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HIS标签亲和纯化实验步骤
His标签是目前蛋白表达中最常用的标签，而且很成熟，它的优点是表达方便而且基本不影响蛋白的活性，无论是表达的蛋白是可溶性的或者包涵体都可以用固定金属离子亲和色谱去（IMAC）进行。
Ni柱的选择
镍离子有六个螯合价位，Ni-NTA螯合了四价，剩余两价；而Ni-IDA螯合三价，剩余三价。因此Ni-IDA结合作用力要比Ni-NTA 强，在同样条件下Ni-IDA 的载量要比Ni-NTA高，而且洗脱杂质和目标蛋白所用的缓冲液中咪唑浓度更高；但Ni-NTA更稳定，耐受更强的还原剂，镍离子更不易脱落。
样品的处理对纯化是很重要的，重要的原则是破碎要温和，不能使蛋白断裂或者降解，否则一些片段同样也带有标签，这样增加了纯化的难度。需要注意的问题是超声破碎温度，强度，时间。
his标签亲和纯化
可溶性蛋白的破碎
收集培养发酵液，20℃，5000rpm离心8分钟，沉淀转移到离心管中，10℃，13000rpm离心1分钟，收集沉淀的菌体(如果不是马上破碎可以放-20度冷冻。)
取8-10克菌体加40-50ml破碎缓冲液（例：20mM Tris，pH8.0，0.15M NaCl，1%Triton X-100，pH8.0）。加入Leupeptin与Pepstantin终浓度1ug/ml，加入TCEP终浓度1mM/ml。
把混合菌体在冰水中用超声探头破碎，超声3S，间隔8S。超声15-20Min。（超声完全的判断：溶液中有无块状物，溶液的黏稠度）
破碎的液4℃13000rpm离心10分钟，取上清，再次4℃13000rpm离心10分钟，然后把上清和沉淀分别留样，先做上清纯化，如果只沉淀中有目标蛋白，那就用变性条件下去提取。
取纯化Ni柱，清洗干净柱子，加入3-4ml镍琼脂糖凝胶，用洗瓶清洗柱子5次，再用平衡液平衡柱子2次（PS：平衡液即破碎液，但不含有Triton X-100。）
将柱子和上清充分结合，放置四维旋转混匀器上孵育1-2h后拿出纯化
可溶性蛋白的纯化
平衡缓冲液：pH8.0的50mM Tris缓冲液含0.15M NaCl，含20mM咪唑。
洗脱缓冲液：① pH8.0的50mM Tris缓冲液含0.15M NaCl，含50mM咪唑。
② pH8.0的50mM Tris缓冲液含0.15M NaCl，含100mM咪唑。
③ pH8.0的50mM Tris缓冲液含0.15M NaCl，含300mM咪唑。
过柱，流出FT，取样FT。
用20倍柱体积平衡缓冲液洗去未吸附的样品，流速1-2ml/min，直到流出液点样G250显示无蓝色是开始洗脱柱子上吸附的蛋白。
用50mM,100mM,300mM咪唑浓度分阶段洗脱柱子，洗脱5-10个柱体积左右（PS：蛋白吸附较多，则用多的洗脱液洗脱。），流速1-2ml/min，4ml/管收集。（收集蛋白起点的确定：紫外分光光度的示数上升较快、考马斯亮蓝G250点样确定变蓝色；收集蛋白终点的确定：考马斯亮蓝G250点样无明显蓝色，紫外分光光度示数下降平稳。）
将收集的各浓度梯度洗脱下来的蛋白，取样，跑SDS-Page。
根据SDS-Page电泳图，若有蛋白，则收集蛋白进行透析，若电泳结果无蛋白，而沉淀中有蛋白，则用变性条件下洗沉淀，做沉淀纯化。
包涵体破碎
1、大肠杆菌的破碎方法：
1） 收集培养发酵液，20℃，5000rpm离心8分钟，沉淀转移到离心管中，13000rpm，10℃，收集沉淀的菌体(如果不是马上破碎可以放-20度冷冻。）
2） 取5-10克菌体加40-50ml破碎缓冲液（50mM Tris， pH8.0，0.15M NaCl，1%Triton X-100，pH8.0）加入Leupeptin与Pepstantin终浓度1ug/ml，加入TCEP终浓度1mM/ml。
3） 把混合菌体在冰水中用超声探头破碎，超声3S，间隔8S。超声15-20Min。（超声完全的判断：溶液中有无块状物，溶液的黏稠度）
4） 破碎的液4℃13000rpm离心20分钟，然后把上清和沉淀分别留样，取沉淀。
