浴锅设置为 42° C， 把各管 1.5 ml 离心管插入浮标中， 然后将其放入 水浴锅，立刻计时 90s。 5) 取出离心管，小心插入冰上 3-5 min，过程中最好不要晃动它。 6) 在生物安全柜中，每个离心管加入 250 μl 不含氨苄青霉素素的 LB 培养基， LB 培养基应事先从冷库中取出，使其恢复至室温再使用。 7) 将各管离心管插入摇床中， 摇床温度设置为 37° C （一定要等机器降温至该温 度） ，转速为 225 rpm/ min，时间为 60 min。 8) 分别取 20 μl 的 40 mM IPTG 溶液和 40 mg/ml X-Gal 溶液混合后均匀涂布于 6 cm lB 平板中，该 LB 平板卡那霉素的浓度为 50 ?g/ml，将平板静置 1 h。待 涂抹的 IPTG 溶液和 X-Gal 溶液干后， 从每个离心管中取出 20 μl 左右菌夜滴 涂板。涂板时，可以选择两种不同的菌液体积，以确保至少有一个平板的克 隆生长良好。 9) 涂板后先在 37 ° C 培养箱中正放置 30 min 左右， 而后 37 ° C 倒置培养 16-18 h， 观察有无蓝白斑菌落生成。2.2.1.7 InversePCR 法定点突变InversePCR 法是以环状 DNA（如质粒）为模板，以反方向设计的两条引物 对质粒进行完整的 PCR。这样，通过引物设计导入突变或插入序列，或者在目 标缺失序列两侧开始设计引物，从而在 PCR 产物上产生碱基突变或插入/删除序 列，然后将 PCR 产物自身连接，转化后产生突变后的质粒。本实验采用的是 KOD-Plus-MutagenesisKit（东洋纺） 。? InversePCR24第二章材料与方法将引物都稀释到 10 mM，模板质粒 DNA 浓度调整至 50 ng/ul。按以下配比 配制 PCR 反应液（50 μl 体系） ： 灭菌蒸馏水 10× BufferforiPCR 2mM dNTPs 引物 1（10 mM） 引物 2（10 mM） PlasmidDNA（50 ng/ul） KOD-Plus然后按以下条件进行 PCR： 94° C 98° C 68° C 4° C 2 min 10 s X min Hold 35 μl 5 μl 5 μl 1.5 μl 1.5 μl 1 μl 1 μl其中延伸时间可按 1 min/kb 来设定，循环数 X 可按 1 循环/kb 来设定。? 用 DpnI 酶对模板质粒 DNA 进行消化PCR 反应结束后， 在 PCR 反应液 （总量 50 μl） 中加入 2 μl DpnI， 轻轻混匀。 如果 PCR 是分成 2 份做的，每管各加 1 μl DpnI。然后用枪吹匀，37° C 反应 1 h。 DpnI 反应结束后， 可取 5 μl 消化液进行琼脂糖凝胶电泳， 以确认 PCR 产物。? PCR 产物自身环化取出 T4PolynucleotideKinase 和 Ligationhigh， 冰浴融解。 融解后， 将 Ligation high 轻轻搅拌均匀。取一个新的 PCR 管，如下配制反应液（15μl） ： DpnI 处理后 PCR 产物 灭菌蒸馏水 Ligationhigh T4PolynucleotideKinase 2 μl 7 μl 5 μl 1 μl混匀后，16 ° C 反应 1 h。取部分反应液转化大肠杆菌，挑取 4-8 个菌落，小 抽质粒，用内切酶处理后电泳，根据酶切图片确认是否突变。然后对必要片段测 序以确定序列。2.2.1.8 mRNA 的体外转录TALEN 打靶构建基因敲除小鼠时，一般采用 TALENmRNA 原核注射。本设25同济大学硕士学位论文 GPR3 基因敲除小鼠的构建计 采 用 的 是 mMESSAGEmMACHINE?SP6Kit （ Ambion ） 。实验中全部用 RNase-free 级离心管及枪头，所配试剂用 DEPC 水配制。? TALEN 质粒对的 NotI 线性化酶切体系（50 μl） ： 10× Buffer（ora nge） TALEN-L or R plasmid NotIEnzyme ddH2O 补充到 5 μl 4 μg 4 μl 50 μl枪吹打混匀， 离心机快速离心下， 然后用封口膜封住， 置于 37° C 水浴过夜。? 