概念/基因工程技术
　　基因工程技术使很多自然界很难或不能获得的蛋白得以大规模合成。80年代以来,表达真核cDNA，细菌毒素和病毒抗原基因等，为人类获取大量医用价值的多肽蛋白开辟了新途径。
　　基因工程技术生产药品的优点：生产过去难以获得的生理活性蛋白和多肽，胰岛素，干扰素等,
等；　可以提供足够数量的
；发现更多内源生理活性物质；定向改变内源生理活性物质；获得新化合物，扩大药物来源。
基因工程概念/基因工程技术
A 重组DNA技术的基本定义　　重组DNA技术是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。因此，供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元件。B 基因工程的基本定义　　基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括
和下游技术两大组成部分。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术）；而下游技术则涉及到
或细胞的大规模培养以及
的分离纯化过程。
　　基因工程是利用重组技术，在体外通过人工“剪切”和“拼接”等方法，对各种
的核酸（基因）进行改造和重新组合，然后导入微生物或真核细胞内进行无性繁殖，使重组基因在细胞内表达，产生出人类需要的基因产物，或者改造、创造新的生物类型。
　　从实质上讲，基因工程的定义强调了外源DNA分子的新组合被引入到一种新的寄主生物中进行繁殖。这种DNA分子的新组合是按工程学的方法进行设计和操作的，这就赋予基因工程跨越天然物种屏障的能力，克服了固有的
间限制，扩大和带来了定向创造生物的可能性，这是基因工程的最大特点。
　　基因工程包括把来自不同生物的基因同有自主复制能力的载体DNA在体外人工连接，构成新的重组的DNA，然后送到受体生物中去表达，从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合。
　　基因工程要素：包括外源DNA，载体分子，工具酶和受体细胞等。
一个完整的、用于生产目的的基因工程技术程序包括的基本内容有：（1）外源目标基因的分离、克隆以及目标基因的结构与功能研究。这一部分的工作是整个基因工程的基础，因此又称为基因工程的上游部分；（2）适合转移、表达载体的构建或目标基因的表达调控结构重组；（3）
的导入；（4）外源基因在宿主基因组上的整合、表达及检测与转基因生物的筛选；（5）外源基因表达产物的生理功能的核实；（6）转基因新品系的选育和建立，以及转基因新品系的效益分析；（7）生态与进化安全保障机制的建立；（8）消费安全评价。
基因工程诞生理论依据/基因工程技术
（1）DNA是遗传物质　　不同基因具有相同的物质基础。地球上的一切生物，从细菌到高等动物和植物，直至人类，它们的基因都是一个具有遗传功能的特定核苷酸序列的DNA片段。而所有生物的DNA的基本结构都是一样的。因此，不同生物的基因（DNA片段）原则上是可以重组互换的。
　　虽然某些病毒的
在RNA上，但是这些病毒的RNA仍可以通过
产生。DNA并不影响不同基因的重组或互换。
　　A：肺炎双球菌转化实验
　　1944年
微生物学家Avery，通过细菌（肺炎链球菌）转化（有毒与无毒）研究确定了基因的分子载体是DNA，而不是
　　B：噬菌体转染实验
　　1952年Alfred Hershy和Marsha Chase用标记物的噬菌体（P32和S35）感染大肠杆菌，发现只有P32标记的DNA注入寄主细胞才能繁殖下一代进一步证明遗传物质是DNA。（2）DNA双螺旋结构　　1953年James D. Watson和Francis H. C. Crick揭示了DNA分子的双螺旋结构和半保留复制机制。（3）中心法则，遗传密码　　遗传密码是通用的。一系列三联密码子（除极少数的几个以外）同氨基酸之间的对应关系，在所有生物中都是相同的。也就是说遗传密码是通用的，重组的 DNA分子不管导人什么样的生物细胞中，只要具备转录翻译的条件，均能转译出原样的氨基酸。即使人工合成的DNA分子（基因）同样可以转录翻译出相应的氨基酸。现在，基因是可以人工会成的。（4）基因可切割　　基因直线排列在DNA分子上。除少数
排列外，大多数基因彼此之间存在着间隔序列。因此，作为DNA分子上一个特定核苷酸序列的基因，允许从DNA分子上一个一个完整地切割下来。即使是重叠排列的基因，也可以把指定的基因切割下来，尽管破坏了其他基因。（5）基因可转移　　基因不仅是可以切割下来的，而且发现生物体内有的基因可以在