5） 沉淀加入再次破碎缓冲液（ pH8.0，50mM Tris，2mM EDTA，150mM NaCl，20mM咪唑，1% Triton X-100。）把混合菌体在冰水中用超声探头破碎，超声3S，间隔8S。超声15-20Min。
6） 破碎的液4℃13000rpm离心20分钟，取沉淀。（PS:沉淀中不能含有溶液，所以必须要倒干净。）
7） 破碎离心的沉淀先加缓冲液（20mM咪唑，20mMTris，pH8.0）1ml溶解沉淀，加变性溶液（ pH8.0的50mMTris缓冲液含0.15 NaCl，8M脲）。(加入溶液比例，1g沉淀加入溶液4-5ml。)
8） 把混合菌体在冰水中用超声探头破碎，超声3S，间隔8S。超声10Min。
9） 破碎的液4℃13000rpm离心10分钟，取上清，再次4度13000rpm离心10分钟，取上清。
10） 在做可溶性蛋白纯化时，沉淀中有，但是上清没有的情况下，取沉淀，直接从（5）步骤往下操作。
包涵体蛋白的纯化
平衡缓冲液：pH8.0的50mM Tris缓冲液含0.05M NaCl，8M脲。
洗脱缓冲液：①pH8.0的50mM Tris缓冲液含0.05M NaCl，8M脲，含20mM咪唑
②pH8.0的50mM Tris缓冲液含0.05M NaCl，8M脲，含50mM咪唑
③pH8.0的50mM Tris缓冲液含0.05M NaCl，8M脲，含100mM咪唑
④pH8.0的50mM Tris缓冲液含0.05M NaCl，8M脲，含300mM咪唑
⑤pH8.0的50mM Tris缓冲液含0.05M NaCl，8M脲，含500mM咪唑。
取3-4ml镍琼脂糖凝胶FF，用洗瓶清水洗清柱子5次，用50ml平衡缓冲液平衡。
将柱子和上清充分结合，放置四维旋转混匀器上孵育1-2h后拿出纯化。
过柱，流出FT。
用20倍柱体积平衡缓冲液洗去未吸附的样品，流速1-2ml/min，直到流出液，点样G250显示无蓝色是开始洗脱柱子上吸附的蛋白。
用20mM,50mM,100mM,300mM咪唑浓度分阶段洗脱柱子，洗脱5-10个柱体积左右（PS：蛋白吸附较多，则用多的洗脱液洗脱。），流速1-2ml/min，4ml/管收集。（收集蛋白起点的确定：紫外分光光度的示数上升较快、考马斯亮蓝G250点样确定变蓝色；收集蛋白终点的确定：考马斯亮蓝G250点样无明显蓝色，紫外分光光度示数下降平稳。）
将收集的各浓度梯度洗脱下来的蛋白，取样，跑SDS-Page。
根据SDS-Page电泳图获取目标蛋白所在咪唑浓度梯度，收集蛋白，透析获的目标蛋白
常见问题及解决方案
蛋白不溶解或沉淀在柱子上：要留意缓冲液体的pH，根据蛋白的PI值确定缓冲液和洗脱液的pH值，通过增加盐浓度，避免蛋白的非特异性吸附，蛋白洗脱时在柱中沉淀 ，变性条件下进行洗脱。以在离心管中结合、洗脱的小量批次方式进行纯化，以避免局部蛋白浓度过高。
蛋白不吸附：这是最常见的，通常的原因有①是标签不暴露，被折叠在蛋白的结构内，可以在变性的条件下去纯化，②可以选择作用力更强，配基密度更高的填料，通常镍琼脂糖凝胶作用力最强，如果蛋白分子量大可以选择手臂长的填料，如镍NTA琼脂糖凝胶，填料的好坏可以看填料的颜色，颜色越深那配基密度越高，作用力也相应要强。③样品的pH过低或者沉淀导致不能吸附，所以样品和缓冲液的pH要尽量一致，避免沉淀。④加吐温可以可以降低表面张力，同时也可以降低疏水相互作用力了，使蛋白不会因为别的作用力而被吸附到柱子上，同时增强了洗脱能力。⑤ 缓冲液条件不正确，检查漂洗缓冲液的pH值和组成，确保体系中不含鳌合剂及还原剂。
难洗脱：如果穿透中目标蛋白明显减少，而洗脱又没有，取点填料加电泳缓冲液煮后离心跑电泳还是有目标蛋白，可以用更强的洗脱条件如500mM咪唑，如果还不能洗脱，可以直接用500mM咪唑加8M脲去洗脱。
目的蛋白与杂蛋白一起洗脱出来：①色谱柱载量相对过大，减少Ni-NTA树脂或Ni-IDA树脂用量；②杂蛋白与目的蛋白结合，共纯化下来，加大漂洗缓冲液的盐浓度，或增加去污剂浓度，加入乙醇/甘油以破坏蛋白之间的疏水作用。
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& His标签蛋白纯化工具推荐