等体积酚氯仿抽提除去上述线性化过程等中一些残留的蛋白质。 1) 上述 50 μl 酶切反应体系用 ddH2O 补充到 200 μl，扩大反应体系。 2) 加入等体积 200 μl 酚氯仿，轻轻颠倒混匀，4 ° C 14000 rpm 离心 15 min。 3) 小心取上清液至新的 EP 管中，然后加入 1/10 体积的 3 M NaAc 及 2× 体积的 无水乙醇。 4) 轻轻颠倒 EP 管混匀七八次， 不要太长时间， 防止 DNA 断裂， 然后置于-20° C 孵育 4 h 左右。 5) 4 ° C 14000 rpm 离心 15 min，弃上清；加入 300 μl 70%乙醇，4 ° C 14000 rpm 离心 5 min。 6) 充分弃上清， 最后一点用枪头吸走， 敞口干燥 5 min， 后加 10 μl 左右 ddH2O， 确保线性化的 DNA 回收终浓度维持在 0.5 μg/μl 左右，以便后面转录反应的 进行。? 线性化 TALEN 质粒对体外转录成 m Gcapped mRNA71) RNA Polymerase Enzyme Mix（甘油溶解）置于冰上，10× Reaction Buffer 和 2× NTP/CAP（NTP/CAP 中的 CAP 是帽状类似物 m7G5'ppp5'G，与 4 种 NTP 混合在单一溶液内）冰上溶解，也可用涡旋振荡器加速溶解，另在最终反应 体系加入试剂时， 10× Reaction Buffer 必须要提前置于室温下，不然冷的 10× Reaction Buffer 会使线性化的模板质粒 DNA 沉淀下来。所有试剂溶解打 开前，都要离心下，以防管壁污染试剂。 2) 转录反应 20 μl 体系（37 ° C） ，也可以缩小或扩大体系（10 μl 或 40 μl 等） ， 室温下依次加入下列试剂：26第二章材料与方法Nuclease-free Water 补充到 2× NTP/CAP 10× ReactionBuffer 线性化 TALEN 质粒 SP6 Enzyme Mix 进行。20 μl 10 μl 2 μl 1 μg 2 μl3) 轻轻弹离心管，或是用枪轻轻地打吹匀，低速离心几十秒，确保反应在底部 4) 封口膜包好管口， 37 ° C 孵育 2 h 左右或 4-6 h， 甚至过夜， 这样可以提高 mRNA 的产生量。 5) 转录反应完全后再加入 1 μl TURBODNase，混匀，37 ° C 孵育 15 min，主要 是除去残余的线性化模板质粒，得到纯净单一的 m7GcappedmRNA，以便用 于后续小鼠受精卵的原核注射。? LiCl 法沉淀回收 TALENmRNA使用该法，最好保证 mRNA 浓度控制在 0.1 μg/μl 以上，mRNA＞300nt。本 实验设计索使用的 TALEN mRNA 都在 3000 nt 左右，所以可以使用该法，主要 步骤有下： 1) 上述反应中加入 30 μl Nuclease-freeWater 和 30 μl LiCl 溶液。 2) 充分混匀，-20° C 沉淀 30 min 左右。 3) 4° C 顶速离心 15 min，弃上清。 4) 加入 1 ml 冰冷的 70%乙醇洗涤 1-2 次，除去游离的 NTP/CAP，4° C 最大转 速再次离心 10 min；充分弃上清，注意管底的白色沉淀，晾干。注意干燥时 间不能太长，否则 mRNA 不好回溶。 5) 溶于 20-30 μl Nuclease-freeWater 中， nanodrop 定量。 一般最后可以产生 15-25 μg，-80° C 储存。若 mRNA 产量太低，则要寻找其中的原因。2.2.2 细胞实验操作 2.2.2.1 mES 细胞的冻存、复苏及传代培养? mES 细胞的冻存冻存液组分为 90%的 FBS 和 10%的 DMSO，实验操作流程如下： 1) 当 mES 细胞克隆数扩增到 80%左右时，吸弃培养液上清。 2) 1× PBS（不含钙镁）冲洗两遍。27同济大学硕士学位论文 GPR3 基因敲除小鼠的构建3) 加入 0.5-1 ml 的胰酶（0.25%）-EDTA（0.02%）溶液至培养皿内，左右轻轻 晃动，使胰酶覆盖整个培养皿底，充分消化细胞。 4) 在显微镜下观察，直到细胞层全部脱落（一般需要 2-5 min） 。 