DNA上移动，甚至可以在不同染色体间进行跳跃，插入到靶DNA分子之中。由此表明基因不仅是可转移的，（6）多肽与基因之间的对应关系　　现在普遍认为，一种多肽就有一种相对应的基因。因此，基因的转移或重组可以根据其表达产物多肽的性质来检查。（7）基因通过复制把遗传信息传递　　经重组的基因一般来说是能传代的，可以获得相对稳定的转基因生物。
基因工程发展史/基因工程技术
　　基因工程是在
和分子遗传学等学科的研究成果基础上逐步发展起来的。基因工程研究的发展大致可分为以下几个阶段：（1）基因工程准备阶段　　理论上的准备：1944年，美国微生物学家Avery等通过细菌转化研究，证明DNA是
。从此之后，对DNA构型开展了广泛研究，至1953年Watson和Crick建立了DNA分子的双螺旋模型。在此基础上进一步研究DNA的遗传信息，1958年至1971年先后确立了中心法则，破译了64种密码子，成功地揭示了遗传信息的流向和表达问题。以上研究成果为基因工程问世提供了理论上的准备。
　　技术上的准备：20世纪60年代末70年代初，限制性核酸内切酶和
等的发现，使DNA分子进行体外切割和连接成为可能。1972年首次构建了一个重组DNA分子，提出了体外重组的DNA分子是如何进入
，并在其中进行复制和有效表达等问题。经研究发现，质粒分子（DNA）是承载外源DNA片段的理想载体，病毒、噬菌体的DNA（或RNA）也可改建成载体。至此，为基因工程问世在技术上做好了准备。（2）基因工程问世　　在理论上和技术上有了充分准备后，于1973年，Cohen等首次完成了重组质粒DNA对大肠杆菌的转化，同时又与别人合作，将非洲爪蟾含
的DNA片段与质粒pSC101重组，转化大肠杆菌，转录出相应的mRNA。此研究成果表明基因工程已正式问世，不仅宣告质粒分子可以作为
载体，能携带外源DNA导人宿主细胞，并且证实
的基因可以转移到原核生物细胞中，并在其中实现功能表达。（3） 基因工程迅速发展阶段　　自基因工程问世以来的这二十几年是基因工程迅速发展的阶段。不仅发展了一系列新的基因工程操作技术，构建了多种供转化（或转导）原核生物和动物、植物细胞的载体，获得了大量转基因菌株，而且于1980年首次通过显微注射培育出世界上第一个转基因动物——转基因
，1983年采用
培育出世界上第一例转基因植物——转基因烟草。基因工程基础研究的进展，推动了基因工程应用的迅速发展。用基因工程技术研制生产的贵重药物，至今已上市的有50种左右，上百种药物正在进行！临床试验，更多的药物处于前期实验室研究阶段。转基因植物的研究也有很大的进展，自从1986年首次批准转基因烟草进行田间试验以来，至1994年11月短短几年，全世界批准进行田间试验的转基因植物就有1467例。又过4年，至1998年4月已达4387项。转基因动物研究的发展虽不如转基因植物研究的那样快，但也已获得了转生长激素基因鱼。转生长激素基因猪和抗猪瘟病转基因猪等。
　　如果说 20世纪八九十年代是基因工程基础研究趋向成熟，应用研究初露锋芒的阶段，那么21世纪初将是基因工程应用研究的鼎盛时期，农、林。牧、渔、医的很多产品上都会打上基因工程的标记。
一、基础研究/基因工程技术
　　基因工程问世以来，科技工作者始终十分重视基础研究，包括构建一系列
和相应的表达系统，建立不同物种的基因组文库和
，开发新的工具酶，探索新的操作方法等，各方面取得了丰硕的研究成果，使基因工程技术不断趋向成熟。
、基因工程克隆载体的研究
　　基因工程的发展是与克隆载体构建密切相关的，由于最早构建和发展了用于原核生物的克隆载体，所以以原核生物为对象的基因工程研究首先得以迅速发展。Ti质粒的发现以及成功地构建了Ti质粒衍生的克隆载体后，
研究随之就迅速发展起来。动物病毒克隆载体的构建成功，使动物基因工程研究也有一定的进展。可以认为构建克隆载体是基因工程技术路线中的核心环节。至今已构建了数以千计的克隆载体。但是构建新的克隆载体仍是今后研究的重要内容之一。尤其是适合用于高等动植物转基因的表达载体和定位整合载体还须大力发展。2、基因工程受体系统的研究　　基因工程的受体与载体是一个系统的两个方面。前者是克隆载体的宿主，是外源目的基因表达的场所。受体可以是单个细胞，也可以是组织、器官、甚至是个体。用作基因工程的受体可分为两类，即原核生物和真核生物。
　　原核生物大肠杆菌是早期被采用的最好受体系统，应用技术成熟，几乎是现有一切克隆载体的宿主；以大肠杆菌为受体建立了一系列基因组文库和cDNA文库，以及大量
菌株，开发了一批已投入市场的基因工程产品。蓝细菌（蓝藻）是进行植物型光合作用的原核生物，兼具植物自养生长和原核生物遗传背景简单的特性，便于
