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高二生物基因表达的调控 人教版
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分子遗传学笔记
分子遗传学绪论 核酸的发现:作为遗传物质所应具备的条件：1 多样性：贮存并表达多种遗传信息 2连续性： 准确传递后代 3稳定性： 物理、 化学性质稳定 4 多变性：有遗传变化的能力 一、 DNA作为遗传物质的证据 肺炎球菌的转化 试验 病毒侵染大肠杆菌试验 真核细胞的基因 转化 转化：某一基因型的细胞从周围介质中吸收来 自另一基因型的细胞的DNA而使它的基因型和 表型发生相应变化的现象。 二、DNA的一级结构 核酸的化学组成：核酸是以核苷酸为基本结构 单位，通过3‘, 5‘-磷酸二酯键形成的链状多聚 体。 核苷酸(Nucleotide)：核苷(Nucleoside)， 含氮碱基，戊糖；磷酸基团 三、DNA的二级结构 1、DNA 双螺旋模型的诞生： Watson & Crick 建立双螺旋模型，其特征是： 主链：右手双螺旋，脱氧核糖和 P 为骨架，位 于外侧，两条主链反向平行螺旋, 直径￠2nm 碱基配对：位于内侧，嘌呤和嘧啶（A-T,G-C） 螺旋参数：任一条链绕轴一周的升降的距离。 3.4nm，10 对苷酸，相邻碱基 0.34nm。 大沟和小沟： 骨架双链在螺旋轴上的间距不等， 在 DNA 表面形成宽窄不等的大小沟。大沟宽 2.2nm，是蛋白质识别 DNA 双螺旋结构上的特 定信息位点。小沟宽 1.2nm。 3、旋稳定的因素决定双螺： 1、氢键：结构的稳定性与 G+C 的含量成正比， G-C&A-T. 2 、碱基堆积力：嘌呤和嘧啶具疏水性 ,产生疏 水区而与介质分开,使碱基与水的接触为最小。 3、其他：带负电荷的磷酸基与介质中的阳离子 形成离子键 , 可有效地屏蔽磷酸基间的静电斥 力。 四、DNA 物理结构的不均一性 1. 反向重复序列(Inveerted repeats)又称为回文 序列（palindrome）,能形成发夹结构或十字形 结构2. 富含A+T的序列 3. 嘌呤和嘧啶的排列 顺序 碱基组成相同，但排列不同，双螺旋的稳 定性有差别5‘GC&5‘CG ， 和碱基堆积力有关， 碱基堆聚力是嘌呤向嘧啶方向大于嘧啶向嘌呤 方向。 五、DNA 二级结构的多形性 DNA 可以以多种形式的双螺旋结构存在 1、A-DNA 2、B-DNA 3、Z-DNA 4、其他形式 DNA: 三链 DNA，四链 DNA: 六、DNA 的变性与复性 1、基本概念： 下列因素可导致 DNA 变性： 高温 、 酸 、 碱 、 尿素 、甲酰胺 2、DNA 的熔解曲线: 双链 DNA 的 A260=1.00 （ 浓度为 50μ g/ml 时，对波长 260nm 紫外线 的吸收能力） ；单链 DNA 的 A260=1.37； 游离 碱基或核苷酸的 A260=1.60。 解链温度（melting temperature, Tm）或熔点， Tm 是双螺旋失去一半时的温度，即 A260 的升 高达到极大值一半时的温度。是变性温度范围 的中点。Tm 时 DNA，A260=1.185 Tm 值的影响因素： (1) DNA 的均一性: 均一性高，Tm 值的范围小 (2) G-C 含量: G-C 含量高，Tm 值高 (3) 介质中的离子强度 影响变性的因素：(1) 外部条件 (2) 内部条件： GC 含量。马默-多蒂（Marmur-Doty）关系式： Tm = 69.3+0.41(G +C)%，或 GC%=（Tm-69.3） ×2.44 11 DNA 变性后物理性质发生的变化： （1）流体力 学的性质发生改变：粘度下降，而沉降速度增 加； （2）提高了对紫外线的吸收能力，此称为 增色效应（hyperchromicity） 。 3、性反应曲线复－ Cot 曲线: DNA复性时单链消失的速度:C/Co=1/1+KCot C：单链DNA浓度 Co：DNA总浓度 t：时 间/秒，k：=二级反应常数 复性分数C/Co决定于单链起始浓度和保温时间 的乘积（Cot）。定义C/Co=1/2时，Cot值定义 为Cot1/2； 即复性一半时DNA总浓度和时间乘积 1/2=1/1+KCot1/2 1+KCot 1/2=2 k Cot1/2=1总 DNA浓度相同时，不同DNA的Cot1/2 值不同 复性动力学公式，复性进行一半时C/C0＝ 1/2 ＝1/1+KCot1/2 根据复性动力学公式我们可以知到些什么？ (1) 单链浓度随着时间的增大而减小；片断越 短， Cot1/2 值越小，(2) 反应速率取决于初始 的单链浓度Co；(3) 以反应浓度和COt1/2的对 数为座标可绘复性曲线(4) 通过Cot1/2值可测 原核生物基因组的大小； (5)不同生物基因组大 小不同，复性曲线也不同；可用以区分真核生 物和原核生物基因组。DNA复杂性越高，复性 越慢， 基因组大复性慢. 基因组的复杂性与其Cot1/2成正比 单一序列和重复序列复性动力学曲线的区别 _ 真核生物的DNA有重复顺序，而原核生物多 为单一顺序。 (1) 单一顺序的复性曲线常只有一 个拐点，而重复顺序常有多个拐点。(2) COt 比 值变化范围。 原核生物的COt比值为100,真核生 物的COt比值大于100 影响复性反应的因素(1) DNA片段的大小： 片断 小复性快，移动碰撞机会多(2) DNA的浓度：高 浓度复性快(3) DNA复杂性： 简单序列复性快 (4) 温度： 过低温度减少互补链的碰撞机会最佳 复性温度一般比Tm低25°C。(5) 盐的浓度： 过低盐浓度使复性后的DNA又变性复性时要求 盐的浓度达到足够高; 在复性反应中如何知道单链已经结合成双链了 呢？可以通过哪些方法来检测？ (1) 减色效应（hpochromic effect）测定光密度， 即OD值（opticaldensity），DNA从单链变成双 链，OD260减少30%(2) 羟基磷灰石柱层析，羟 基磷灰石对双链DNA吸附较牢，不易吸附单链 而使其通过 七、分子杂交 1．特点是：(1)都是应用复性动力学原理；(2) 都必须有探针（probe）的存在。 2．探针就是用同位素或非同位素如荧光染料， 生物素等标记的短片段特异DNA或RNA序列。 3．杂交：不同来源的单链核酸经碱基互补配对 而形成的双螺旋，DNA-DNA, DNA-RNADNA 杂交可反映不同生物中 DNA 的共同序列和不 同序列，研究生物的进化，核酸杂交是现代分 子生物学的基础 4． 常用的分子杂交方法_ 原位分子杂交 （in situ hybridization）_ 斑点杂交（dot blotting）_ 萨 瑟杂交（ Southern blot）_ 诺瑟杂交（Northern hybridization）_ Western blotting 八、DNA 超螺旋结构和拓扑异构现象 1．生物体中大多数 DNA 是以超螺旋的形成存 在，而缺少超螺旋的 DNA 则为松弛型 DNA 原核生物 DNA，共价封闭环，再经螺旋就成为 超螺旋。真核生物 DNA 为线性，DNA 与蛋白 质结合之间的 DNA 可形成一个小D环‖， 类似共 价封闭环，从而螺旋成为超螺旋 2．正超螺旋：和 DNA 内部双螺旋缠绕方向相 同的方向缠绕形成的超螺旋，结构更加紧密。DNA 每圈初级螺旋的碱基对小于 10.5，则为正 超螺旋 3．负超螺旋：DNA 绕其轴与右手双螺 旋方向相反的方向缠绕所产生的超螺旋，结果 减少每个碱基对的旋转，每圈初级螺旋的碱基 对大于 10.5，则为负超螺旋。超螺旋是耗能过 程，超螺旋的产生可能为能量的储存形式 4．拓扑异构现象 拓扑异构酶Ⅰ 催化 DNA 链断裂和重新连接。 每次只作用于一条单链，无需 ATP，功能是松 弛 DNA， 代表：E.coli 拓扑异构酶Ⅰ，对单链 DNA 的亲和力比双链高，能识别负超螺旋区， 使负超螺旋扩大化而成松弛状，该酶不能松弛 正超螺旋； 真核生物拓扑异构酶Ⅰ可结合 15-19 核苷酸的双链区域 , 其断裂点在此区域中间 . 该 酶倾向于结合超螺旋而不是结合松弛 DNA 区 域,对正负超螺旋都有松弛功能. 拓扑异构酶Ⅱ 大肠杆菌拓 扑异构酶Ⅱ又称 DNA 旋转酶(DNAgyrase)，能催化断裂和连接 双链 DNA， 需能量 ATP 参与， 无碱基序列特异 性， DNA 旋转酶结合到双链闭环分子中在 ATP 的作用下产生负超螺旋。无 ATP 时只能缓慢松 弛负超螺旋而不能松弛正超螺旋。大肠杆菌拓 扑异构酶Ⅱ主要功能是引入负超螺旋以抵消复 制叉移动所产生的正超螺旋，还具有形成或拆 开双链 DNA 环连体的能力。该酶对 DNA 的结 合顺序是正超螺旋&松弛&负超螺旋 5．拓扑异构酶的生物学功能：_ 恢复细胞过程 产生的 DNA 超螺旋，如复制叉前的正超螺旋、 转录时聚合酶前产生的正超螺旋。_ 防止细胞 DNA 过度超螺旋，维持超螺旋的稳定水平。生 物体内 5％负超螺旋，有利于基因的转录、基 因组稳定、促进重组。_ 去连环活性（大肠杆 菌） 、染色体凝缩（真核） 、解开缠绕 DNA 双螺 旋 6． 拓扑异构酶的催化反应本质： 是先切割 DNA 的磷酸二脂键， 改变 DNA 链环数后再连接， 兼 具 DNA 内切酶和 DNA 连接酶的功能，但是它 不能连接事先已经存在的断裂 DNA，是 DNA 复制、重组和转录中必需的酶 九、常见 DNA 分子形式及相互关系 Ⅰ型 DNA：具正、负超螺旋的双链环状 DNA S ＝1.41； Ⅰ‘型 DNA： 无超螺旋的双链环状 DNA， 是松弛型 S=1.14；Ⅱ型 DNA：一条链或两条链 上有一个或几个切口的双链环状 DNA S=1.14； Ⅲ型 DNA： 线形双链 DNA S=1.00； 崩溃 DNA： Ⅰ型或Ⅰ‘型 DNA 变性时，氢键断裂但两条链 无法分离而紧密缠绕的分子 S=3.0 单链环状 DNA： S=1.14 线状单链 DNA： S=1.30 连环状 DNA：两个Ⅰ型 DNA 环连而成。 S&1.41 沉降系数：CsCl 密度梯度离心时的表示单位。 CsCl 本身有梯度，在离心时将不同分子大小的 物质集中到它自身的不同梯度中。在同一种密 度梯度离心条件下，沉降系数大表示易沉淀， 则具有较高的超螺旋。鉴定 DNA 超螺旋的手 段。 第二章染色体、基因组和基因 一、原核生物和真核生物 真核生物：有完整的细胞结构；遗传物质集中 在有核膜包围着的细胞核中与特殊的蛋白质相 结合形成染色体结构 原核生物：没有真正的核结构；遗传物质存在 于整个细胞之中，以裸露的核酸分子存在，不 形成染色体结构，也常被称为染色体 噬菌体和病毒：是一种超分子的亚细胞生命形 式，繁殖必须在寄主体内进行，遗传机制与其 寄主密切相关 二、基因组大小与C值矛盾2 基因组（genome): 一个物种的单倍体的染色体 后H2A和H2B形成异二聚体，结合于四聚体的 的数目 两个侧面，各异二聚体与30-40bp DNA 结合各 C值 （C value） ： 即单倍体基因组的DNA总量。 产生半圈螺旋，最后H1与DNA结合锁住核小体 它是每一种活生物的一个性质。 的进出口。 C值矛盾（C值佯谬，C value paradox）：人们 2．着丝粒（Centromere） 无法用已知功能来解释基因组的DNA含量，所 功能：保证染色体分裂的完整性、连续性、两 以产生了C值矛盾： 与预期的编码蛋白质基因数 极分离性 量相比，基因组DNA含量过多；一些物种间的 结构： 特殊DNA序列， 大多数着丝粒中含110bp 复杂性变化范围并不大，但C值却很大。 的AT富集保守区，在其两侧是高度保守的序列 三、原核生物染色体及其基因 （成分Ⅰ和成分Ⅱ） 一个染色体即一个核酸分子（DNA或RNA）大 特征：着丝粒的DNA特殊，称?