5) 加入适量含血清的培养液终止消化。多次轻轻吹打细胞，制成单细胞悬液。 6) 1000 rpm，离心 5 min。弃上清，逐滴加入已经预冷的冻存液并不断摇动混 匀。 7) 分装到冻存管中，标记。 8) 将冻存管置于冻存盒中，-80° C 过夜，然后转入液氮。? mES 细胞的复苏细胞被冻存在 10%的二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，从而损害细 胞。二甲基亚砜对细胞有一定的毒性，快速的进行细胞复苏是至关重要的。具体 步骤有下： 1) 操作前把培养液在 37 ° C 水浴中温热。 2) 从液氮中取出一支冻存管 mES 细胞，放入 37 ° C 水浴中晃动，直到只剩下小 冰晶。 3) 吸取冻存管内的细胞悬液加至有少量培养液的 15 ml 离心管中，1000 rpm 离 心 5 min。 4) 吸弃上清液，加入 4-6 ml 培养液，吹打悬浮。 5) 重复吹打，制成单细胞悬液，尽量避免气泡。然后转移到已经铺好滋养层细 胞的培养皿中培养，并每天换液。? mES 细胞的传代培养，一般在复苏后第 2-3 天传代，视克隆的大小和密度而定。主要实验过程如下： 1) 吸弃废液。 2) 1× PBS（不含钙镁）冲洗两遍。 3) 加入 0.5-1 ml 的胰酶（0.25%）-EDTA（0.02%）溶液至培养皿内，左右轻轻 晃动，使胰酶覆盖整个培养皿底。37° C 孵育 5 min，充分消化细胞。 4) 在显微镜下观察，直到细胞层全部脱落（一般需要 2-5 min） 。 5) 加入适量含血清的培养液使胰酶失活，终止消化。多次轻轻吹打细胞，制成 单细胞悬液。 6) 将细胞转入离心管内，300 g，离心 5 min。 7) 去除上清，加入 1-2 ml 培养液将细胞重悬，至少吹打 10 次。如重悬加入培 养基的量较少会比较容易将细胞团吹散分开。mES 细胞有聚集成团的倾向，28第二章材料与方法传代过程中仔细将细胞弄散分开很重要。这样可能会减少细胞的自然分化。 8) 将 mES 细胞按照 1:10 比例种在已经铺好滋养层细胞的组织培养皿中，前后 左右轻轻摇晃几下，使细胞均匀分布在皿内。放入培养箱中，每天换液。2.2.2.2 mES 细胞的 Lipo2000 脂质体转染1) mES 细胞培养在 6 孔板中， 当细胞达到 90%密度的融合时，按照上述传代方 法，将细胞接种到 6 孔板，每孔 2 ml 培养液，细胞密度为 5× 105/孔。 2) 同时，开始提取准备 Lipo2000（Invitrogen）转染所需的一系列材料。 3) 按照 200 μl 转染体系/孔，DNA:Lipo.5 的使用比例，分别配制好溶 液 A 即包含 100 μl 的 opti-MEM 培养基，定量 DNA；溶液 B 即包含 100 μl 的 opti-MEM 培养基，定量的 Lipo2000 转染试剂。 4) 将溶液 A 与溶液 B 充分混合，室温静置 20 min。 5) 与此同时，将 6 孔板中的 mES 细胞用无血清的培养基冲洗两遍后，分别加 入 2 ml 的含有血清的新鲜培养基。 6) 将溶液 A 与溶液 B 的混合液逐滴加入到各孔中，然后摇动培养板，轻轻混 匀。在 37° C 培养箱中培养 12 h。 7) 弃去上清，换上新鲜的培养基。继续培养，检测相关生理生化指标。2.2.2.3 LuciferaseSSA 法检测 TALEN 活性TALEN 的 LuciferaseSSA 法体外活性检测实验主要步骤： 1) 将 293 细胞铺与 24 孔板中，每孔铺 20W 细胞。 2) 将 TALEN-L （100 ng） 、 TALEN-R （100 ng） 、 pLucSSAReporter 质粒 （50 ng） 和 RenillaLuciferase 质粒（10 ng）用 Lipo2000 脂质体转染法共转到 24 孔板 的 293 细胞中，每个实验重复三组。对照组不加 TALEN 用其他质粒对补齐 DNA 总量。 3) 转染 24 h 后，裂解细胞，使用双荧光素酶报告基因检测系统试剂盒和酶标仪 检测各组 Luciferase 表达水平，并计算出 Luciferasefirefly/renilla 的比值。