和利用光能进行无机培养。因此，近年来蓝细菌开始被用作廉价高效表达外源目的基因的受体系统。
　　酵母菌是十分简单的单细胞真核生物，具有与原核生物很多相似的性状。酵母菌营异养生长，便于工业化发酵；基因组相对较小，有的株系还含有质粒，便于基因操作。因此酵母菌是较早被用作基因工程受体的真核生物。有人把酵母菌同大肠杆菌一起看作是第一代基因工程受体系统。酵母菌不仅是外源基因（尤其是
）表达的受体，建立了一系列工程菌株，而且成为当前建立人和高等动物、植物复杂基因组文库的受体系统。真核生物单细胞小球藻和衣藻也被用于研究外源基因表达的受体系统。
　　随着克隆载体的发展，至今高等植物也已用作基因工程的受体，一般用其愈伤组织、细胞和原生质体，也用部分组织和器官。目前用作基因工程受体的植物有双子叶植物拟南芥、烟草、番茄、棉花等，单子叶植物
、玉米、小麦等，获得了相应的转基因植物。
　　动物鉴于体细胞再分化能力差，目前主要以生殖细胞或
作为基因工程受体，获得了转基因鼠、鱼、鸡等动物。动物体细胞也用作基因工程受体，获得了系列转基因细胞系，用作基础研究材料，或用来生产
。随着克隆羊的问世，对动物体细胞作为基因工程受体的研究越来越被重视，将成为21世纪初重要研究课题之一。
　　人的体细胞同样可作为基因工程的受体，转基因细胞系用于病理研究。近年来还以异常生长的细胞作为受体，通过转基因使其回复正常生长状态（
）。3、目的基因研究　　基因是一种资源，而且是一种有限的战略性资源。因此开发基因资源已成为发达国家之间激烈竞争的焦点之一，谁拥有
多，谁就在基因工程领域占主导地位。基因工程研究的基本任务是开发人们特殊需要的基因产物，这样的基因统称为目的基因。具有优良性状的基因理所当然是目的基因。而致病基因在特定情况下同样可作为目的基因，具有很大的开发价值。即使是那些今天尚不清楚功能的基因，随着研究的深入，也许以后成为具有很大开发价值的目的基因。
　　获得目的基因的途径很多，主要是通过构建基因组文库或cDNA文库，从中筛选出特殊需要的基因。近年来也广泛使用PCR技术直接从某生物基因组中扩增出需要的基因。对于较小的目的基因也可用人工化学合成。现在已获得的目的基因大致可分为三大类：第一类是与医药相关的基因；第二类是抗病、虫害和恶劣生境的基因；第三类是编码具特殊营养价值的蛋白或多肽的基因。
　　近年来越来越重视基因组的研究工作，试图搞清楚某种生物基因组的全部基因，为全面开发各种基因奠定基础。据统计，至1998年完成基因组测序的生物有11种，如嗜血流感杆菌（bp， 1743个基因）、产甲烷球菌（ bp，1682个基因）、大肠杆菌 K-12（4 639 221bp， 4288个基因）、啤酒酵母（～12 x 10 bp，5882个基因）、枯草杆菌（ Bacillus subrilis）（4．21 X 10bp，4100个基因）。
　　早在20世纪80年代就有人对人类基因组产生了兴趣，提出人类基因组研究计划。从1990年开始，先后由美国、
、法国等国实施“
”，我国于1999年9月也获准参加这一国际性计划，在
和上海分别成立了人类基因组研究中心，承担人类基因组1%的测序任务。这些国家聚集了一批科技人员，经过十年的辛勤工作，于2000年6月宣告人类基因组“工作框架图”已经绘制完毕。同时已破译了近万个基因。至1999年，美国对6500个人类基因提出了专利申请。一般认为人类基因组含有数万个基因，各司其职，控制着人的生长、发育、繁殖。一旦人类基因组全部被破译，就可了解人类几千种遗传性疾病的病因，为基因治疗提供可靠的依据，并且将保证人类的优生优育，提高人类的生活质量。
　　除“人类基因组计划”以外，目前正在实施“
”。以稻米为主食的我国早在1992年8月正式宣布实施“水稻基因组计划”，并且是目前国际“水稻基因组计划”的主要参加者，并于日，
科学院、国家计委、科技部联合召开新闻发布会，宣布具有国际领先水平的中国水稻（税稻）基因组“工作框架图”和数据库在我国已经完成。这一成果标志着我国已成为继美国之后，世界上第二个能够独立完成大规模全基因组测序和组装分析能力的国家，表明我国在基因组学和生物信息学领域不仅掌握了世界一流的技术，而且具备了组织和实施大规模科研项目开发的能力。籼稻全基因组“工作框架图”的完成，将带动小麦、玉米等所有粮食作物的基础与应用研究。
　　此外，中国、美国合作的“家猪基因组计划”也已经启动。4、基因工程工具酶的研究　　基因工程工具酶指体外进行DNA合成、切割、修饰和连接等系列过程中所需要的酶，包括
、限制性核酸内切酶、修饰酶和连接酶等。