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His标签蛋白纯化工具推荐　　阅读(75)
&His标签蛋白纯化工具&在大肠杆菌和别的原核系统中表达的多组氨酸标签重组蛋白一般运用固定的金属离子亲和色谱来纯化或称为 IMAC. 在这个进程中，支撑物 (一般是珠状琼脂糖凝胶或磁珠颗粒) 用适宜的耦合试剂来进行衍生，比方氨三乙酸 nitrilotriacetic acid (NTA) 或亚氨乙酸 iminodiacetic acid (IDA). 这些螯合的基团会固定所需求的二价金属离子 (比方镍，铜，钴和锌)，然后这些金属离子最后担任联系和别离混合液蛋白中的目标分子。在挑选运用哪个配基上，你需要考虑 IMAC 树脂的结合能力主要取决于被纯化蛋白的性质和在纯化进程中所运用的金属离子。&NTA，IDA，IMCA形式的His标签纯化填料或者预装柱产品，高效纯化His标签融合蛋白His-Tag亲和层析填料His-Tag可与多种金属离子发生特殊的相互作用，如Ca2+、Mg2+、Ni2+、Cu2+，Fe3+等，其原理是利用蛋白质表面的特性，使之被吸附在凝胶柱上，从而达到分离纯化蛋白的目的。Ni2+在亲和纯化实验中的使用最为广泛。根据结合基团的不同，Ni2+亲和层析柱可分为俩类&&Ni-IDA和Ni-NTA。Ni2+有六个螯合价位，其中Ni-IDA螯合了三价，Ni-NTA螯合了四价。所以IDA的载量要比NTA的高，在同样条件下Ni-IDA洗脱时的咪唑浓度也高于Ni-NTA。但其弱的结合力使金属离子在洗脱阶段时很容易浸出，与目的蛋白紧密结合，从而导致分离蛋白产量偏低，产品不纯及金属离子污染等问题。而NTA的颗粒粒度均匀，粒径更小，并且螯合镍更稳定，能耐受较高的还原剂，使填料更加稳定，镍离子不易脱落。His-tag作为蛋白纯化时的首选标签，其优势在于：1.&N-端的His-Tag与细菌的转录翻译机制兼容，有利于蛋白表达；2.&采用IMAC（固定化金属离子亲合层析）纯化His-Tag融合蛋白操作更加简便；3.&His-Tag对目的蛋白本身特性几乎没有影响，不会改变目的蛋白本身的可溶性和生物学功能；4.&His-Tag非常小，在融合蛋白结晶后对蛋白的结构没有影响；His-Tag的免疫原性相对较低，可将纯化的蛋白直接注射入动物体内进行免疫并制备抗体；与其它亲和标签构建成双亲和标签，并可应用于多种表达系统；His-Tag融合蛋白的适用范围也较广，既可以在非离子型表面活性剂存在的条件下纯化，也可以在变性条件下进行纯化。前者通常用来纯化疏水性强的目的蛋白，而后者则通常纯化包涵体蛋白。&IMAC在通常的情况下是比较稳定的，但螯合剂的存在则会导致其金属离子脱落。例如在E.coli的裂解液中普遍存在一些非特异的弱螯合剂，如在三羧酸循环中产生了二羧酸类物质。因此，E.coli在某些高压情况下就会产生高特异性的金属螯合剂（通常存在于细菌的细胞周质中），导致His-Tag融合蛋白纯化的纯度和产量大大降低。所以在进行纯化His-Tag融合蛋白的实验时，首先需要去除螯合剂。&PurKine& His-Tag 纯化系统基于创新的高载量IMAC基质，确保一步操作即可从总裂解液中高效纯化出His-Tag蛋白。 我们专利的金属离子螯合方案使其可兼容：还原剂（如 DTT）、螯合金属蛋白酶抑制剂（如EDTA）和大部分缓冲液底物和盐环境。 PurKine产品线具有多种形式如：自由组合：螯合基团 (IDA，NTA or Super NTA)，交联介质 (4% 或 6% 交联的琼脂糖凝胶，磁珠）,和金属离子 (Ni，Co,Cu,无金属IMAC) ，专利的的组装螯合配方，保证了His标签蛋白质的最大产量，稳定性以及可溶性。&Fig. 1. His标签重组蛋白纯 化结果。PurKine& His-Tag Ni-NTA Resin 4FF (Lane B)&；其它品牌的对应的纯化产品 (Lane C)&&PurKine& His-Tag的纯化填料也可以以预装柱和试剂盒的形式提供，使用更加便捷。此外，还有琼脂糖凝胶树脂填料和磁珠形式。