2.2.2.4 GFP-Reporter 法检测 TALEN 活性TALEN 的 GFP-Reporter 法体外活性检测实验主要步骤： 1) 将 293 细胞铺与 24 孔板中，每孔铺 20W 细胞。 2) 将 TALEN-L（100 ng） 、TALEN-R（100 ng）和构建好的 GFP-Reporter 质粒 （50 ng）用 Lipo2000 脂质体转染法共转到 24 孔板的 293 细胞中，每个实验29同济大学硕士学位论文 GPR3 基因敲除小鼠的构建重复三组。对照组不加 TALEN 用其他质粒对补齐 DNA 总量。 3) 转染 48h 后，在荧光显微镜下观察拍照，再用胰蛋白酶消化后用流式细胞仪 检测 GFP 阳性细胞比率。2.3 数据统计分析本研究中的数据均以均数±标准误差（ Mean ± SEM ）表示，最后采用 GraphPadPrism5.0 软件作图进行数据统计分析。30第三章结果第三章 结果3.1 Talen 打靶载体的构建已知 GPR3 基因（基因 ID：14748，图 3.1）在体内具有两个外显子，外显 子 1 和外显子 2（Genebank 收录号：NM_008154） 。但是 GPR3 基因的编码区在 外显子 2 上，因此我们将打靶位点设计在了第二个外显子上。图 3.1 GPR3 基因位置图为了能保证打靶的效率，我们设计了三对不同位点的 TALEN 打靶载体（图 3.2） ， 分别两两间隔 29bp 和 51bp。 对于打靶序列的选择， 我们采用了如下原则： 1） 打靶载体的识别序列前面一个碱基为 T； 2） 打靶载体识别序列长度为 15-18bp， 由于模块 NN 对 G 碱基的识别特异性较差，因此序列中尽可能避免 G 碱基的出 现频率；3）TALEN 打靶载体左右臂之间的间隔序列为 14-18bp。 打靶载体的组装交由唯尚立德公司完成，最终得到了测序验证正确的载体。图 3.2 GPR3-TALEN 打靶序列示意图31同济大学硕士学位论文 GPR3 基因敲除小鼠的构建3.2 Talen 打靶载体体外活性的验证我们采用了 GFP-Reporter 和 Luciferase-Reporter 两种方法，在体外比较了这 三组 TALEN 打靶载体的切割效率。3.2.1 GFP-Reporter 检测 TALEN 活性GFP-Reproter 的原理为（如图 3.3） ：一个终止子在 eGFP 的编码区中央（红 色标记） ，eGFP 没有活性。为检测 TALEN 剪切活性，将一个 TALEN 的靶点位 置序列插在终止子后。在 TALEN 的作用下，靶点位置产生双链 DNA 断裂 （DoubleStrandBreak，DSB） ，细胞通过同源重组方式修复 DNA，形成一个有活 性的 eGFP。通过检测 eGFP 的荧光表达反应 TALEN 剪切的活性水平。图 3.3 GFP-Reporter 的原理图。GFP-Reporter 检测结果显示，3 组 TALEN 打靶载体都具有切割活性，其中 GPR3-TALEN-2 效率最高， GFP 阳性比率达到了 19.2% ； GPR3-TALEN-1 和 GPR3-TALEN-3 效率较低，GFP 阳性比率分别为 4.2%和 3.1%；未转入 TALEN 的对照组 GFP 阳性比基本接近于 0，与预期相符（图 3.4 B、C） 。32第三章结果图 3.4 GFP-Reporter 体外验证 3 组 TALEN 切割效率。图 A 为 GFP-Reporter 的酶切构建， 其中 G-vector 代表被双酶切过的 GFP-Reporter 空载质粒。1、2、3、分别代表体外合成的带 酶切位点的 GPR3-TALEN-1、 GPR3-TALEN-2、 GPR3-TALEN-3 识别序列。 图 B 为 3 组 TALEN 与其 GFP-Reporter 在 293 细胞上转染 48 小时后的 GFP 荧光图。 图 C 为流式细胞仪检测 GFP 阳性信号比例统计图。3.2.2 Luciferase-Reporter 检测 TALEN 活性为了更进一步确定 3 组 TALEN 打靶载体活性的高低，也为了找出一种合适 的 TALEN 效率检测方法为以后的实验提供便利， 我们还通过 Luciferase-Reporter 来比较了这 3 组 GPR3-TALEN 的活性。 