-DNA，人类有 多数为双螺旋结构，少数以单链形式存在；大 由171bp重复单元所组成的500kb DNA区段。 多数为环状，少数为线状 不同物种的着丝粒中DNA序列不同，同种生物 E.Coli 基因结构特点：功能上相关的几个结构 不同染色体的着丝粒结构也有差别。 基因前后相连，再加上一个共同的调节基因和 3．粒端（telomere） 一组共同的控制位点即启动子和操作子在基因 线性DNA分子末端特化了的序列，是特殊的二 转录时协同动作（操作元形式）。蛋白质基因 级结构。端粒的DNA由许多短的正向重复序列 通常以单拷贝的形式存在。RNA基因通常是多 组成。5‘端总是在富含C的链上，3‘端则在富含 拷贝的。不同基因的启动子和操作子DNA序列 G的链上。 具有一条单链末端， 总是富含G的链， 不同，实现表达的精细调节 即带有3‘端。端粒DNA单链末端不被核酸外切 结构基因：编码蛋白质的特定DNA序列，常为 酶及单链特异性的内切核酸酶所识别。 单拷贝。 端粒、着丝粒和DNA复制起点构成了染色体的 调节基因： 一类对其它基因的活性进行调节或 不可缺少的三要素。 限制的基因。 五、真核生物基因组序列特征 操纵子(元） ： 功能上相关的几个结构基因相连， 1．真核生物DNA复性动力学 由一个共同的调节基因和一组共同的控制位点 DNA复杂性为最长的没有重复序列的DNA核 即启动子（promoter）和操纵基因（operator， 苷酸对数目。可通过E.coli DNA 作为标准对被 也称操作子）。在基因表达时协调作用。这种 测DNA进行复杂性的计算：X＝ 4.2×106bp× 基因表达调控结构组成一个单元，称为操纵子 样品DNACot1/2(观察可得)/E.coli DNACot1/2 （也称为操纵元，Operon）。调控子：一个调 （已知）真核DNA的复杂性大于原核DNA.从 节基因的产物能同时调控几个非相邻的结构基 Cot曲线可见原核的Cot曲线都呈DS‖形。跨度一 因的表达。 般分布2个数量级，表明原核DNA都是单一序 操纵子的不同结构基因是相邻的。而调控子的 列。真核生物DNA复性跨越7－8个数量级，复 结构基因位于同一染色体的不同部位或不同染 性可分为三个组分，每个组分代表基因组中不 色体。 同复杂性的序列第一相：快复性组分，约占 － － 可读框: DNA中具有潜在编码蛋白质氨基酸的 25％，Cot＝10 4～2×10 2， Cot1/2 =0.0013 核苷酸序列。 中间复性组分， 占30％， Cot＝0.2～100， 编码区：DNA中对应于蛋白质中氨基酸序列的 第二相： Cot1/2 =1.9 核苷酸序列。 慢复性组分， 占45％， Cot＝80～10000， 转录单位：包括转录的启动子及其上游的其它 第三相： Cot1/2 =630 调控区域、基因本身和转录的终止序列。 间隔区： 位于结构基因间不被转录的DNA片段。 Cot: 单链起始浓度和保温时间的乘积 包括一些复制、转录、翻译过程的调控区段。 Cot1/2: 即复性一半时DNA总浓度和时间乘积 2、单一序列、重复序列及卫星DNA 2、噬菌体 根据复性动力学研究结果可将真核DNA分为4 单链环状DNA, 长5,386 bp，共有11个基因， 3个mRNA，翻译11种蛋白质重叠基因和基因内 种： 单一序列：非重复序列 基因。 其基因组是一长48502bp 的双链DNA分子，在 轻度重复序列：在基因组中有2～10个拷贝，组 噬菌体颗粒内，该DNA为一线状双链分子，当 蛋白基因、tRNA基因 进入宿主细胞后，其互补单链粘端通过碱基配 中度重复序列：在基因组中有10～几百个拷贝 一般不编码蛋白质，在基因调控中发挥作用 对而结合，形成环状分子。 高度重复序列：拷贝数几百～几百万，如rRNA 编码基因：必要基因，非必要基因。 基因。 四、真核生物的染色体 原核生物含完全不重复DNA，低等真核大部分 真核生物染色体的化学组成：DNA： 27%,一 条染色体只包含有一个DNA分子；RNA： 6% 为非重复，重复组分不超过30％,基本为中度重 复，高等真核中近一半为中度或高度重复。真 蛋白质：66% （组蛋白和非组蛋白） 核DNA的四种类型并非在每一生物中都存在。 1、染色体的结构等级： 多倍体植物中没有非重复序列。螃蟹基因组中 DNA+组蛋白；核小体(Nucleosome)；染色质 (Chromatin)；染色体(Chromosome)；染色质→ 没有中度重复。 基因组大小和非重复DNA在低等简单的生物中 染色体，被压缩倍 有正比关系。即基因组增加，非重复DNA长度 四级结构: 核小体-螺线体-超螺线体-染色单体 常染色质；异染色质；组成型异染色质：DNA 增加。当基因组大小在3.0×109bp以上时，基 序列不转录,如卫星DNA；兼性异染色质： 雌 因组增加，非重复DNA组分不增加，只是重复 组分增加。 性个体中的一个X染色体染色质(chromatin)： 高度重复序列： 200bpDNA+组蛋白八聚体(H2A, H2B, H3, H4) + H1；核小体：染色体的基本结构单位核小体 切成数百个碱基的片段进行超速离心，会在主 的组装：H3和H4先形成四聚体，一个锁芯样结 要的DNA带的上面有一个次要的DNA带相伴 随。这就是卫星DNA,由长串联重复序列组成。 构，70-80bp DNA缠绕其上形成一圈螺旋，然 2一般对应于染色体上的异染色质区,位于着丝 点区域。 小卫星DNA(minisatellite DNA) ： 由中等大小的串联重复序列组成。位于染色体 末端区域，也可分散存在，一般不转录；有一 个基本的核心序列（GGGCAGGAXC）。 另一类小卫星DNA是端粒DNA，主要有串联重 复单位TTAGGG组成。 微卫星DNA(microsatellite DNA) 重复单位多为二核苷酸，也有少量三核苷酸和 四核苷酸，分散存在于基因组中，可作为基因 的标记。 小卫星DNA和微卫星DNA可用于分子标记 六． 真核生物的基因 1. 割裂基因和重叠基因 基因不连续，即为割裂基因（interrupted gene） 指基因的编码序列在DNA分子上不是连续排列 的， 而是被不编码的序列所隔开 外显子（外元，exon）：编码的序列（对应于 mRNA序列,基因两端起始和结束都是外显子） 。 内含子(内元, intron）：不编码的序列（在成熟 mRNA中消失） 割裂基因的特性： 1、外显子广泛存在于各种生物不同的基因中， 编码蛋白质基因、rRNA、tRNA. 2、 真核生物大多数是割裂基因， 古细菌中少见， 真细菌中没有。 3、外显子排列顺序和其在成熟mRNA中排列顺 序相同 4、 某种割裂基因在所有组织中都具有相同的内 含子成分 5、 内含子通常在所有的可读框中都含有无义密 码子，一般无编码功能 外显子与生物进化： 基因内含子之间的亲缘关系远不如外显子之 间的关系密切，内含子突变后不影响蛋白质的 结构，外显子突变后影响蛋白质结构被自然选 择淘汰， 而表现内含子在进化过程中变化较大、 较快，内含子就避免了选择压力而自由积累。 外显子是保守的，而内含子变化很大，基因长 度的变化主要决定于内含子 某些DNA序列编码一个以上的蛋白 外显子的选择性剪接可产生不同的mRNA，产 生重叠基因。外显子和内含子相对而言存在。 外显子的选择性剪接可产生不同的mRNA，产 生重叠基因。 2. 基因家族和基因簇 基因家族（gene family）:来源相同，结构相似， 功能相关的一组基因,家族成员有序列相关性。 但相关程度和组织形式不同。 基因家族成员分布在特定染色体区域。也可分 散存在于同一染色体。甚至不同的染色体 基因簇（gene cluster）:家族成员紧密成簇排列 成大段的串联重复单位，并位于特定的染色体 区域内，称为gene cluster,血红蛋白基因家族 串联重复基因和基因家族的区别 串联重复基因各成分间有高度的序列一致性 甚至完全相同,以同一基本单位进行重复。基因 家族各成员的差别较大，以各自为基本单元重 复拷贝数较高，常有几十～几百个。基因家族 拷贝数不高。非转录的间隔区短而一致。基因 家族各成员的非转录的间隔长短不一. tRNA（4S基因) 小分子，75～90个核苷酸，20余种氨基酸约由 40余种tRNA。酵母tRNA，长约140kb，有内含 子，但各内含子没有序列的共同性。串联成堆 排列，间隔区较大， 重复基因的起源：滚环模 型，不等交换，突然复制假说3 3、细胞器基因 叶绿体、线粒体含有DNA，环状、非重复。同 一线粒体或叶绿体内含有相同环状DNA。 均编码自身所需的某些蛋白质及rRNA、tRNA。 其余所需的蛋白质均由核基因编码。 叶绿体、线粒体的膜不允许核酸的通过。其合 成的rRNA，mRNA和tRNA只能在细胞器内行 使功能，进行翻译，合成系统是细胞器专用的。 线粒体基因组呈母系遗传方式受精卵中线粒体 基因组几乎都来自卵子在减数分裂过程中，卵 子的线粒体DNA分子完全随机地分配到两个子 代细胞中 人类线粒体基因组 双链环状DNA 基因排列高度紧凑，总长为16,569bp，约93％ 的顺序参与基因的编码 DNA两条链的碱基组成差异很大： 重链（H 链）富含鸟嘌呤 轻链（L 链）富含胞嘧啶 细胞内的数目：数千拷贝 第三章DNA 复制 DNA replication 一、复制概况 1、半保留复制(Semiconservative replication) 复制时以解开的双链DNA中的一条链作为模板, 通过碱基互补配对原则合成另一条新链,由新 合成的子链与母链组成一新的DNA双链,其序 列与母双链完全相同. DNA复制的可能方式:分散复制，半保留，全保 留1958, Meselson和Stahl用实验证明了DNA的 半保留复制机制 2、制起点复、复制子、方向和方式 复制起点(Ori, O): 复制是在DNA分子的特定位 点开始的,这一位点被称为复制起点. 一般富含 AT序列。 复制起点的数目原核生物染色体通常只有一个 复制起点，复制从起点开始，进行到终点结束， 完成整个DNA分子的复制。（一个复制单元） 真核生物染色体DNA的复制是从多个位点（多 个复制起点），一个DNA分子上具有多个复制 单元。 复制子(replicon)：复制从起始到结束的DNA单 位称为一个复制子，是基因组中能独立进行复 制的单位。 在每个细胞分裂周期中，每个复制子只启动一 次。复制子中含有复制需要的控制元件。在复 制的起始位点具有原点，在复制的终止位点具 有终点（Terminus) 复制方向 ? 复制可能是单向的，也可能是双向的。这是 由从原点形成一个或两个复制叉决定的。 ? 复制叉(Replication fork)：复制发生的位点， 是双链分开的复制起点位置。复制叉从Ori开始 沿着DNA移动。一个复制叉：复制时复制叉移 动产生单向复制 ? 二个复制叉：复制时相背向移动，产生双向 复制 大多数生物DNA都是以双向等速方式进行复制 ? 双向复制时复制叉的移动不对称单核苷酸是 在3?端加上，复制方向或链的延伸方向：5‘→3‘ 复制方式 复制叉式(θ 复制)： 在复制原点产生复制叉， 双 链环状DNA的复制叉式类似Dθ ‖， 又称θ 复制。 滚环式(Rolling circle): DNA双链环的一条链断 裂， 5‘端和特定的蛋白质相连， 而在3‘端不断由 DNA聚合酶催化向前延伸，以未切断的一条环 链为模板进行合成。老环中另一条亲链的5‘端 不断抛出，似一个环在滚动。类似Dδ ‖，又称 Dδ ‖复制，被抛出的链到一定长度时则开始复 3 制其互补链。 3、DNA复制的半不连续性 半不连续复制模型：DNA双链中一条链的复制 合成是连续的，另一条链是不连续的。 1968年由冈崎等人提出：模板链（5‘→3‘）仍按 碱基互补，但从反方向合成多个5′→3′DNA 片段（冈崎片段），约长核苷酸。