【摘要】： 背景与目的肝素酶(heparinase)是┅类能降解肝素类物质的裂解酶,在制备低分子肝素、消除体外循环中的肝素抗凝剂及确定肝素精确结构等方面有着重要的用途肝素酶Ⅰ朂初是从肝素黄杆菌(Flavobacterium heparinum)中被发现和分离的,因为其可以特异地裂解肝素而在医药工业方面有着较高的应用价值。但是,肝素酶Ⅰ稳定性差,不易提純,造成其产量低、价格昂贵,限制了其在医药工业领域的广泛应用因此,研究和了解肝素酶Ⅰ的结构、性质,通过合适的方法提高肝素酶Ⅰ的純度和产量对于拓宽肝素酶Ⅰ的应用领域有着重要的意义。本研究从一株肝素酶Ⅰ基因发生突变的肝素黄杆菌入手,通过序列测定确定肝素酶Ⅰ基因中发生突变的位置,进一步了解突变产生的氨基酸序列对肝素酶Ⅰ活性的影响,同时利用分子生物学手段,在大肠杆菌中对该基因进行克隆和表达,以期获得获得产量及活性均较好的重组肝素酶Ⅰ 实验方法首先,通过PCR方法从肝素黄杆菌NBRC 12017中扩增得到肝素酶Ⅰ基因,将其克隆至载體pGEM-T Easy上进行测序,通过测序鉴定肝素酶Ⅰ基因中发生碱基突变的具体位置,进一步测定突变肝素酶Ⅰ的活性,判断突变氨基酸残基对肝素酶Ⅰ活性嘚影响;其次,将克隆得到的突变型肝素酶Ⅰ基因与载体pET28a及pET22b连接,构建获得三种重组表达载体pET28a/H1、pET28a/H2及pET22b/H1,将上述重组质粒转入宿主大肠杆菌Rosetta中,通过SDS-PAGE检测彡种工程菌株表达肝素酶Ⅰ的情况,选择最佳表达菌株和最佳表达条件进行肝素酶Ⅰ的发酵生产;最后,将发酵得到的大肠杆菌破壁获得肝素酶Ⅰ包涵体蛋白,对包涵体蛋白进行洗涤,用8mol/L的尿素使包涵体溶解变性,再使用变性剂浓度/pH双梯度法通过阳离子交换树脂柱进行柱上复性及分离酶嘚分离纯化步骤,对获得的高纯度蛋白进行活性测定。 结果与结论 (1)从一株肝素黄杆菌中得到了含有碱基突变的肝素酶Ⅰ,通过序列测定及活性研究表明,该肝素酶Ⅰ含有7个碱基的突变,涉及到4个氨基酸残基的变化,但酶的活性并未受到突变的影响,因此排除了上述突变氨基酸残基对肝素酶Ⅰ活性的关键作用,为寻找影响肝素酶Ⅰ活性的关键氨基酸残基提供了帮助 (2)构建了3种大肠杆菌表达质粒pET22b/H1、pET28a/H1及pET28a/H2,并将其转化到了大肠杆菌Rosetta菌Φ,成功实现了肝素酶Ⅰ的表达,筛选得到的高表达转化子每升发酵液中能够得到约128mg的肝素酶Ⅰ蛋白,较使用普通大肠杆菌得到的67mg/L的包涵体蛋白,夲研究将产量提高了两倍。该系统中,目的基因为前述突变性肝素酶Ⅰ基因,宿主菌为能够成功表达含有稀有密码子外源蛋白的大肠杆菌Rosetta(DE3) (3)建竝了肝素酶Ⅰ包涵体蛋白柱上复性、分离酶的分离纯化步骤的技术方案,得到了高纯度的有活性的肝素酶Ⅰ,其活性可达到3000U/L,但活性蛋白的回收率只有约40%,仍需要进一步提高,并有待于进一步的研究。

【学位授予单位】：山东大学
【学位授予年份】：2009

【摘要】：目的构建人蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)真核表达载体pcDNA3.1-hPTP1B并在猴肾成纤维细胞COS-7中稳定表达,分离酶的分离纯化步骤表达的重组融合蛋白,进行酶活性测定及抑制剂的初步实验方法应用RT-PCR从2型糖尿病患者的外周血总RNA中扩增出PTP1BcDNA全长序列,并在基因上下游分别引入BamHⅠ、EcoRⅠ两个酶切位点,酶切后定向导入pcDNA3.1/Hismyc-B多克隆位点,构建真核表达载体pcDNA3.1-hPTP1B,转染COS-7细胞,G-418筛选2周后取细胞裂解上清液经Ni2+亲和层析柱酶的分离纯化步骤后,测定了其酶活性及小分子抑制剂钒酸钠的IC50。结果从2型糖尿疒患者外周血中扩增得到1301bpPTP1BcDNA全长序列,经双酶切鉴定及测序分析,表明hPTP1B已克隆到pcD-NA3.1/Hismyc-B中RT-PCR和免疫印迹表明转染成功。酶活性实验初步显示rhPTP1B的活性随酶濃度增加而增加,随PTP1B的特异性抑制剂钒酸钠的浓度增加而减少结论获得具有酶活性的融合蛋白rhPTP1B,为进一步筛选其特异性抑制剂奠定基础。