产品名称&产品形式货号&PurKine& His-Tag Ni-IDA Resin &&&&&Agarose ResinBMR20000PurKine& His-Tag Ni-NTA Resin &Agarose ResinBMR20010PurKine& His-Tag Ni-NTA Packed Column &&Packed ColumnBBMC20010PurKine& His-Tag Protein Purification Kit (Ni-NTA) &&&&Kit (Agarose Resin)KTP20010PurKine& His-Tag Ni-NTA Resin 6FF &&&&Agarose ResinBMR20016PurKine& His-Tag Ni-NTA Packed Column 6FF &Packed ColumnBMC20016PurKine& His-Tag Cu-IDA Resin &&&&&Agarose ResinBMR20040PurKine& His-Tag Co-NTA Resin &&&&Agarose ResinBMR20050PurKine& His-Tag Co-NTA Resin 6FFAgarose ResinBMR20056PurKine& His-Tag IMAC-NTA Resin 6FFAgarose ResinBMR20036PurKine& His-Tag Ni-NTA MagbeadsAgarose MagbeadsBMR20010&&PurKine& His-Tag Ni-Super Resin 是 Ni-NTA Resin 的卓越替代品，比起NTA，Ni-Super 与 Ni 有更紧致结合构象，螯合更加稳定，能更高限度的兼容各类化学物质，比如还原剂、螯合剂。PurKine? His-Tag Ni-Super Resin特别适用于含有 会引起Ni离子脱落介质的样品中的His-Tag蛋白的纯化，比如含有螯合剂的分泌蛋白样品溶液。此外，它还具有高流速的特 性，适合用于蛋白质的大规模纯化。&Fig.2. PurKine? His-Tag Ni-Super Resin能够兼容多种的化学物 质：0.01M HCl (Lane C) ，0.01M NaCl (Lane D)&Fig.3. PurKine? His-Tag Ni-Super Resin能够兼容多种的化学物 质： 6M Gua-HCl (Lane D)，1M NaCl (Lane E)产品名称产品形式货号规格PurKine& His-Tag Ni-Super ResinResinBMR200205ml/10ml/50ml/100mlPurKine& His-Tag Ni-Super Packed ColumnPacked ColumnBMC200201ml&5/3ml&5PurKine& His-Tag Ni-Super Resin 6FFResinBMR200265ml/10ml/50ml/100mlAbbkine品牌是一家提供高性价比免疫学和细胞学科研产品及解决方案的品牌，艾美捷将其引入中国，作为其中国区域代理，将为客户提供最具性价比的常规免疫学试剂，如各种标签抗体、内参抗体、常规一抗以及全系列二抗，抗体检测底物以及相关试剂盒等。同时我们作为多家国际知名品牌的的中国代理或区域代理，艾美捷能为您提供系列的实验室解决方案。?
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his标签蛋白是什么
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是这样的,his标签蛋白就是：六个组氨酸.一般存在于重组蛋白前面或后面,便于纯化该重组蛋白,组氨酸可以特异性的结合镍离子,带有组氨酸标签的重组蛋白可以被镍柱吸附,从而达到纯化的目的.也就是在表达载体上面,特别加六个组氨酸的碱基序列,就可以了,一般商业载体上面都有.该清楚了吧.
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