合 成的方向和复制叉移动的方向相反。 以3‘-5‘ 链 作为模板合成的DNA为先导链（leading strand） 以5‘-3‘ 链作为模板合成的DNA为后随链 4、DNA聚合酶与DNA聚合反应 DNA复制是由DNA聚合酶以四种核苷三磷酸 为前体负责催化完成的。 Kornberg （ 1957 ） 首次发现DNA 聚合酶Ⅰ （polⅠ），以后又发现DNA聚合酶Ⅱ（polⅡ） 和DNA聚合酶Ⅲ（polⅢ）poly(核苷 酸)n-OH3‘+dNTP → poly(核苷 酸)n+1-OH3‘+ppi 二、复制体系 ? 多种酶和蛋白质（E.coli中有30多种）参与 DNA的复制。与复制有关的酶和蛋白质称为复 制体系(Replisome)。 ? 双链DNA的复制是一个涉及酶活动的复杂的 聚合反应过程，可分为起始、延伸和终止三个 不同的阶段。 .1、DNA复制体系的鉴定 _利用条件致死突变体研究与复制有关的基因 温度条件致死突变体： ? 快停突变体：当温度升高，复制立即停止， 其基因产物是DNA链的延伸及冈崎片段的起始 和连接所需的酶，与DNA延伸所需的酶和蛋白 质有关。 ? 慢停突变体：当温度升高，可完成当前复制， 但不能开始新一轮的复制，其基因产物与复制 起始有关。 蛋白质鉴定方法：纯化、重建、突变 Proteins in DNA Replication： 1. DNA解旋酶（DNA Helicases） 2. 单链结合蛋白（DNA single-stranded binding proteins，SSB蛋白） 3. DNA拓扑异构酶(DNA Topoisomerase) 4. DNA Polymerase - DNA Polymerase I (Pol I) was the first enzyme discovered with polymerase activity, and it is the best characterized enzyme. Although this was the first enzyme to be discovered that had the required polymerase activities, it is not the primary enzyme involved with bacterial DNA replication. That enzyme is DNA Polymerase III (Pol III). Three activities are associated with DNA polymerase I; 5. 引发酶（Primase） The requirement for a free 3' hydroxyl group is fulfilled by the RNA primers that are synthesized at the initiation sites by these enzymes. 6. DNA 连接酶（DNA Ligase） DNA复制是由DNA聚合酶以四种核苷三磷酸 为前体负责催化完成的。 DNA polymerases are enzymes that synthesize a daughter strand(s) of DNA (under direction from a DNA template). May be involved in repair or replication. DNA replicase is a DNA-synthesizing enzyme required specifically for replication. Repair of damaged DNA can take place by repair synthesis, when a strand that has been damaged is excised and replaced by the synthesis of a new stretch. It can also take place by recombination reactions, when the duplex region containing the damaged is replaced by an undamaged region from another copy of the genome. DNA polymerases are the enzymes that make DNA Semiconservative replication synthesizes two new strands of DNA. Repair synthesis replaces a damaged strand of DNA. DNA synthesis occurs by adding nucleotides to the 3‘-OH end of the growing chain, so that the new chain is synthesized in the 5‘-3‘ direction. The precursor for DNA synthesis is a nucleoside triphosphate, which loses the terminal two phosphate groups in the reaction. 三种E.coli DNA聚合酶: ? DNA聚合酶I: polA 基因编码, 103 KD单链多 肽，参与损伤DNA的修复，在半保留复制中起 辅助作用。 ? DNA聚合酶II: 12KD单链多肽， 在损伤DNA的 修复中具有一定作用。 ? DNA聚合酶III: 多亚基组成的蛋白质， 是大肠 杆菌中真正的DNA复制酶。 真核生物DNA聚合酶 ?: synthesis of lagging strand. ?: DNA repair. ?: synthesis of leading strand. ?: DNA repair. 3、DNA聚合酶引物 ? DNA聚合酶的一个共同特征是只能催化 dNTPs加到已有核酸链的游离3‘-OH上，而不能 以游离的单核苷酸起始DNA链的合成。因此， 在起始合成时需要一段引物提(Primer)来提供 3‘-OH末端才能合成DNA。 ? ～10核苷酸的RNA片断，与模板链结合，保 证DNA复制的保真度，前导链和后随链都需引 物。 ? 引物由特殊的RNA 聚合酶合成， 称引发酶 （primase）。由dnaG基因编码，单肽链，引发 酶与相关蛋白结合形成的复合体为引发体 （primosome）。 4、螺旋酶 ? 又称解旋酶（helicase）,促进双链解开，是复 制、重组、修复过程中的关键酶。依赖ATP水 解所产生的能量来解旋DNA双链，螺旋酶在 DNA上移动解开双链。 ? 主动机制：解旋酶的两个结合点与DNA结合 后， 使结合区域双链DNA失去稳定， 实现解旋。 ? 被动机制：解旋酶的一个结合点和单链结合， 结合后沿单链DNA向双链区移动而解旋。 5、DNA旋转酶（gyrase） 拓扑异构酶 清除复制叉前的正超螺旋，2个A亚基和2个B亚 基组成。 6、单链结合蛋白 (single-strand protein,SSB) ? DNA解旋后的单链经碱基互补可产生局部双 链。该蛋白和单链结合可防止单链DNA的碱基 互补，无序列专一性，可增强单链与DNA聚合 酶的亲和力，单链蛋白可循环使用。 7、连接酶 ? 连接酶能催化双链DNA切口处的5‘-P和 3‘-OH生成磷酸二脂键，使断裂链相连，需要 ATP参与。 ? 5‘-P和3‘-OH相邻并且断裂两侧的碱基处于正 确配对时，连接酶才起作用。 三． DNA复制起始 从头开始: 1． 起点处双链熔解为单链 2． 解旋点移动、复制叉产生并移动 3． 引发反应合成RNA引物 1、复制原点与起始 E.coli的复制原点产生复制泡。DnaA蛋白结合 产生起始复合体。 2、引发体（primosome）产生4 ? 起始蛋白DnaA蛋白和复制起点OriC结合后， 形成的复合物， 增强了T抗原的螺旋酶活性，催 其它蛋白进入，如DnaB代替DnaA, 使DNA解 化进一步解旋。 旋，SSB结合单链， DnaC/DnaB复合体结合 RNA引物和起始DNA的合成 OriC形成预引发体， T抗原具有引发体装载功能，DNA聚合酶α +T ? DnaB和DNA解旋酶共同作用，在ATP的作用 抗原+RPA形成起始复合物，导致引发体形成。 下使DNA大范围解旋。 DNA pol α 在复制原点合成先导链和后随链的 ? 引发酶进入形成引发体，合成引物RNA。 引物。 3、DNA合成 DNA聚合酶δ 催化前导链和后随链按5′－3′ ? 引物合成后，DNA聚合酶Ⅲ组装在引发的 方向延伸。DNA pol α 脱离。DNA连接酶连 RNA上，并和引发体、螺旋酶等构成与核糖体 接冈崎片段。 差不多大小的复合体， 称为复制体(replisome)。 4、核小体的复制 ? 前导链的DNA合成是连续的，后随链的DNA ? 组蛋白八聚体以全保留方式传给子代，复制 合成是不连续的。前导链合成领先一段，后随 过程中不分离。 重新合成新的八聚体， 和核DNA 链的合成在一环状中进行，合成多个冈崎片断 复制同步进行。 而后连接。 ? 老的八聚体和新的八聚体均与合成产生的 四、延伸过程 DNA双链保持结合，老的八聚体和具有先导链 后随链合成的起始类似于复制起始 的DNA双链结合。 前导链和后随链的协同合成。 5、染色体末端复制与端粒酶 前导链的合成方向与复制叉运动的方向一致， 端粒酶 一次引发事件，polⅢ就能连续延伸前导链。 ? 端粒酶是含RNA和蛋白质的核糖核蛋白，自 ? 后随链要重复不断合成RNA引物。 身具有RNA模板的反转录酶活性。 五、复制终止 ? 端粒酶能在没有现成DNA模板的情况下，从 环状DNA复制的终止 缩短处重建DNA单链的特征。当将合成的端粒 单方向，复制终止就是它的复制起点。 与四膜虫的细胞抽提物混合在一起，结果端粒 双方向，两个复制叉在某一位点相遇，当复制 得到延长。 叉相遇时，两边各有两个终止区域各含多个位 ? 生物体的衰老与端粒缩短有关。 点。 端粒酶与肿瘤有一定关系 复制终止位点与特异终止蛋白Tus结合，复制 正常细胞分裂一段时间后，因端粒的缩短不再 叉移动到复制位点时就终止。 继续分裂，端粒酶的活性下降。而肿瘤细胞能 六、真核生物的复制过程 一直分裂，端粒酶的活性较高，而且肿瘤细胞 ? 1、复制原点、复制子和复制子簇 中的端粒比周围正常组织中的短。 ? E.coli 约3 x 104 bpM分进行复制，而真核的 原因：肿瘤细胞在开始无控制复制后，细胞才 DNA聚合酶活性低，约500-5000 bpM分进行复 合成端粒酶。此时肿瘤细胞已经失去一些端粒 制 重复，一旦端粒酶活化后，它将稳定这些缩短 2、DNA聚合酶 的端粒，使肿瘤细胞变成不死的细胞 真核的DNA聚合酶主要是聚合活性，而缺少 端粒缩短至一个阀值水平将发出防止细胞进一 5?－3‘外切酶活性。 步分裂的信号。如此时发生信号传递的突变， α 酶和δ 酶协同进行，β 酶与损伤DNA的修复 细胞就越过正常衰老而继续分裂从而产生肿 有关。 瘤。 3、SV40 DNA复制 新的抗癌药物，能阻止端粒酶的活性，从而使 ? SV40病毒仅编码一种蛋白质（T抗原）以供本 肿瘤细胞不再继续分裂，该药物又不能影响正 身基因组复制需要，其它蛋白质由宿主细胞提 常细胞的分裂。 供。SV40复制发生在宿主细胞内，其方式与核 第四章DNA损伤、修复和基因突变 DNA有相似之处。SV40 的复制可相似于真核 第一节DNA损伤 生物。 ? DNA损伤：生物体生命过程中DNA双螺旋结 DNA复制起点SV40， 5243bp ,环状双链，复制 构发生的任何改变。