　　限制性核酸内切酶用于有规律地切割DNA把提供的DNA原材料切割成具特定末端的DNA片段。现已从不同生物中发现和分离出上千种限制性核酸内切酶，基本上可满足按不同目的切割各种DNA分子的需要。
　　耐热性限制性核酸内切酶和长识别序列稀切酶仍是当前研究的热门课题。
　　DNA连接酶用于连接各种DNA片段，使不同基因重组。现在常用的DNA连接酶只有两种，即大肠杆菌DNA连接酶和 T4 DNA连接酶，前者只能连接具勤性末端的 DNA片段；后者既能连接具默性末端的DNA片段，也能连接具平末端的DNA片段。
　　DNA聚合酶用于人工合成连杆、引物等DNA小片段以及含基因的较大的DNA片段，还用于制备DNA探针。多种耐热性DNA聚合酶的发现，使使PCR技术迅速发展．给当今
提供了先进的研究手段。5、基因工程新技术研究　　围绕外源基因导人受体细胞，发展了一系列用于不同类型受体细胞的DNA转化方法和病毒转导方法，特别是近年来研制的基因枪和电激仪克服了某些克隆载体应用的物种
，提高了外源DNA转化的效率。
　　围绕基因的检测方法，在
标记探针的基础上，近年来又发展了
DNA探针技术和荧光探针技术，如生物素标记DNA探针、Dig标记DNA探针、荧光素标记DNA探针等。
　　PCR技术的发展不仅大大提高了基因检测的灵敏度，而且为分离基因提供了快速简便的途径。PCR技术自从1985年建立以来，发展很快，除一般采用的常规PCR技术外还发展了多种特殊的PCR技术，如长片段PCR技术、反转录PCR技术、
技术、套式引物PCR技术、反向PCR技术、标记PCR技术、复合PCR技术、
技术、定量PCR技术、锚定PCR技术、重组PCR技术、加端PCR技术等等。
　　凝胶电泳技术可以在凝胶板上把不同分子大小的DNA分子或DNA片段分开，但是只能分辨几万碱基的DNA分子或片段。脉冲电泳技术的问世，不仅能分开上百万碱基的DNA分子或片段，而且能够使完整的染色体彼此分开。
二、应用研究/基因工程技术
　　基因工程技术已广泛应用于医、农、牧、渔等产业，甚至与环境保护也有密切的关系。研究成果最显著的是基因工程药物，转基因植物的研究也取得了喜人的成果。（将在后面基因工程应用中重点讲）。
基因工程应用、发展/基因工程技术
　　应用重组DNA技术培育具有改良性状的粮食作物的工作已初见成效。这方面的工作按其发展水平可以分为二个不同的阶段：
　　第一阶段，主要集中于有重要农业经济意义的目的基因的分离与改造：
　　第二阶段的主要目标是培育出具有改良的重要经济性状的工程植株；
　　第三阶段的发展方向是培育出具有生物反应器功能的工程植株。
　　现在已经培育成功了一批分别具有抗病、抗虫和抗除草剂性状的
。例如，应用反义RNA技术培育成功的具有耐贮藏的转基因西红柿已开始在美国投放市场。利用植物合成微生物甚至哺乳动物的一些特殊蛋白质，例如干扰素、人血清蛋白等也已有—些成功的报道。从理论上讲，在将来还有可能通过转基因植物生产更多的药用蛋白质。我们有理由相信，重组DNA技术在农业生产中的应用，是具有光辉的前景的。
　　重组DNA技术的一个显著特点是，它注往可以使一个生物获得与之固有性状完全无关的新功能，从而引起
学发生革命性的变革，使人们可以在大虽扩增的细胞中生产哺乳动物的蛋白质，其意义无疑是相当重大的。
　　将控制这些药物合成的目的基因克隆出来，转移到大肠杆菌或其它生物体内进行有效的表达，于是就可以方便地提取到大量的有用药物。目前在这个领域中已经取得了许多成功的事例，其中最突出的要数重组胰岛素的生产。
　　重组DNA技术还有力地促进了医学科学研究的发展。它的影响所及有疾病的临床诊断、遗传病的基因治疗、
的研制以及
和艾滋病的研究等诸多科学，并且均已取得了相当的成就。早在基因工程刚刚诞生的时候，它就被迅速地应用于肿瘤发生和
理论的研究，为肿瘤诊断、药物治疗、肿瘤转移及其预防等提供了有效的新手段。这方面的重要突破是发现了
，弄清了肿瘤的起因。现在一些靠传统的接种疫苗无法预防的疾病，正在通过基因克隆技术发展有效的新型疫苗。还有一些遗传疾病如今已能在胎儿身上得到诊断，而且有希望使囊性纤维化、乳腺癌以及其它一些严重危害人类的疾病，在不久的将来得到有效的治疗。
　　1、在医药业的应用
　　（1）转基因细菌生产激素类药物
　　（2）转基因细菌生产
　　（3）转基因微生物生产疫苗：
　　2. 在工业原料生产上的应用
　　（1）转基因微生物生产高分子多聚物
　　（2）转基因微生物与环境净化和废料再生
基因工程安全性/基因工程技术
一、基因工程安全隐患　　1. 对环境的影响
　　重新组合一种在自然见尚未发现的的生物性状有可能给现有的生态环境带来不良影响。