和 GFP-Reporter 的原理一样， Luciferase-Reporter 中一个终止子在 luciferase 的编码区中央，luciferase 没有活性。为检测 TALEN 剪切活性，将一个 TALEN 的靶点位置序列插在终止子后。在 TALEN 的作用下，靶点位置产生 DSB，细胞 通过同源重组方式修复 DNA，形成一个有活性的 luciferase。通过与参照的比值 变化反应 TALEN 剪切的活性水平。33同济大学硕士学位论文 GPR3 基因敲除小鼠的构建图 3.5 GFP-Reporter 体外验证 3 组 TALEN 切割效率。图 A 为 GFP-Reporter 的酶切构建， 其中 G-vector 代表被双酶切过的 GFP-Reporter 空载质粒。1、2、3、分别代表体外合成的 GPR3-TALEN-1、GPR3-TALEN-2、GPR3-TALEN-3 的识别序列。图 B 为转染 48 小时候用 酶标仪检测 Luciferase 酶活性。Luciferase-Reporter 检测结果显示，3 组 TALEN 打靶载体都具有切割活性， 其中 GPR3-TALEN-2 效率最高， 与对照组相比， Luciferasefirefly/renilla 的比值高 达 72.3；GPR3-TALEN-1 和 GPR3-TALEN-3 效率稍低，这一比值分别为 7.6 和 6.5（图 3.5 B、C） 。 结果表明， GFP-reporter 检测和 Luciferase-Reporter 检测的结论基本相同， 都 表明 3 组 TALEN 全部能成功的切割目的序列， 并且 GPR3-TALEN-2 的活性要显 著高于其他两组。因此，我们选用了活性最高的 GPR3-TALEN-2 进行后续的实 验。并且由于 GFP-Reporter 操作相对简单，结果更为直观的特点，我们选用这 种方法来检测以后实验中所构建 TALEN 的体外活性。3.3 打靶载体的体外转录及原核注射我们通过 NotI 酶切位点对 GPR3-TALEN-2 进行了线性化（图 3.6） ，以便通 过体外转录试剂盒获得具有 5'帽子和 3'polyA 尾巴的成熟 TALEN mRNA。图 3.6 打靶载体体外线性化34第三章结果我们选取了实验室常用的 C57 小鼠作为注射品系， 将新转录的 GPR3-TALEN mRNA 通过原核注射的方式打入小鼠受精卵中，右侧持卵针固定合子，左侧注 射针注满融有 mRNA 的注射液， 注射至核明显膨胀 （50―100%） 后退出注射针， 注射时 GPR3-TALEN mRNA 的浓度均为 10 ng/ul[44]。注射后再将受精卵移植回 假孕母鼠体内。注射两周后，小鼠出生（图 3.7） 。图 3.7 打靶载体原核注射及出生小鼠3.4 Knockout 小鼠的鉴定出生后的小鼠，剪脚趾进行编号，并提取基因组 DNA。为了检验 Knockout 是否发生，我们在 GPR3 基因前后 350bp 设计了一对引物，然后将 PCR 产物用 限制性内切酶 XcmI 酶切。 因为 GPR3-TALEN-2 的切割位点也同时是 XcmI 的酶 切位点，所以如果同源染色体的 DNA 链均未发生 NHEJ，则该序列可以被 XcmI 酶切成 350bp 的两条带；如果两条同源染色体都发生均发生 NHEJ，且修复后引 入碱基突变，则 XcmI 的酶切位点将不复存在，PCR 产物将不会被切割；如果只 有一条染色体发生 NHEJ， 且修复后引入碱基突变， 则会同时出现 350bp 和 700bp 两条带（图 3.8） 。 在移植的受精卵中共有 20 只小鼠出生，经鉴定发生 NHEJ，且修复后引入 碱基突变的小鼠有 5 只，比率为 25%。其中只在一条链上发生突变的有 4 只，在 两条链上都有突变的有 1 只。我们通过 TA 克隆及基因测序明确了发生突变的这 些突变小鼠相应 DNA 片段的序列，结果表明这些由 TALEN 引起的 NHEJ 都导 致移码突变，从而导致表达蛋白的终止。其中两条同源染色体都发生突变的小鼠 中，一条 DNA 链缺失了 2 个碱基，另一条链缺失了 14 个碱基（图 3.9） 。35}