分类：碱基改变，结构改 起点有两个T抗原结合位点。 变（扭曲），因脱氨基而产生单个碱基改变 ● SV40病毒的复制起始位点结构 单个碱基改变不影响DNA整体结构，不影响转 反向重复序列大T抗原结合部位II A/T丰富区 录或复制，但改变子代的遗传信息 T抗原结合的核心起点中含4个拷贝的5核苷酸 紫外线辐射产生DNA结构扭曲，则对复制或转 序列（GAGGC),它是病毒起始蛋白T抗原的识 录产生物理性的损伤， 如在UV的作用下形成二 别位点。 T抗原与富含AT区域产生专一性结合， 聚体，或单链缺口、凸起 催化双链解旋。 引起DNA损伤的原因： T抗原结合部位I：位于核心起点附近，可使复 细胞内各种代谢物 制效率提高1～4倍。 细胞外的物理化学因素 T抗原结合部位II： 64bp的区域是SV40的复制起 DNA分子本身在复制等过程中发生的自发性变 始核心位点。它足可以启动DNA在动物细胞内 化 或体外的复制。有三 单个碱基改变不影响DNA整体结构，不影响转 个片段对于复制起始必不可少。 录或复制，但改变子代的遗传信息 ? SV40的T抗原 一、自发性损伤 ? T抗原基因编码的含磷蛋白质，唯一一种参与 1、复制中的损伤 其DNA复制的蛋白。此蛋白具有起始因子、 ? 复制过程中碱基配对时发生的误差再经DNA DNA螺旋酶、引发体装载蛋白的三重作用。 聚合酶D校读‖和单链结合蛋白等因素作用下仍 T抗原在ATP 的作用下聚集为六聚体，两个六 然存在的DNA损伤。 聚体识别ori 位点。与四个5核苷酸重复 2、碱基的自发性化学改变 （GAGGC）形成核蛋白结构，使双螺旋失去稳 互变异构 定。SV40起始蛋白T抗原使复制蛋白RPA与暴 碱基的脱氨基作用 露的单链结合。起始蛋白T抗原－DNA-- RPA 自发脱嘌呤或嘧啶 4DNA氧化（由细胞代谢产物产生） 互变异构： 4种碱基自发地使H原子改变位置，产生互变异 构体，使碱基的配对发生改变。 如果模板上发生这些互变异构体，复制时在子 链上就可能发生错误，形成损伤。 碱基的脱氨基作用： C、A、G的环外氨基会自发脱落，结果C→U、 A→次黄嘌呤（Hx）、G→黄嘌呤（X）、配对 时U:A、Hx:C、X:C，当DNA复制时，在子链 中发生错误。 自发脱嘌呤和嘧啶： DNA自发水解使嘌呤碱和嘧啶碱从DNA的磷 酸脱氧核糖骨架上脱落下来。 DNA氧化损伤： 细胞呼吸副产物H2O2，产生胸腺嘧啶乙醇、胸 苷乙二醇。活性氧使DNA上形成氧化碱基 二、物理因素引起的损伤 1、紫外线引起的DNA损伤： DNA分子易吸收一定波长的紫外线，使一条链 两个相邻的嘧啶以共价键产生嘧啶二聚体：两 个T、两个C或T和C之间都能产生，从而导致 DNA局部变性。 2、电离辐射： 直接效应：辐射对DNA直接沉积能量，引起理 化改变 间接效应： 辐射对DNA周围的环境成分 （如水） 中沉积能量，使碱基损伤或碱基脱落而引起 DNA改变严重时发生链断裂： 双链断裂（double-strand break,DSB） 单链断裂（single-strand break,SSB） 三、化学因素引起的DNA损伤 1、烷化剂对DNA的损伤 2、碱基类似物 第二节DNA修复 一、切除修复 碱基切除修复Base excision repair (BER) 专一的DNA糖苷酶识别损伤碱基，切除碱基与 糖苷间N－糖苷键，留下一个无嘌呤或嘧啶 （AP）位点，AP核酸内切酶在此切开磷酸二脂 键，核酸外切酶（5?－3‘）切去磷酸残基DNA 聚合酶修补缺口 核苷酸切除修复Neucleotide excision repair (NER)： 当DNA链上相应位置的核苷酸发生损伤， 导致 双链之间无法形成氢键，由核苷酸切除修复系 统负责进行修复。 内切核酸酶在其他多种酶的帮助下在损伤部位 两边各切除一定数量的核苷酸，真核25～30nt， 原核12nt，损伤的DNA被切除而留下一个缺口 切除过程结束后由相应的DNA聚合酶合成正确 的DNA单链，最后由DNA连接酶相连，完成修 复 二、直接（回复）修复 可简单地将损伤的碱基回复到原来的状态，包 括： 去甲基: O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶 (MGMT)的直接修复. MGMT从O6-甲基鸟嘌呤 上把甲基直接转移到酶的半胱氨酸残基上，使 碱基去甲基后回复为原DNA状态。此过程后修 复酶失活。每个修复酶仅用一次。 光复活酶修复：主要修复UV导致的嘧啶二聚 体，具有高度专一性。 单链断裂修复：DNA连接酶催化DNA单链的 5‘-P和3‘-OH形成磷酸二脂键。光复活酶识别嘧 啶二聚体，通过生色基团吸收篮光，吸收的能 量转移给FAD辅助因子，被激活的FADH （还 原型黄素腺嘌呤二核苷酸）通过电子转移引发5 二聚体的裂解，恢复为原来的单聚体形态， 同 时酶脱落。 三、错配修复 错配碱基存在于DNA链中，合成的新DNA双链 中有不配对的碱基。 该修复系统通过一种能识别亲链和子链的机 制，以亲链上的信息为模板进行修复，从子链 中去除错配碱基。 细胞通过甲基化作用识别不配对的碱基，识别 的基础是甲基化，即通过对亲链的甲基化而新 合成的子链非甲基化来区分亲链和新合成的子 链。非甲基化链是错误修复的目标链 基本过程：识别、切除和修补 四、双链断裂修复（DSB） 发生在体细胞重组和转座的生理条件下，主要 过程： 把末端接到一起、切齐、按需要产生3‘-OH和 5‘-P末端、然后连接两个片断。 五、限制和修饰系统 限制系统是细菌内的核酸内切酶识别外来DNA 或损伤部位，并将他们切除或由其他酶参与修 复损伤DNA。 Ⅰ类限制性核酸内切酶 ? EcoK和EcoB为代表 ? 三种亚基组成（S、R、M）R亚基负责限制， M亚基负责甲基化，S亚基负责识别靶序列，R 和M亚基的作用相互排斥。限制酶和甲基化酶 各作为一个亚基存在于酶中，一个完整酶有两 种功能。 六、重组修复（recombination-repair） 在复制后起作用，又称后复制修复和挽回系统 DNA复制时对TT二聚体不复制，留下一个缺 口，产生的子代双链中有一条链损伤，另一条 有一段长的空缺，而另一双链的2条子链则正 常。 七、SOS系统 损伤DNA或抑制E.Coli复制的手段会引起一系 列综合表现型改变而称为SOS反应。由RecA和 LexA抑制物相互作用而引起。 ? SOS系统的酶只有在DNA损伤后才出现， 表现 为修复损伤DNA的能力增强，允许新生的DNA 链越过TT二聚体，保真度下降。 ? 正常情况下SOS系统是关闭的。 第三节基因突变 基因突变（mutation）： 生物体基因组中DNA 发生可以遗传的改变 突变体（mutant）： 携带突变基因的个体或群 体（株/系） 野生型：没有发生突变的基因和性状，用D＋‖ 表示，Arg+ 突变型：发生突变个体所表现的性状，用D―‖ 表示，Arg1 按碱基突变类型可分为： 碱基替换（base substitution） 插入（insertion） 缺失（deletion） 3、突变分类 根据突变原因： 自发突变―自发突变体 诱发突变―诱发突变体 根据突变位置： 单点突变：一个碱基的变化(替换、插入、缺失) 多点突变：2对碱基以上 根据突变效应： 同义突变：不改变基因产物的序列，中性 无义突变：突变为终止密码子 错义突变：导致基因产物的序列改变 对功能无影响 5 改变基因功能 有害的或致死的 3、突变分类 对环境的敏感性： 条件型突变（conditionded mutation） 温度敏感突变体 非条件型突变 突变的方向性： 正向突变 反向突变（回复突变） 回复突变： 突变体通过第二次突变可恢复野生型 第二次突变抑制了原先突变体的表现而和最初 的野生型相同，抑制突变 第二次突变抑制了从野生型到突变体的效应， 如该突变发生在正向突变的基因内，就是基因 内回复，如该突变发生在其他基因内，就是基 因间回复 4、基因突变的后果 （1）功能丧失 （2）功能获得 基因在发育过程中的错误时期、错误组织对错 误信号的反应，或异常高水平表达，表现显性。 （3）癌症发生 人体中每个基因每代突变发生率为10－5～10 －7? 癌基因（oncogene）可增强细胞的增殖， 正常的非突变体基因为原癌基因 肿瘤抑制基因 基因产物可抑制细胞增殖。突变后则丧失其功 能，参与细胞周期的调控，Ts基因增变基因 负责维持染色体组的完整性和信息传递的保真 度，不参与细胞周期调控，突变后导致DNA的 不完全复制或修复，癌细胞有不正常的核型正 常细胞转变为恶性肿瘤要有三类基因参与 癌基因发生突变的机制： ? 基因放大：癌细胞大多含有多拷贝的正常癌 基因。结肠癌，肺癌。 点突变：p21蛋白参与G蛋白信号传导 染色体易位：染色体片段的易位产生新的嵌合 基因。(chr9-chr22),慢性骨髓性白血病 转座：基因座转位到活性染色质区而激活，异 常高水平表达。淋巴癌 第五章转录 第一节转录概况 转录： 以 DNA 为模板， 在依赖于 DNA 的 RNA 聚合酶催化下，以 4 种 rNTP 为原料合成 RNA 的过程。 包括 RNA 链的起始、延伸和终止三个 过程。转录产生一条与 DNA 模板链互补的 RNA，它的序列与编码链一致。 一、DNA 双链与其转录产物(RNA 链)的关系 正义链(编码链)：非转录模板的 DNA 单链 反义链(模板链) ：作为模板转录的 DNA 单链 正(+)链： 单链 DNA 病毒所含的 DNA。 (正义链) 负(-)链： 单链 DNA 为模板所复制互补的链， 再 由此互补链为模板转录形成 RNA。 （反义链） 正链 RNA 病毒： 基因组 RNA 能作为 mRNA 或 与 mRNA 相似的 RNA 病毒。 负链 RNA 病毒：基因组 RNA 进入寄主细胞后 通过 RNA 复制， 并以此为模板产生出互补链作 为 mRNA 的 RNA 病毒。 转录从启动子(promoter)的特殊序列开始，到终 止子(terminator)结束， 这样的一段 DNA 称为一 个转录单位(transcription 一个转录单位就 是一段以一条单链 RNA 分子为表达产物的 DNA 片段，可包含一条以上的基因。 二、转录单位 A transcription unit is a sequence of DNA transcribed into a singleRNA 三、转录方向和速度 转录的方向 5?―3‘, 37 ℃下，E.coli 中以 40bp/ 秒的速度合成,和翻译速度（15aa/秒）相同，比 DNA 复制要慢（800bp/秒） 四、RNA 合成的酶学过程 转录是在 RNA 聚合酶的催化下进行的， 转录的 基本特征： RNA 前体是四种核糖核苷三磷酸 （rNTP） ， RNA 链的生长方向是 5 ′→ 3 ′转录单位内仅一条 DNA 链为模板，以碱基互补原则进行 RNA 的 合成，由 RNA 聚合酶催化 RNA 的形成，不需 引物，能起始一条新链的合成。 第二节 RNA 聚合酶 原核生物 RNA 聚合酶 、E.coli RNA 聚合酶的结构 ? α 亚基：可能参与全酶的组装及全酶识别启 动子，无明确的转录功能，在启动子的识别中 有一定的作用，rpoA 基因编码。 ? β 亚基：RNA 聚合酶催化中心，有 2 个结构 域分别负责转录的起始和延伸， rpoB 基因编码。 可以和模板 DNA、RNA 和核苷酸底物相结合。 ? β ‘亚基：可能负责酶与模板 DNA 的结合， rpoC 基因编码。 σ 因子：最常见的是 70，启动子识别中的关 键因子， 使 RNA 聚合酶与启动子特异结合。细 胞内哪条链被转录、转录起点的选择和 亚基 有关。 一 种 E.coli RNA 聚 合 酶 可 以 负 责 三 种 RNA(mRNA, tRNA, rRNA)的转录 2、RNA 聚合酶结构和功能的复杂性 σ 因子与核心酶在转录中各个点被重复使用 只有全酶才能起始转录 σ 因子在 RNA 链合成了 8-9 个碱基后释放,离开 负责延伸的核心酶. 核心酶能在 DNA 模板上合 成 RNA,但不能在正确的位点起始 3、RNA 聚合酶是如何找到启动子序列的? ? RNA 聚合酶结合到启动子上的速率极快,所以 不可能是靠随机扩散而结合的; 可能随机地结 合到 DNA 的某个位点上,然后快速地滑动并替 代结合的 DNA,直到发现启动子序列 ? σ 因子在细胞中的含量很多 , 可以供细胞内 1/3 的 RNA 聚合酶组装成全酶 ? 约有一半左右含有核心酶的 RNA 聚合酶从事 转录，在一个细胞中大约有 7000 个酶分子,其 中有