　　2. 新型病毒的出现
　　制造带有抗生素
或有产生病毒能力的基因的新型微生物有可能在人类或其它生物体内传播。
　　3. 癌症扩散
　　将肿瘤病毒或其它动物病毒的DNA引入细菌有可能扩大癌症的发生范围。
　　4. 人造生物扩散
　　新组成的重组DNA生物体的意外扩散可能会出现不同程度的潜在危险。二、重组DNA研究安全准则　　1. 公众的担忧
　　1973年美国的公众第一次公开表示担心应用重组DNA技术可能会培养出具有潜在危险性的新型微生物，从而给人类带来难以预料的后果。
　　2. 专家的态度
　　1974年
（NIH）考虑到重组DNA的潜在危险，提请Paul Berg博士组成一个重组DNA咨询委员会。
　　3.制定安全规则
　　日，NIH正式公布了“重组DNA研究的安全准则”。
　　4. 基因工程的安全措施
　　由于同一地区只种一种作物 ,造成抗性基因专一化 ,使得抗性基因所不能对付的
暴发 ,从而造成农作物的减产。转基因作物的大规模商业种植可能会导致被转移基因在
中的广泛流动 ,还可能波及到非目标生物 ,从而对生态环境产生不可逆转的严重破坏。此外 ,基因工程技术生物的推广将使数以千计的品种被淘汰 ,导致自然界一些食物链切断 ,生态平衡破坏。专家认为 ,经一二十年后 ,杂草、虫害和病菌适应了环境 ,使基因工程作物的抗性丧失 ,则这些特性有可能转给杂草昆虫病菌或某些动物 ,产生超级杂草、超级害虫、超级细菌和超级病毒 ,从而给人类及生态环境带来严重危害。
　　（1）　杂草化问题
　　（2）　基因扩散
　　（3）　RNA重组的潜在危险
　　控制措施：对转基因生物的控制措施有物理的方法和生物的方法。
　　物理的方法就是通过各种严格的管理措施和物理屏障尽量使转基因生物不能从实验室逃逸进入到自然环境里去。这种措施只能用于控制在实验室里的转基因生物，而且用于控制转基因微生物和通过花 粉进行扩散的植物的效力实际上是非常有限的。当转基因动、植物必须用于开放的环境里生产时，物理控制的方法便不再有实际的意义。
　　根本性的措施还是
的控制方法。即造成转基因生物与非转基因生物之间的生殖隔离。如利用三倍体不育的特性，将用于生产的转基因动物或植物成为三倍体，这样，转基因生物在进入到自然环境里后就不可能自行繁殖，因此也就不可能对生态系统 造成长期的影响。也可以利用
原理，如激素诱导等方法使转基因生物不育等。
　　P1-P4是关于基因工程实验室物理安全防护上的装备规定。P1级实验室．为一般的装备良好的普通微生物实验室；P2级实验室，在P1级实际室的基础上，还需装备负压的安全操作柜；P3级实验室即全负压的实验室，同时还要装备安全操作柜；P4实验室，是具有前
全队护措施的实验室。要求建设专用的实验大楼，周围与其它建筑物之间应留有一定距离的隔离带，细菌操作需带手套进行，以及使用其它必要的隔离装置，使研究者不会直接同细菌接触等等。
方面:EK1～3级是专门针对大肠杆菌菌株而规定的安全防护标准。它是依据大肠杆菌在自然环境中的存活率为前提制定的。EK1级的大肠杆菌菌株，在自然环境中一般都是要死亡的，而符合EK2一3级标准的大肠杆菌菌株，在自然环境中则是无法存活的。
　　第一个“安全”的大肠杆菌 K12菌株，是在 1976年由美的 Alabama大学的 Roy CurrissIII发展出来的。由于这个菌株是在庆祝美国独立200周年（）期间交付使用的，所以被命名X1776菌株。能够防它在实验室外传播的‘安全”特性之一是，该菌株是一种营养缺陷突变体，它必须在有
和胸腺嘧啶核苷酸的培养基上才能生长。二氨基庚二酸是赖氨酸
的一种中间产物，在人类的肠道中并不存在这种物质。因此，即便X1776菌株偶然被吞食至人类肠道，也不可能存活下去。X1776菌株安全特性之二是，它的细胞壁十分脆弱在抵浓度的盐离子环境中，甚至只有微量的去污剂的存在，都会造成细胞的破裂而致死。
　　根据NIH安全准则，在DNA重组实验中，除了使用“安全”的寄主细菌之外，还必须使用“安全”的质粒载体。这样的‘安全’质粒的一个基本特征是，它应该失去了自我迁移的能力。
　　2、消费安全
　　用转基因生物生产的转基因食品和药品要进入市场，必须进行消费安全性评价。消费安全评价一般要考虑以下一些主要的方面：
　　导人的外源目标基因本身编码的产物是否安全，例如用某些细菌的杀虫基因所培育的转基因杀虫作物中，杀虫基因所编码的产物是 否会对人类产生毒性作用等；
　　（2）外源目标基因是否稳定，在新的生理条件下和
里，导人的外源目标基因会不会产生对人体健康有害的突变；