个参与 RNA 的合成. 核心酶具有与 DNA 的非特异性结合能力,称为 松弛型结合,结合常数为 1011L/mol,半衰期为 60 分钟,这种结合是 DNA 的磷酸基团与蛋白质的 碱性基团间的非特异性吸附作用. ? 全酶与 DNA 的非特异性结合下降至结合常 数为 107L/mol,半衰期在 1 秒以下,而与启动子 的结合能力大提高,结合常数为 1014L/mol,半衰 期长达几个小时. ? 全酶与不同启动子间的结合力相差较大 , 可 有 6 个数量级上的差别. 可能与σ 因子有关. σ 逆因子与核心酶之间的可结合：只有全酶才 能起始转录 σ 因子通常在 RNA 链合成了 8-9 个碱基后释放, 离开负责延伸的核心酶. 核心酶能在 DNA 模板上合成 RNA,但不能在正 确的位点起始保证转录起始与延伸对聚合酶的 要求核心酶对 DNA 有很高的内源亲和力， 当新 生的 RNA 存在时，这种亲和力增加。 二、真核生物 RNA 聚合酶 转录起始需要 RNA 聚合酶和转录因子 真核生物中三种 RNA 的合成分别需要不同的 RNA 聚合酶（I、II、III） 真核生物和原核生物的 mRNA 转录有一个显6 著的区别，即真核生物启动子的起始涉及许多 位点 I：在-70－-50bp 处，含一个反向重复序包 蛋白质因子（转录因子） 列，强结合位点。 转录起始时在识别启动子过程中起主要作用的 位点 II：在-50－-40bp 处，是弱结合位点. 是转录因子而不是 RNA 聚合酶本身 一旦位点 II 被占据，RNA 聚合酶就很快与-35 对于真核生物 RNA 聚合酶功能， 都是先由转录 序列结合，然后与-10 序列结合。 因子结合到启动子上形成一种结构，以此为 E.coli 在含有乳糖和葡萄糖的培养基上则优先 RNA 聚合酶提供所识别的靶标。 利用葡萄糖。 真核生物 RNA 聚合酶由多个亚基组成 当培养基内缺少葡萄糖时，腺苷酸环化酶将 CTD：羧基端结构，II 型所特有 ATP 转变为 cAMP，cAMP 与其受体蛋白 CRP 线粒体和叶绿体中的 RNA 聚合酶分子量较小， 结合形成复合物，该复合物再与启动子上的 与细菌中的 RNA 聚合酶更相似： Cap 位点结合。结合后使 DNA 发生 90°的弯 基因组小 曲， 增加了 RNA 聚合酶与启动子的结合， 提高 只要负责少量基因的转录 转录效率 50 倍。 转录的控制机制可能也相对简单 cAMP 的受体蛋白 CRP 是一个转录因子。 第三节启动子 E.coli 在含有乳糖和葡萄糖的培养基上则优先 ? 启动子(promoter)：DNA 分子上被 RNA 聚合 利用葡萄糖。 酶识别并结合形成转录起始复合物的区域 , 它 当培养基内缺少葡萄糖时，腺苷酸环化酶将 还包括一些调节蛋白因子(转录因子)结合的序 ATP 转变为 cAMP，cAMP 与其受体蛋白 CRP 列。 结合形成复合物，该复合物再与启动子上的 ? 启动子是控制转录起始的序列,并决定着某个 Cap 位点结合。结合后使 DNA 发生 90°的弯 基因的表达强度。 曲， 增加了 RNA 聚合酶与启动子的结合， 提高 ? 启动子内的保守序列 (Consensus sequence) 是 转录效率 50 倍。 聚合酶与其它 DNA 结合蛋白的结合位点。 当葡萄糖存在时，腺苷酸环化酶活性下降， ? 原核生物和真核生物启动子结构存在差异， cAMP 不能形成。CRP 就不能与之结合，从而 同一生物内不同基因启动子序列经常不一致而 也不能与 CAP 位点结合，RNA 聚合酶和启动 表现序列差别，由此在一定程度上决定了该基 子不结合，从而使乳糖操纵子不被激活，转而 因表达的强弱。 研究启动子结构与功能的方法： 利用葡萄糖为碳源，不利用乳糖 序列比较：同源性强的序列（保守序列） 2、RNA 聚合酶与启动子的结合 启动子序列突变：足迹法（Footprinting): 缺失 二、真核生物的启动子结构 碱基修饰（替换） ：不同启动子序列结构的比较 真核生物的启动子结构和 RNA 聚合酶的种类 一、原核生物的启动子 有关， 每一种 RNA 聚合酶都有自己的启动子结 1、原核生物启动子的结构 构：三种聚合酶对应三种启动子类型：C I 型： 转录起始点-10 区， -35 区 rRNA 基因 -10 与-35 区间的距离 C II 型：蛋白质基因 （1）转录起始点： 多数情况下（&90%）为嘌 C III 型：tRNA 基因 呤，常见序列为 CAT，其中 A 为转录起始点。 1、RNA 聚合酶Ⅰ的启动子 （2）-10 区序列（Pribnow box） 转录 rRNA(3 种): 启动子位于转录起始点上游 一般位于转录起始点上游-18～-9 区，具 6bp 保 守 序 列 ， 大 多 为 TATAAT ， 一 般 序 列 为 T80A95T45A60A50T96，中心位于转录起始点上游 － 10bp 处；在几乎所有启动子中均存在，是 三种 rRNA 的基因（rDNA)成簇存在，共同转 RNA 聚合酶的牢固结合点，又称为结合位点， 录在一个转录产物（ 13000nt ） 上， 位于核 或称为解链区。 仁中，然后加工为 3 种 rRNA. （3）-35 区序列（ Sextama box） 聚合酶 I 的启动子的结构： 转录起始点上游-35bp 处，又称-35 序列，一般 ? 核心启动子序列：转录起始点的上游 -45 － 序列，T82T84G78A65C54A45 +20bp 区 是 RNA 聚合酶初始结合位点，依靠?亚基识别 ? 上游调控元件(UCE)：-180－-107bp 区, 提高 该点，又称为识别位点；该区域是启动子强弱 转录效率。 的决定因素。 ? 两个区域内的碱基富含 GC,两者有 85%的同 RNA 聚合酶在此处识别后才移动结合到-10 区， 源性。 RNA 聚合酶一旦和-10 序列结合， ?亚基就从识 2、RNA 聚合酶Ⅲ的启动子 别位点上释放出来。 ? 转录 5sRNA、tRNA、部分 snRNA，三种基 （4）-10 与-35 区间距离 因的启动子结构是不同的： ? Pribnow 框和 Sextama 框之间的距离对转录效 C 内部启动子(下游启动子)：5sRNA、tRNA 率十分重要，两者之间为 17bp 时效率最高。天 C 上游启动子：snRNA 然启动子的距离大多为 15～20bp（90%的原核 ? 要识别不同的启动子，必须和其他的辅助因 生物启动子为 16-18bp)。 子共同作用 并不是所有的启动子都具有典型的结构，有些 内部启动子: 两类 启动子缺少其中某一结构； ? 第一类：A 框+ C 框 转录起始点左右（包括下游）的碱基也可影响 ? 第二类：A 框+ B 框 转录的起始，如+1 至+30bp 的转录区序列可影 第一类内部启动子： 响 ? A 框：+50 － +65bp RNA 聚合酶对启动子的清除（escape)，从而影 ? C 框：+81 － +99bp 响启动子的强度。RNA 聚合酶本身并不足以与 第二类内部启动子： 启动子结合，还需要其他的辅助因子（转录因 ? 两个保守区间组成 子） ? A 框： TGGCNNAGTGG 乳糖操纵子 Cap 位点 ? B 框： GTTCGANNCC 启动子上游具有 2 个 Cap 位点： ? 由不中断的两个区域组成。对 tRNA 基因而 6言， A 框相当于 tRNA 的 D 臂， B 框相当于 tRNA 的 Tψ C 臂 转录 snRNA 的启动子(上游启动子)： 转录 snRNA 的启动子位于转录起始点的上游， 含三个短序列元件：分别为 TATA 框、远端序 列元件(PSE)和八聚核苷酸(OCT) 。TATA 决定 启动子与 RNA 聚合酶 III 的结合，PSE 和 OCT 与转录效率有关。 3、RNA 聚合酶Ⅱ的启动子 转 录 核 mRNA( 蛋 白 质 基 因 RNA) 、 部 分 snRNA。 启动子位于转录起点的上游，由多个短序列 元件组成，其结构最为复杂 该类启动子属通用型启动子，即在各种组织 中均可被 RNA 聚合酶 II 所识别，没有组织特 异性 聚合酶 II 单独不能起始转录， 必须和其 他的辅助因子（转录因子）共同作用形成转录 起始复合物才能起始转录 该类启动子有一些共同的结构特点：含多个 保守序列（元件，element) RNA 聚合酶Ⅱ的启动子结构 1) 帽子位点(cap site): 又称转录起始位点 (transcriptional start site, TSS)，该序列并没有多大同源性，但 mRNA 的 第一个碱基多为 A。 在 A 两侧则为嘧啶，形成一短保守序列 Py2CAPy5, 称为起始子（Initiator, Inr)，包含了 -3 位到+5 位之间的区域。 2) TATA 框(Hogness box): 一 般 序 列 为 TATAA(T)AA(T) [T82A97T93A8A63(T37) A83A50(T37)] ，位于 -25－-35(-30bp)附近 决定转录起始点的选择， TATA 框周围的碱基 序列倾向于富含 GC，可能对启动子有重要作 用。 与细菌启动子中的-10 区序列相似 左右启动子可能不含有 TATA 框（称为 无 TATA 启动子） ， 但含有另一个位于+28 至+32 位之间的元件，称为下游启动子元件（DPF） 。 3) CAAT 框: 位 于 上 游 -75bp 处 ， 一 致 序 列 GGC(T)CAATCT，头两个 G 很重要，当缺失这 两个 GG 时，则兔子的β -珠蛋白的基因转录效 率只有原来的 12％，CAAT 框可能控制转录起 始的效率，正反方向排列均能起增强转录的作 用. 对于启动子的特异性,该框无直接的作用. 4) GC 框: 位于－90bp 附近，核心序列为 GGGCGG,一个 启动子中可以有多个拷贝,序列可正反. 5) 其他元件: 八聚核苷酸元件(OCT element): ATTTGCAT 元件: GGGACTTTCC 元件: GTGACGT 转录起始位点下游部分序列 不同启动子中, 上述基本元件的组合情况是不 同的, 数目(拷贝数)、位置、排列方向也有所不 同. 各种元件都可与相应的蛋白质因子 （转录因子） 结合，这些蛋白质因子结合到启动子上通过相 互作用共同合成起始复合物，决定了转录的起 始。. 6) 增强子 远离转录起始点数千个碱基的调控元件，对转 录有增强作用，约为 100-200bp,有单拷贝或多 拷贝。 增强子特性：使基因从正确起始位点处增强转录活性 在转录基因的上游或下游约 1kb 以上发挥作用 优先激活两个串联启动子中距离最近的一个 有组织和细胞特异性 第四节转录机制 转录过程可分为三个阶段：模板识别、转录起 始、延伸、终止 一、转录的起始 启动子 聚合酶 辅助因子 1、核生物的转录原起始 聚合酶中的?因子起着识别启动子的作 用。 ?因子和核心酶结合形成全酶而识别特定启 动子区域。 全酶改变了 DNA 的结合能力， 核心 酶可以沿着 DNA 移动， 但不能区别启动子和其 它 DNA 序列。 ?因子作为独立的多肽，并不与 DNA 结合， 但和核心酶结合形成全酶后， ?因子与起始点上 游区的 DNA 接触、移动而识别特定启动子区 域。 游离的?因子的 N 端抑制了 DNA 结合区的活 性，当?因子结合到核心酶上时，这种抑制被消 除，从而与启动子序列特异结合。 一、 转录的起始 只有全酶才能起始转录 σ 因子通常在 RNA 链合成了 8-9 个碱基后释放, 离开负责延伸的核心酶. 核心酶能在 DNA 模板上合成 RNA,但不能在正 确的位点起始 核心酶对 DNA 有很高的内源亲和力， 当新生的 RNA 存在时，这种亲和力增加。 全酶与-35 序列结合形成一个封闭型启动子 复合物，然后全酶向-10 区移动并牢固结合，在 此区的 DNA 发生溶解， 产生 12-17bp 的单链区， 在此形成开放型启动子复合物。 封闭型和开放型启动子复合物均由 DNA 和 蛋白质组成，称为二元复合物； 在开放型启动子复合物（ RNA 聚合酶约与 75bp 的 DNA （-55~+20 位)相互接触） 中，RNA 聚合酶上的起始位点和延伸位点被相应的核苷 酸前体充满，在β 亚基的催化下形成第一个磷 酸二酯键； 此时，由 RNA 聚合酶+启动子 DNA+新生的 RNA 链组成三元复合体， 因子解离，形成起 始延伸复合物，此时核心酶约与 55bp（-35-+20 位）的 DNA 相互接触 随后， RNA 合成速度约 30~50 核苷酸/秒， 非 恒速，有时会降低速度 当 RNA 聚合酶结合到启动子上时，转录泡形 成。 核心酶沿着 DNA 移动时， 转录泡也随之移 动， 同时 RNA 链增长。转录泡中碱基配对和碱 基递加是由酶催化完成的。转录泡长度是 12-14bp， 其中 RNA-DNA 杂合链的长度是 8-9 . 2、真核生物的转录起始 聚合酶：I、II、III 启动子：I、II、III 辅助因子：转录因子(Transcription factor, TF) 真核生物转录起始涉及许多种 TF，这些 TF 结合到各种不同的顺式作用元件 (cis element) 上。 在识别启动子的过程中，起主要作用的是 TF，而不是 RNA 聚合酶本身。 转录因子可通过识别 DNA 上的顺式作用元 件而起作用，也可通过识别另一种因子（如 RNA 聚合酶、TF）而起作用。 （1）RNA 聚合酶Ⅰ的起始转录 77 聚合酶Ⅰ需要两种辅助因子，分别与核 心启动子序列和上游调控元件(UCE)结合： -IB、 Rib1)： 与核心启动子序列结合， 由 4 种 蛋 白 质 组 成 ， 其 中 一 种 为 TBP(TATA-binding protein) 特异结合蛋白)： 与上游调控元件 （UCE) 结合， 同时还和核心元件上游的一段序列结合， 两个 UBF 间的相互作用形成一个环状。 另一个辅酶因子 SL1 再与 UBF 结合， 当 UBF、 SL1 两种辅酶因子与 DNA 结合后， RNA 聚_合 酶才与核心启动子结合开始转录 SL1 类似于原核生物的_因子，保证 RNA 聚合 酶准确定位。 SL1 有 4 种蛋白质组成，其中一种为 TATA 框 结合蛋白（TBP） （2）RNA 聚合酶Ⅱ的起始转录 _ RNA 聚合酶Ⅱ自身不能起始转录，必须在其 他辅助因子的作用下才能起始转录 _ 酶和其他辅助因子组成一个基础转录装置， 可以起始 II 类基因的转录。 _ 基础转录因子（TFIIX） ： ） ： 起始通用启动 子（RNA 聚合酶 II 可起始转录的最短的序列） 转录所需的辅助因子， （ ， （ 与聚合酶结合后 起始转录的效率很低） _ 其它上游辅助因子（分别与更上游的调控序 列结合） _ 起始转录的辅助因子按一定顺序 （先后次序） 与启动子上的 DNA 结合形成复合物 TFIID―负责识别启动子 ? TBP (TATA-binding protein): 识别 TATA 盒 ? TAFs (TBP associated factors)：含有不同 TAF 的 TFIID 能识别不同的启动子，一些 TAF 具有 组织特异性的。 上游转录因子和 RNA 聚合酶Ⅱ中普遍存在的 一些序列元件结合 （3）RNA 聚合酶Ⅲ的起始转录 第一类内部启动子（AC box） ： TFⅢA 和 A 结合，TFⅢC 和 C 结合，然后 TF ⅢB 结合，TFⅢA/C 就解离，聚合酶最后结合。 TFⅢC 可视为 TFⅢB 的定位装配因子。TFⅢB 的结合有利于 RNA 聚合酶的结合。 第一类内部启动子（AB box） ： TFⅢC 先和 AB 结合， 然后 TFⅢB 结合，TF ⅢC 就解离，聚合酶最后结合。TFⅢC 可视为 TFⅢB 的定位装配因子。TFⅢB 的结合有利于 RNA 聚合酶的结合。 第三类启动子（上游启动子） ? 转录部分 snRNA （ RNA 聚合酶Ⅱ 也可转录） ? 非内部启动子，TATA 框的识别需 TBP 和其 它 PolIII 的辅助因子共同作用，才能使 Pol III 在启动子上正确定位 ? 其他一些辅助因子结合到 Oct 和 PSE 上，增 加转录效率 ? 类似于 RNA 聚合酶Ⅱ 二、转录的延伸 1、转录第一个核苷酸的选择： ? 原核生物中， 起始转录的碱基距保守 TA 框为 6－9 核苷酸，多为 CAT 模式，第一个碱基 A， 这可能与 RNA 聚合酶的空间结构有关， 结合部 位与聚合活性部位间的距离决定了转录起始碱 基与 TATA 框的距离。 ?因子从全酶上解离，使核心酶在 DNA 链上移 动容易，RNA 聚合酶的起始位点和延伸位点都 充填了核苷酸，产生了第一个磷酸二酯键，当 合成起始后，起始位点就充当 3‘端位点，而延 长位点不变，任何一个延伸的碱基必须与模板 链互补2、拓扑学问题： ? DNA 解链过程中， 位于 RNA 聚合酶前面的双 链会产生正超螺旋， 而转录后的 DNA 则要产生 负超螺旋，为消除此现象，需旋转酶（消除负 超螺旋）和拓扑异构酶Ⅰ（消除正超螺旋）的 参与。 3、新生的 RNA 链与 DNA 链形成杂交链很短 4、RNA 链延伸速度： 40 个核苷酸/秒，非匀 速，在经过 GC 富含区 8-10 个核苷酸后会发生 一次暂停，与转录终止有关。 三、转录的终止 转录终止需要的条件:DNA 上可识别的终止序 列(终止子, Terminator) 正在转录的 RNA 产物的二级结构 ( 发夹结 构,Hairpin structure) 辅助因子的参与(不一定): ρ 因子 终止子在终止效率上差别很大. 原核生物中存在的两种转录终止途径: 不依赖ρ 因子的转录终止：体外没有任何其它 因子的参与，核心酶在某些位点终止转录。该 位点为内源终止子。 依赖ρ 因子的转录终止：体外终止时需要 ρ 因 子的参与。 不依赖ρ 因子的转录终止子 ? 没有ρ 因子则是依靠内源终止子序列本身的 结构使终止完成，有茎环的二级结构和转录单 位末端连续 6 个 U 的区段. E.coli 中约有一半基 因拥有内源性终止子序列. 第五节 RNA 的加工和剪接 多数转录的初始产物(pre-mRNA)并无生物学活 性 , 必须经进一步的加工处理 ,尤其是对于真核 生物转录产物的后加工更为重要. RNA 加工是对初生转录物在核内进行修饰， 常见类型 C 1）外/内切核酸酶对核苷酸的切除 C 2） 在初生转录物或剪切产物的 3‘和 5‘端添加 核苷酸 C 3）某些特殊的核苷酸碱基或糖苷进行修饰 一、原核生物转录产物的后加工 ? mRNA 寿命非常短,半衰期只有几分钟,这是原 核生物基因表达调控的一种手段 ? rRNA 和 tRNA 比较稳定, 半衰期可达几个小 时 ? 成熟 rRNA 和 tRNA 与其原始转录产物比较: C 5‘端为单磷酸,而原始产物为三磷酸 1、rRNA 的后加工 ? 转录产物经 RNA 酶Ⅲ后加工剪切，释放出 5S、16S、23S 前体分子，随后 RNA 酶 M5、 M16、M23 等分别在每一前体分子的 5‘端和 3‘ 端进一步剪切，从而生成单独的成熟的 rRNA 分子。 2、tRNA 的后加工 ? E.coli 上 tDNA 基因的组织： C 含有 7 个 rrn 操纵子， 这些操纵子中包含 tRNA 基因并被间隔序列相隔 C 多个相同的 tRNA 同时转录在一个转录产物 中 C 不同的 tRNA 也可转录在一条 RNA 中 ? tRNA 的初始转录产物要经过多种加工处理后 才能变为有功能的分子。 期间需多种酶的作用。 tRNA 的类型： Ⅰ型：在 3‘端有一个三核苷酸序列（CCA） ，它 们不是由基因组编码的，而是在 tRNA 加工过 程中被加上去的。原核多为Ⅰ型 ? Ⅱ型：无 CCA，真核多为Ⅱ型 ? CCA 的加接是酶作用的结果， 由 CCA 基因产 生的 tRNA 核苷酸转移酶催化合成。 1、 识别发夹结构Ⅰ的内切核酸酶在箭头处切断2、RNaseD（外切酶）识别 3‘端，一个个切除 7 个碱基，产生成熟的 3‘端 3 、 RNaseP （内切酶）进行内切产生成熟的 tRNA5‘端 4、 三叶草结构中的三个环通过专一性的酶进行 碱基修饰和加上 CCA 3、mRNA 的后加工 ? 原核生物 mRNA 的寿命非常短，转录产物不 需或很少加工就具有生物学活性，即可作为翻 译的模板。核糖体在 mRNA 分子的合成未完成 前就开始翻译。 二、真核生物转录后加工 1、rRNA 转录后加工 _ rRNA 种类： ? 5.8S rRNA ? 18S rRNA ? 28S rRNA ? 5S rRNA _ 前三者基因组成一个转录单位 ,在基因组中存 在许多拷贝，并组成串联重复序列 _5S rRNA 基因通常成簇存在，由 RNA 聚合酶 III 转录后加工成为成熟的 5S rRNA ? 真核生物 RNA 聚合酶Ⅱ在细胞核内转录产生 的转录产物平均长度比 mRNA 长，且不稳定， 序列较复杂，大小不一，称为核内不均一 RNA （hnRNA） ， 其中包括 mRNA 前体 （pre-mRNA) 以及其他转录物 ? hnRNA 在核内会很快被蛋白质包裹形成核内 不均一核糖核蛋白颗粒 （hnRNP） ， 其中 hnRNA 由蛋白质包围， 这些蛋白有助于保持 hnRNA 的 单链状态，并辅助 RNA 的加工、输出等。 2、mRNA 转录后加工 ? 真核生物成熟 mRNA 的结构： C 具有一个 5‘帽子(cap)结构 C 3‘ poly(A)尾巴 C 无内含子序列 C 在细胞质中进行翻译 C 相对较为稳定 （1）5‘端加帽 ? 在 5‘端通过 5‘-5‘三磷酸二脂键将一个 G 加到 转录物的末端碱基， 随后 1-3 个甲基基团 （N7甲基鸟苷）加到新的末端 A 的碱基或核糖上， 形成不同的加帽结构。 ? 帽子 0：仅加 N7－甲基鸟苷，m7GpppX ? 帽子 1 ：在原转录物的第一核苷酸的 2‘ － OH 产生甲基化，m7GpppXm， （主要形式） ， ? 帽子 2： 原转录物的第二个核苷酸的 2‘ －OH 再发生甲基化，m7GpppXmYm。 帽子的作用： ? 为核糖体识别 mRNA 提供信号，尤其是帽子 0 ? 增加 mRNA 的稳定性， 保护 mRNA 免遭 5‘-3‘ 外切核酸酶的作用 ? 与某些 RNA 病毒的正链 RNA 的合成有关 （2）3‘端剪切及加尾 ? 大多数 mRNA，其成熟的 3‘端是经剪切再加 上一串多聚 A 而形成的，poly(A)尾并不是加在 转 录终止的 3‘端，而是由一个 360KDa 的特异酶 识别转录产物的特定序列（ AAUAAA ）上游 13～20nt 附近的序列以及（GUGUGUG）下游 的序列，然后由末端腺苷酸转移酶（polyA 聚 合酶）催化加尾。 加尾的 3‘端可抵抗 3‘－5‘外切酶的攻击，有助 于 mRNA 由核向质运转进行翻译 Poly(A)能影响翻译的稳定和初始。 细胞核的 poly A 聚合酶有起始聚合 polyA 的功 能，而细胞质中的 polyA 聚合酶能使缩短的 88 polyA 延长，不能重新合成 3、tRNA 转录后加工 tRNA 内有内含子，约 14nt~46nt 位于 3‘端并和 反密码子相邻，并和其反密码子互补，在加工 前反密码子处于双链，受到保护 tRNA 剪接的 酶是识别整个 tRNA 分子或 tRNA 分子中某些 保守二级结构，并非识别内含子序列，但在内 含子的两个末端通过其不同的亚基来切割 tRNA 核苷酸转移酶将 CCA 序列添加到 3‘端 由内切酶切断磷酸二酯键，释放出一条线状内 含子和 2 个 tRNA 半分子无需 ATP，2 个 tRNA 半分子连接， 在 RNA 连接酶作用下连接为成熟 的 tRNA，需 ATP 三、真核生物 RNA 的剪接 RNA splicing 从初始转录产物中去除内含子而将外显子连接 产生成熟 RNA 分子的过程 蛋白质基因内含子的种类： ? 高等真核生物细胞核基因内含子 ? 第 I 类内含子： 内含子中含 4 个重复的 10~12nt 保守序列称中部核心结构， ? 第 II 内含子：不含该结构的内含子 ? 第 I 和第Ⅱ类内含子存在于细胞器和细菌中， 低等真核生物细胞核中也有 I 类内含子 ? 不同的内含子其拼接方式不同 ? 内含子有 4 个保守的反向重复 10－12 核苷 酸，产生的二级结构有 9 个区域，剪接点就 发生在二级结构处。因二级结构有利于磷酸脂 键的切断和再连接。 ? 内含子末端连接可能是 RNA 本身固有的特 征，使剪接实际上仅发生在同一个内含子的 5?和 3‘剪接点之间。 1、第一类内含子的拼接 ? 自我剪接（转脂反应） ：由一个磷酸脂键转变 成另一磷酸脂键的过程。是磷酸脂键的转移， 无水解反应，不需要外部能量。 转脂反应： 第一次： UACUAAC 的保守 A 通过 2?－羟基对 5‘剪接点 发动亲核攻击； A 不参与二级结构，保证了它 发动转脂反应的功能。 第二次：由（1）释放的外显子的游离 3?－羟基 攻击 3‘剪接点，外显子连接。内含子形成索套， 无需 ATP ? 三次转脂反应： ? 第一次， 游离的 G－OH 攻击内含子的 5‘端， 产生 G－内含子和外显子游离的 3‘－OH 端。 ? 第二次，由上游外显子 1 的 3‘ －OH 攻击外 显子 2 的 5‘ 端并相连，释放线状内含子。 ? 第三次， 游离的线状内含子产生环状或降 解。 2、第Ⅱ类内含子的拼接 ? 也属自我剪接 ? 其内含子含 6 个茎环结构，与核基因 mRNA 的内含子类似，在 3‘剪接点上游有 6-12nt 的序 列比较保守。PyPuPyPyTAPy，其中 A 最为保 守。在 A 的前后各有一段 3～5 核苷酸的短序 列。能与上游的核苷酸互补，形成二级结构。 但 A 是独立的，不在双链区。 ? 此保守 A 的 2?-OH 首先攻击 G, 第二次由 G 攻击 3?剪接点，产生索套结构，完成转脂反应。 3、核基因 mRNA 内含子的拼接 ? 外显子和内含子接头的特点： ? 二级结构，一个内含子的两端没有广泛的序 列同源性或互补性，但有形成二级结构使剪接 点靠近的可能。 5‘剪接点(左剪接点、供体位点 ): 内含子上游 的剪接点3‘剪接点(右剪接点、受体位点): 内含子下游的 剪接点 分枝位点 : 位于 5? 和 3‘ 剪接点之间的短序列 (UACUAAC) 选择性剪接(Alternative splicing) 当断裂基因转录成 RNA 后,经剪接产生单一类 型的 mRNA 有些基因的 RNA 能进行选择性剪接,即一种基 因能产生多种 mRNA: ?否而被包含或被剔除于 RNA 产物中.? 某些外 显子可能通过改变一个剪接位点进行可变 1、内含子的 5‘端切开，右侧内含子中保守序列 中分枝位点的 A 残基攻击内含子的 5‘端形成一 索套状的尾环分子， 2、内含子在 3‘剪接点的 AG 中的 G 之后，发 生剪切，随后两外显子连接 3、内含子的索套被切开，形成线状后降解。 剪接还与 mRNA 出核有关 4、snRNA 的剪接作用 真核 mRNA 的正确拼接和 snRNA 有关，称剪 切因子。核中称 snRNA，质中称 scRNA。和蛋 白质结合后，核中称 snRNP，质中称 scRNP。 snRNP 有 U1,U2,U4,U5,U6。 多种 snRNP 中， 仅 U1 的 5`端序列与 mRNA 前 体的 5‘端拼接点序列互补。 随后， U2,U4,U5,U6 结合成复合体，内含子形成环状，使外显子的 3‘和 5‘接近而进行剪接。snRNA 是剪接必需的 三、真核生物细胞中 RNA 的转运 细菌 mRNA 通常不稳定，通常在几分钟内翻 译成蛋白质。 在真核生物细胞中，mRNA 的合成与成熟是在 细胞核内发生的，然后 mRNA 才能运输到细胞 质，在细胞质内由核糖体翻译。mRNA 也相对 稳定，能连续翻译好几个小时。 RNA 以核糖核蛋白颗粒形式跨膜转运 所有在细胞质中起作用的 RNA 都要从细胞核 内转运出来 tRNA 和核酸酶的 RNA 组分被转运入线粒体 mRNA 在植物细胞之间能够被长距离转运，转 运的 RNA 需要蛋白质包裹 rRNA 和核糖核蛋白一起被组装成不成熟的核 糖体亚基，它是转运系统的底物 tRNA 被一种特殊的蛋白质系统转运（转运蛋 白） mRNA 以核糖体核蛋白形式被转运，这个结构 以 RNA 转录物为基础，在细胞核形成。 一些 RNA 在细胞核中产生，被转运至细胞质， 然后又被转运进线粒体。 mRNA 能够被特异性地定位 细胞质是个非常拥挤的地方，被高浓度蛋白质 所占据。 大多数 mRNA 可能在随机的位置里翻译，这取 决于它们进行细胞质的位置及移动的距离。 四、mRNA 的降解 细菌 mRNA 的降解与多种酶有关 降解方向大多为 5‘-3‘ 降解由两部分组成： 核酸外内酶的切割 以及核内切酶对这些片段从 3‘-5‘方向的降解 mRNA 两端的修饰防止它被核酸外切酶降解 mRNA 中的特异序列可影响它的稳定性 / 非稳 定性 poly(A)的缺失可能引发非稳定性 mRNA 的稳 定性依赖于其结构和序列： mRNA 的降解和多种活动有关 帽子和 poly(A)的移除 5‘-3?快速降解 无义突变触发 mRNA 降解 第六节反转录一种依赖于 RNA 的 DNA 聚合酶， 后来在 RNA 肿瘤病毒都有反转录酶。这些病毒称为还原病 毒。 第六章翻译 Translation(Protein synthesis) 由 RNA 参与的蛋白质生物合成的过程,将核苷 酸序列转变为氨基酸序列. 参与翻译的物质: mRNA: 作为翻译的模板 RNA: 转运氨基酸 核糖体：由 rRNA 与多种蛋白质组成，作为翻 译的场所 翻译因子 氨基酸 第一节遗传密码 ? Genetic code: 是联系核酸碱基序列和蛋白质 氨基酸序列的途径 一、 密码子(Codon): 以 mRNA 上三个碱基代表 一种氨基酸，也称为三联体密码子: ? 简并性: 64 种密码子---20 种氨基酸 ? 连续性 ? 通用性 密码子是否编码氨基酸是由与之相应的 tRNA 所决定的，终止密码子的识别则是由蛋白质因 子直接决定的。 ? 同义密码子（synonym)：编码同一氨基酸的 所有不同的密码子同义密码子的频率和其相对 应的氨基酸在蛋白质中的出现频率无关 (第三位碱基的简并性）无义密码子：无具体氨 基酸携带功能的三联体，也称为终止密码子 (UAA, UAG, UGA 二、密码子和反密码子的相互作用 反密码子 （Anticodon） ： 氨酰-tRNA 上与密码子 相配对的序列。 密码子和反密码子间的正确识别是遗传信息正 确传递的特征： 密码子 5?ACG3‘ 反密码子 3?UGC5‘ 通常写成密码子 ACG/CGU,反密码子以反方向 阅读 生物体内 tRNA 的种类少而编码氨基酸的密码 子多 （61） ： tRNA 上的反密码子识别多种密码 C 子 摆动假说：密码子的前两个碱基（ 5‘）与反密 码子配对，遵循严格的碱基配对原则，而第 C3 位（3‘）的碱基则有一定的灵活性。 解释简并性 摆动现象的产生的原因是 tRNA 反密码子环的 构象容许反密码子第一位碱基有一定的可变 性。 三、密码子的使用频率（偏爱性） ，同义密码子 的使用频率不等 四、密码子在某些物种可能发生变化 主要在线粒体中，核基因组中的变化通常是影 响终止密码子 第二节 tRNA 一、tRNA 的结构： ? tRNA 由 74-95 个碱基组成,都有共同的二级和 三级结构, 即互补的碱基形成单链颈环结构,即 4 个恒定臂. ? 在 tRNA 一级结构中有 15 个核苷酸是恒定 的，8 个位置的核苷酸是半恒定的。 二级结构：三叶草状 ? 接受臂 ?T C臂 ? 双氢尿嘧啶(D)臂 ? 反密码子臂 ? 额外臂: 3-21nt 同工 tRNA (isoaccepting tRNA) 99 ? 携带相同氨基酸但反密码子不同的一组 tRNA，其结构有别 ? 甚至携带相同氨基酸但反密码子也相同的 tRNA， 其结构有时也有差别,因由不同基因编码 ? 可将 tRNA 分为 20 个同工 tRNA 组 tRNA 的命名 ? 所携带的氨基酸的三字母缩写为上标： 携带酪氨酸的 tRNA： tRNATyr tRNA1Tyr， tRNA2Tyr ? 已氨酰化的 tRNA：Ala-tRNA 二、tRNA 的丰富度 ? 细胞内 tRNA 的含量为 tRNA 丰富度。 ? 密码子的使用频率与细胞内 tRNA 的含量呈 正相关，同工 tRNA 密码子使用频率最高 ? 细胞能以更快速度合成需要量大的蛋白质， 而需要量小的蛋白质基因，尽管存在较多的密 码子，但 tRNA 少，合成也就少，达到控制蛋 白质合成。 三、氨酰-tRNA 的合成 ? tRNA 必须携带与其相反密码子对应的氨基酸 （即形成氨酰-tRNA）时才能发挥功能 ? 氨酰-tRNA 的产生由氨酰-tRNA 合成酶以氨 基酸、 tRNA、 ATP 为底物在 tRNA 3‘端碱基 （A） 的 2‘或 3‘羟基上形成酯键，催化合成如下： 氨酰-tRNA 合成酶的三个结合位点： ? 氨基酸结合位点 ? ATP 结合位点 ? tRNA 结合位点 氨酰基 tRNA 合成酶 ? 氨酰-tRNA 合成酶所催化的反应特异，一种 酶只能识别一种氨基酸和该氨基酸的几种同工 tRNA。 ? 生物体中有 20 种氨酰-tRNA 合成酶，分子量 相差很大，同源性差。 ? 氨酰-tRNA 合成酶有α 、α 2、α 4 和α 2 β 2 等单体、 二聚体和四聚体类型， 多肽长度从 334 个氨基酸到 1000 个氨基酸不等， 酶的变化就是 通过亚基的种类、多少和链的长短来实现 ? 根据序列和结构的相似性，氨酰-tRNA 合成 酶分为 I 型和 II 型: I 型：具有 N 端催化结构域，含有 2 段部 分保守的短氨基酸序列，反密码子结合结构域 位于 C 端， II 型：反密码子结合结构域位于 N 端 氨酰-tRNA 合成酶与 tRNA 的结合 ? 氨酰-tRNA 合成酶与 L 形 tRNA 的内侧面结 合，结合点包括氨基酸接受臂、D 臂和反密码 子臂, tRNA 的结合主要发生在两端，tRNA 的 大部分序列与合成酶的识别无关。 ? 丙氨酸 tRNA 在 G3:G70 这一位置的碱基对变 化，就影响了丙氨酸的接载，表明合成酶识别 细胞内多种形状相同的不同 tRNA 分子主要依 靠 tRNA 分子本身的某些碱基对。 第一类合成酶(多聚体分子中有聚合区域）, 在 一端识别接受茎, 另一端识别反密码子环 ? tRNA 两个重要位点与酶的接触导致了 tRNA 的结构改变。 表明 tRNA 中 U35、 G73 或 U1-A72 碱基变化影响合成酶对 tRNA 的识别。 ? 合成酶和 tRNA 通过氢键结合。 第二类合成酶(多聚体分子中没有聚合区域） ， 在一端识别可变环和接受茎，接受茎的螺旋结 构没有变化，反密码子环构象变化 氨酰-tRNA 合成酶与 tRNA 错接的校正： ? 每种合成酶必须从 20 种氨基酸中辨别 1 种。 ? 构象校对：酶检查结合的 tRNA，如是正确， 则酶的构象发生变化使结合更稳定，使氨酰基 腺苷酸迅速形成。如是错误的，酶的构象不变 化，结果反应很慢，容易使 tRNA 被连接到氨基酸之前从酶上解离。又称动力学校对。 ? 化学校对：错误的氨基酸已连接到 tRNA 上， 被合成酶的 tRNA 结合位点所发现而水解 四、型抑制 tRNA ? 有些 tRNA 的突变， 特别 tRNA 中反密码子的 突变，可以抑制基因突变的产生，即通过突变 的反密码子来识别突变的基因，这类 tRNA 为 抑制型 tRNA。 ? 机理：mRNA 分子上密码子的突变导致编码 氨基酸变化，而 tRNA 反密码子的突变能使其 识别突变的密码子，但氨基酸不发生变化，后 一突变为前一突变的抑制突变。 抑制型 tRNA 在翻译中的可能作用： 通读现象：无义突变抑制 tRNA 可识别正常的 终止密码子，而产生通读。 丧失原功能：错义突变 tRNA 能识别正常和突 变的密码子，当识别正常密码子时就使该密码 子的原功能丧失。 竞争性；在抑制突变体中，密码子可被抑制型 tRNA 识别， 也可被正常 tRNA 识别， 存在竞争， 其竞争程度会影响突变抑制的效应，取决于反 密码子与靶密码子的亲和力，它在细胞中的浓 度等。若只有一种 tRNA，则此 tRNA 引起的突 变将是致死的。 无义抑制突变： ? 无义突变：密码子变为终止密码子而使翻译 提前终止。 ? tRNA 反密码子突变后可识别终止密码子，使 翻译通过无义突变而继续进行。 ? 无义抑制突变的类型 C UAA 赭石型（Ochre） C UAG 琥珀型（Amber） C UGA 乳石型（Opal） 琥珀型抑制子都具有 CUA,都是从野生型 tRNA 突变而来，每个抑制子都识别 UAG，插入的氨 基酸是 Ser,Gln,Tyr 等。 携带 Tyr 的反密码子 AUG 突变为 AUC 而识别 终止密码子 UAG,翻译正常进行 ? 通读现象：无义突变抑制 tRNA 可识别正常 的终止密码子，而产生通读。 错义抑制突变： 错义抑制型 tRNA 的突变是由编码 tRNA 反密 码子区段的点突变产生。携带的氨基酸不变。 Gly 的密码子 GGA 突变为 AGA,编码 Arg,翻译 产物中有 Arg 携带 Gly 的反密码子 CCU 突变为 UCU,识别突 变的 AGA 密码子,翻译正常进行 第三节核糖体(Ribosome) 核糖体是翻译进行的场所，提供蛋白质合成所 需的各种生物活性 核糖体是细胞中的重要器官，在一细菌中约有 2 万个，其蛋白成分占细菌总蛋白的 10%左右， 而 RNA 占总 RNA 的 80%左右；真核细胞中相 对比例小一些，但绝对量更大 细菌中，核糖体与 mRNA 相连，而 mRNA 与 DNA 相连； 真核细胞中的核糖体与内质网等相 连。 核糖体由大小两个亚基组成， 组成成分为 rRNA 和蛋白质， 每一类 RNA 和蛋白质都只有一个拷 贝 核糖体在蛋白质翻译中的功能：可不断被循环 使用 一、结构和组成 核糖体中蛋白质、 rRNA 和其它辅助因子整合后 才发挥功能，单独存在时无功能 原核生物的 5s rRNA 和真核 5.8s rRNA 有许多 配对的碱基。其序列高度保守，研究生物的进 化，可根据它们的碱基序列差异来推算进化的10 年代。 3、70S 起始复合物形成： 细胞器核糖体与细胞质中的核糖体存在明显差 50S 亚基和 30S 起始复合物结合产生 70S 起始 异，并具有不同形式。 复合物 二、核糖体的装配 IF1，IF2，IF3 释放，GTP 水解 ? E.coli 30S 核糖体的亚基装配：16s 和 15 种蛋 核糖体上的 P、A 位点处的正确状态，P 位被起 白在低温下产生 R1 颗粒，温度提高到 40℃时， 始 tRNA 占据。A 位点接受新的与其密码子相 R1 改变结构成为 21s 颗粒，再加入 6 种蛋白， 配的 tRNA 。每个核糖体占据 30 个碱基的 mRNA 成为 30s 亚基 二、延伸 三、核糖体的活性位点 ? mRNA 结合位点：与 mRNA 的初始结合和与 ? 延伸以氨酰-tRNA 进入 70S 起始复合物 A 位 为标志。 起始 tRNA 结合 ? P 位点（肽酰基位点） ：与起始 tRNA（fmet- ? 延伸分为三个过程： C 氨酰-tRNA 的转运 tRNA）结合，是延伸肽链所在处 ? A 位点（氨酰基位点） ： 氨酰-tRNA 结合位点 C 肽键的形成 C 易位 ? 肽基转移酶活性位点：与肽键形成有关 1、氨酰-tRNA 的转运和密码识别： ? 5SrRNA 位点：与 tRNA 的进入有关 ? 氨酰-tRNA 进入 A 位需延伸因子 EF-Tu ， ? EF-Tu 位点：与肽链的延伸有关 EF-Ts ? EF-G 结合位点：与 tRNA 的转位有关 ? 产生有活性的 AA-tRNA-GTP-EF-Tu 复合体 第四节原核生物的翻译过程 才能 ? 蛋白质合成过程可分为三步： 转运。 C 起始：核糖体在 mRNA 分子上的组装 ? AA-tRNA-GTP-EF-Tu 复合体因没有 IF2，不 C 延伸：氨基酸添加的重复循环 能和起始密码子结合，该复合物只能进入 A 位 C 终止：新生多肽链的释放 点，GTP 水解而释放出无活性的 EF-Tu-GDP ? 翻译速度：37? C 条件下 15aa/sec 2、转肽反应： ? 研究翻译过程方法：体外翻译系统 P 位 tRNA 上的肽链转到 A 位的 tRNA 上, P 位 ? 蛋白质合成过程： tRNA 成为空载，由 50S 亚基的肽键转移酶催 C 起始－核糖体在 mRNA 分子上的组装 化，无需能量 C 延伸－氨基酸添加的重复循环 3、易位： C 终止－新生多肽链的释放 ? 转肽完成后，在延伸因子 EF-G、GTP 的作用 一、起始 起始：核糖体大小亚基、tRNA 和 mRNA 在起 下，核糖体沿 mRNA 向前移动一个密码子（5‘ ， 这一过程为易位， 同时又将 E 位的 tRNA 始因子（initiation factor,IF）作用下组装成 70S →3‘） 逐出核糖体，这样核糖体中原来 A 位的 tRNA 起始复合物的过程： 移至 P 位， A 位空缺等待下一个氨酰 -tRNA 的 IF1 与游离的 30S 亚基结合，位于 A 位，阻止 进入。 氨酰-tRNA 进入，也阻止 30S 和 50S 结合。 IF2 参与特定起始 tRNA 的结合， 并控制它进入 核糖体易位首先是 50S 亚基相对于 30S 有一易 位， 然后 30S 亚基和 mRNA 一起易位而使核糖 核糖体 体构象复位。 IF3 稳定游离的 30S 亚基，使其不和大亚基结 EF-Tu 和 EF-G 不同时与核糖体结合， 两者交替 合；促进 30S 亚基与 mRNA 结合， 与核糖体结合和释放 1、30S 亚基与 mRNA 结合： ? mRNA 与 30S 亚基结合需 mRNA 与 16s rRNA 三、终止 间的碱基配对， 在 mRNA AUG 上游 8～13 个碱 ? 通常没有 tRNA 分子能够识别终止密码子， 基处有 S-D(Shins-Dalgarme) 序列。 一致序列为 而是由释放因子（RF）与终止密码子作用，使 AGGAGG， 而 16s rRNA 的 3′端存在与之相互 新生多肽链释放： 补的保守序列 CCUCCU。从而保证配对，产生 C RF1：识别 UAA 和 UAG C RF2 ：识别 UAA 和 UGA 起始复合物（30S-IF3-mRNA） 。 C RF3：激活 RF1 和 RF2 的活性 ? IF1 和 IF3 与游离的 30S 亚基结合， ? 终止密码子的使用频率：UAAUGAUAG ? IF2-GTP 复合体结合到小亚基上。 ? 第一个氨基酸的 tRNA（起始 tRNA) 与起始 第五节真核生物的蛋白质合成 复合物中 mRNA 链上起始密码子结合，产生 ? 蛋白质合成过程基本同原核，但有起始因子 （eIF）的起始阶段和起始密码子的扫描过程。 30S 起始复合体 ? 真核的翻译起始用到的起始因子（eIF）至少 ? 50S 亚基结合 有 9 种，多数的功能仍需进一步研究。 2、起始复合物与起始 tRNA 的结合： 一、起始： ? IF1 和 IF3 与游离的 30S 亚基结合， 1. 80S 核糖体的解离： ? IF2-GTP 复合体结合到小亚基上。 ? 第一个氨基酸的 tRNA（起始 tRNA) 与起始 60S 和 40S 亚基处于动态平衡 复合物中 mRNA 链上起始密码子结合，产生 ? 40S 亚基和 eIF3 结合形成新的 40S 亚基，而 干扰了 40S 和 60S 亚基的结合，eIF4C 对 40S 30S 起始复合体 亚基由稳定作用，eIF6A 和 60S 亚基结合使其 ? 50S 亚基结合 ? 所有蛋白质的合成由同一氨基酸（甲硫氨酸） 不和 40S 亚基结合 2、元复合物和三 43S 起始复合物形成： 开始，其合成的起始信号通常为 AUG。 fMet-tRNA ? 细菌中也有可能是 GUG 或 UUG，真核起始 ? fMet-tRNA 识别起始密码子 AUG， 与 GTP 、 eIF2 形成三元复合物，而后和 40S 亚 密码子只使用 AUG，其它不用。三种起始密码 基结合产生 43S 起始复合物。 这里， eIF-2-GTP 子的起始效率不同： 介导了起始 tRNA 与 40S 亚基的结合， 然后 AUGGUGUUG ? 有 2 种 tRNA 能携带 AUG 代表的甲硫氨酸： eIF-2-GDP 通过 eIF-2B（鸟苷酸释放蛋白）再 甲酰化的甲硫氨酸 tRNA （fmet-tRNA） ： 用于起 生。 起始因子与 mRNA 结合： 始甲硫氨酸 tRNA（met-tRNA） ：用于延伸 10? 由 eIF4E(结合 5?端甲基化帽子） ， eIF4G（骨 架蛋白） 、 eIF4A （ 解旋酶） 、 eIF4B 在 ATP 作用下与 mRNA 结合， eIF4E 识别 mRNA 的 5‘帽子，解开 5‘ 非翻译区的二级结构。 3、43S 起始复合物与 mRNA 结合形成 48S 起 始复合物： 4、起始密码子 AUG 的选择（扫描过程） ： ? 48S 亚基与 mRNA 结合不能保证 fmet-tRNA 正好与 AUG 配对，AUG 一般位于帽子结构下 游 50～100 核苷酸的位置，此时 43S 起始复合 物由帽子结构处沿 5‘非翻译区移动扫描起始密 码子。 5、48s 起始复合物与 60S 亚基结合： ? 48S 起始复合物在 AUG 处正确定位后， 在 eIF5 的置换作用下，eIF2-GTP 水解为 eIF2-GDP， eIF-2，eIF-3，eIF-4A，eIF-4B，eIF4F 起始因子从 48S 起始复合物上解离出来。 60S 大亚基上的 eIF-6 已经被释放。 ? 60S 亚基和 40S 亚基结合形成 80S 起始复合 物。 二、延伸： ? 延伸因子 1（eEF1 ） ： 负责氨酰-tRNA 转运 至核糖体，有?、β 、?、γ 等类别： C eEF1α ： 负责和氨酰-tRNA 结合， eEF1α -GDP 转为 eEF1α -GTP 才有活性。 eIF1α 在衰老过程 中活性下降，可能是翻译忠实性的下降所致。 C eEF1β ：具有核苷酸交换活性，加速 eEF1α -GDP 转 化 为 eEF1 α -GTP 。 类 似 于 原 核 的 EF-Ts。 C eEF1γ ：具有增强α 亚基}