　　使用的载体是否安全，载体本身是否会编码对人体有害的产物，例如用于人类的基因工程产品一般是应避免使用病毒作为基因载体的；
　　在使用了选择和报道基因的情况下，这些基因是否会产生有害的物质，例如用抗生素作为选择
的转基因食品，是否会在食用后使人产生对抗生素的抗性；
　　外源基因导入后是否会诱导受体生物产生新的有害遗传性状或不利于健康的成分。
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基 因 工 程
基 因 工 程 Genetic Engineering 第一章 基因工程概貌 教学要求: 教学要求 1. 掌握基因工程的含义 2. 了解基因工程的发展史 3. 掌握基因工程的理论依据 4. 了解基因工程的基本技术路线 5. 了解因工程的安全性问题 6. 了解基因工程的发展前景 基因工程（ 基因工程（gene engineering）的含义 ） 指人为地通过基因重组、基因突变、基因
转移途径，将一种或多种生物体（供体）的基因与 载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，按人们的意愿遗传并大规模 地表达出新的生物性状或新物质。 基因工程的诞生需要理论和技术上的支持： 二、基因工程的诞生需要理论和技术上的支持： 理论上的三大发现： 理论上的三大发现： （1）证明生物遗传物质是 DNA（基因工程的先导） ； （2）DNA 的双螺旋结构和半保留复制机理； （3）遗传信息的传递方式（中心法则）和三联体密码子系统的建立。 技术上的三大发现： 技术上的三大发现： （1）限制性内切酶和 DNA 连接酶的发现（标志着 DNA 重组时代的开始） ，载体的使用； （2）1970 年，逆转录酶的发现。 （3）1973 年，Cohen 等获得了抗四环素和新霉素的重组菌落 TcrNer，标志着基因工程的诞 生。 70 年代初 DNA 体外重组技术―基因工程技术的出现，将传统的生物学技术引 向了高技术之路。 三、基因工程理论依据 1.基因有共同的物质基础： 基因有共同的物质基础： 可以重组互换。 有遗传功能的特定核酸序列： DNA 片段或 RNA。 基因有共同的物质基础 可以重组互换。 有遗传功能的特定核酸序列： 。 2.基因可切割： 存在间隔序列（重叠序列的基因也可切出） 基因可切割： 存在间隔序列（重叠序列的基因也可切出） 基因可切割 。 3.基因可转移： 可在染色体 DNA 或不同染色体之间跳跃，基因组也可重组。 基因可转移： 或不同染色体之间跳跃，基因组也可重组。 基因可转移 要点： 供体、载体、 要点： 供体、载体、受体 目的： 扩增，外源基因表达产物，表达调控，改造生物遗传特性等。 目的： DNA 扩增，外源基因表达产物，表达调控，改造生物遗传特性等。 4.多肽与基因之间存在对应关系。 多肽与基因之间存在对应关系。 多肽与基因之间存在对应关系 一种多肽对应一种基因。根据表达产物的性质可检查基因的转移或重组。 一种多肽对应一种基因。根据表达产物的性质可检查基因的转移或重组。 5.遗传密码通用。 遗传密码通用 遗传密码通 三联密码子（少数除外）与氨基酸相对应，所有生物都相同， 三联密码子（少数除外）与氨基酸相对应，所有生物都相同，只要具备转录翻译条件 均能转译出原样的氨基酸。基因可人工合成。 均能转译出原样的氨基酸。基因可人工合成。 6.基因可复制传递遗传信息。 基因可复制传递遗传信息。 基因可复制传递遗传信息 重组基因可传代，获得相对稳定的转基因生物。 重组基因可传代，获得相对稳定的转基因生物。 四、基因工程研究内容 1. 克隆载体 原核生物的克隆载体： 克隆载体：原核生物的克隆载体 原核生物的克隆载体： Ti 质粒及其衍生载体（植物基因工程）;动物病毒克隆载体（动物基因工程） 质粒及其衍生载体（植物基因工程） 动物病毒克隆载体 动物基因工程） 动物病毒克隆载体（ 。 核心环节： 构建新载体（适于高等动植物转基因表达载体和定位整合载体） ，应大力发 核心环节： 构建新载体（适于高等动植物转基因表达载体和定位整合载体） 应大力发 ， 展。 2. 受体系统：克隆载体的宿主 外源目的基因表达（单个细胞、组织、器官、个体） 受体系统：克隆载体的宿主： 。 包括：原核生物、真核 真核生物、植物、动物及人类。 包括：原核 真核3. 目的基因 （优良性状的基因、致病基因） 优良性状的基因、致病基因） 文库； 直接从某生物基因组扩增； 获取途径 ：构建基因组文库或 cDNA 文库；PCR 直接从某生物基因组扩增；较小的可 人工化学合成 。 已获目的基因种类：与医药相关的基因；抗病、虫害和恶劣环境的基因； （已获目的基因种类：与医药相关的基因；抗病、虫害和恶劣环境的基因；编码特殊营养 价值的蛋白或多肽基因。 价值的蛋白或多肽基因。 ） 生长、发育、繁殖，遗传性疾病的基因治疗，优生优育。 生长、发育、繁殖，遗传性疾病的基因治疗，优生优育。 中国水稻（籼稻）基因组“工作框架图”和数据库已完成。 中国水稻（籼稻）基因组“工作框架图”和数据库已完成。 家猪基因组计划” 中、英两国合作 “家猪基因组计划” 。 4. 工具酶 ： 合成、切割、修饰和连接等系列过程中所需要的酶（ 聚合酶、 指体外进行 DNA 合成、切割、修饰和连接等系列过程中所需要的酶（DNA 聚合酶、 限制性核酸内切酶、修饰酶和连接酶） 限制性核酸内切酶、修饰酶和连接酶） 。 限制性核酸内切酶： 片段。研究热点： 限制性核酸内切酶：有规律地切割 DNA，获得特定末端的 DNA 片段。研究热点：耐 ， 热内切酶和长识别序列稀切酶。 热内切酶和长识别序列稀切酶。 五、基因工程的特点 以分子遗传学为理论基础， 以分子生物学和微生物学的现代方法为手段， 将不同来源的基因 (DNA 分子), 按预先设计的蓝图，在体外构建杂种 DNA 分子。改变生物原有的遗传特性， 获得新品种，生产新产品，或是研究基因的结构和功能。 基因工程有两个基本的特点∶ 基因工程有两个基本的特点∶ （1）分子水平上的操作和细胞水平上的表达。 （2）打破了常规的物种间界限（原核与真核生物之间、动植物之间、人与其他生物之间） ， 使遗传信息进行重组、转移和表达。十二、 十二、基因组计划 ? 研究一个基因组的全部工作的规划： ? 1.测定全部 DNA 序列； ? 2.构建基因组的物理图谱； ? 3.构建基因组的遗传图谱； ? 4.构建基因组的转录图谱； ? 5.分析基因组的功能。 目前实施的基因组计划： 目前实施的基因组计划： 微生物：大肠杆菌、噬菌体、酵母 植 物：拟南芥、水稻； 动 物：果蝇、猪、牛、鸡等； 人 第二章 基因工程常用的工具酶 教学目的和要求： 教学目的和要求： 1. 掌握限制性核酸内切酶的概念 2. 熟悉 DNA 连接酶的作用 3. 熟悉 DNA 聚合酶的作用和意义 4. 了解 DNA 修饰酶 5. 熟悉单链核酸内切酶的生物学作用 6. 了解核酸外切酶 2.1 限制性核酸内切酶※ 限制性核酸内切酶※ 限制性核酸内切酶定义：简称限制酶， 限制性核酸内切酶定义：简称限制酶，是一类能够识别双链 DNA 分子中某些特定的核苷酸 序列， 双链结构的核酸内切酶。 序列，并由此切开 DNA 双链结构的核酸内切酶。 ? 限制性核酸内切酶的种类（三种）(p22) 限制性核酸内切酶的种类（三种） Ⅰ型限制性核酸内切酶 型限制性核酸内切酶※ Ⅱ型限制性核酸内切酶※ 型限制性核酸内切酶 Ⅲ型限制性核酸内切酶 根据结构和功能， 根据结构和功能，可将限制酶分为 I、II、III 型。 、 、 I 型和 III 型限制酶切点不固定，不能产生可利用的 DNA 片段。只有 II 型限制酶具有控制 型限制酶切点不固定， 片段。 和预测位点特异性切割的性质， 片段， 和预测位点特异性切割的性质，且产生固定的 DNA 片段，基因工程中所用的都是 II 型限 制酶。 制酶。 ? 限制酶的命名原则（p23） 限制酶的命名原则（ ） 限制酶的名称由三个字母组成。第一个字母采用细菌属名的第一个大写字母， ①限制酶的名称由三个字母组成。第一个字母采用细菌属名的第一个大写字母，第二和第 三个字母采用细菌种名的前两个字母。如大肠杆菌（ 表示， 三个字母采用细菌种名的前两个字母。如大肠杆菌（Escherichia coli）用 Eco 表示，流 ） 感嗜血菌（ 表示。 感嗜血菌（Hacmophilus influcnzac）用 Hin 表示。 ） 第四个字母是表示菌株的类型。 ②第四个字母是表示菌株的类型。如 EcoR 中的 R 代表大肠杆菌 R 株。 如果一个菌株中有几种限制酶， 则在代表菌株的字母后用罗马数字表示。 ③如果一个菌株中有几种限制酶， 则在代表菌株的字母后用罗马数字表示。 如流感嗜血菌 d 株有几种限制酶， 株有几种限制酶，则分别表示为 Hind I、Hind II、Hind III 等。 、 、 当同属细菌中的不同细菌种名前两个字母完全相同时， ④当同属细菌中的不同细菌种名前两个字母完全相同时，一般取种名词头后的第一个字母 来代替酶名字中的第三字母。 来代替酶名字中的第三字母。 例如 Hinf I 表示是从流感嗜血杆菌的 f 菌株中发现和提纯的 第一种限制酶。 第一种限制酶。? Ⅱ型限制酶的特性※ 型限制酶的特性※ 不同限制酶能专一地识别不同的特异核苷酸序列； ①不同限制酶能专一地识别不同的特异核苷酸序列； 各种限制酶的识别序列一般都具有回文结构 回文结构； ②各种限制酶的识别序列一般都具有回文结构； 各种限制酶的切割类型是各式各样的，切割后形成各种粘性末端或平整末端； ③各种限制酶的切割类型是各式各样的，切割后形成各种粘性末端或平整末端； 某些限制酶在非标准反应条件下， 可能导致酶的识别序列特异性发生改变。 （星活性 ④某些限制酶在非标准反应条件下， 可能导致酶的识别序列特异性发生改变。 星活性 ： 用 （ “☆”表示，如 EcoR Ⅰ★） 表示， Ⅰ★） ☆ 表示 回文结构：在核苷酸序列中，某一段核苷酸序列都做双重旋转对称排列。 回文结构：在核苷酸序列中，某一段核苷酸序列都做双重旋转对称排列。从 5’端―3’端的 端 端的 碱基排列顺序是完全相同。 碱基排列顺序是完全相同。 两种特殊的限制酶 （1）同裂酶 ） （2）同尾酶 ） 2.2 DNA 连接酶※ DNA 连接酶定义： 连接酶定义： 是一种能够催化双链 DNA 片段紧靠在一起的 3’ 羟基末端与 5’磷酸基末 磷酸基末 端之间形成磷酸二酯键，并使两末端连接起来的酶 起来的酶。 端之间形成磷酸二酯键，并使两末端连接起来的酶。 片段末端连接， 分子。 如果是两个或两个以上不同的双链 DNA 片段末端连接，则产生重组 DNA 分子。 DNA 连接酶连接作用的特点（p27） 连接酶连接作用的特点（ ） ①DNA 连接酶需要一条 DNA 链 3’ 末端有一个游离的羟基 -OH） 另一条 DNA 链的 5’ ’ － （ ） ， ’ 末端有一个磷酸基（－ （－P）的情况下， 分子的作用。 －末端有一个磷酸基（－ ）的情况下，才能发挥连接 DNA 分子的作用。 彼此相邻， ②只有当 3’－OH 和 5’－P 彼此相邻，并且各自位于与互补链上的互补碱基配对的两个 ’ ’ 脱氧核苷酸末端时， 连接酶才能将它们连接成磷酸二酯键。 脱氧核苷酸末端时，DNA 连接酶才能将它们连接成磷酸二酯键。 分子， ③DNA 连接酶不能连接两条单链的 DNA 分子或环化的单链 DNA 分子，被连接的 DNA 链 必须是双螺旋 DNA 分子的一部分 上失去一个磷酸二酯键所出现的单链缺口（ ，而 ④DNA 连接酶只能封闭双螺旋 DNA 上失去一个磷酸二酯键所出现的单链缺口（nick） 而 ） ， 的某一条链上失去一个或数个核苷酸所形成的单链裂口（ 不能封闭双链 DNA 的某一条链上失去一个或数个核苷酸所形成的单链裂口（gap） ） 。 由于在羟基和磷酸基团之间形成磷酸二酯键是一种吸能反应，因此， ⑤由于在羟基和磷酸基团之间形成磷酸二酯键是一种吸能反应，因此，DNA 连接酶在进行 连接反应时，还需要提供一种能源分子（ 连接反应时，还需要提供一种能源分子（NAD＋或 ATP） ＋ ） 。 DNA 连接酶的作用机理： 连接酶的作用机理： 1. ATP(NAD+)提供和激活 AMP+ DNA 连接酶 复合物; 提供和激活 酶-AMP 复合物 2. 激活的 AMP 连到 DNA 一条链 5’末端磷酸基团上 末端磷酸基团上 NAD 腺苷酸复合物 腺苷酸复合物; 末端磷酸基团 3. 3’-OH 对活跃的碳原子做亲核攻击，结果形成磷酸二酯键，同时释放 AMP. 对活跃的碳原子做亲核攻击，结果形成磷酸二酯键， 2.3 DNA 聚合酶※ 聚合酶※ ? DNA 聚合酶（DNA Polymerase） 是一类能够催化 DNA 复制和修复 DNA 分子损 聚合酶（ ：是一类能够催化 ） ： 伤的酶。 伤的酶。 ? 基因工程中常用的 DNA 聚合酶： 聚合酶： （p31） （ ） 聚合酶Ⅰ 全酶） ⑴大肠杆菌 DNA 聚合酶Ⅰ（全酶） ； 聚合酶Ⅰ大片断（ 片段） ⑵大肠杆菌 DNA 聚合酶Ⅰ大片断（Klenow 片段） ； 聚合酶； ⑶T4 和 T7 噬菌体编码的 DNA 聚合酶； 聚合酶（测序酶） ⑷经修饰的 T7 噬菌体 DNA 聚合酶（测序酶） ； 聚合酶（ ⑸耐热 DNA 聚合酶（TaqDNA 聚合酶和 Ampli TaqTM）; ） 反转录酶。 ⑹反转录酶。 聚合酶Ⅰ★ （1）大肠杆菌 DNA 聚合酶Ⅰ★ ） 来源和组成： 基因编码的一种单链多肽蛋白质， 来源和组成：由大肠杆菌 polA 基因编码的一种单链多肽蛋白质，分子量 109×103，约 × ， 1000 个氨基酸，酶分子中含有一个双硫键和一个硫氢基，含有锌离子，呈椭圆形的结构 个氨基酸，酶分子中含有一个双硫键和一个硫氢基，含有锌离子， 聚合酶Ⅰ 大肠杆菌 DNA 聚合酶Ⅰ实现催化作用的三个条件 ①全部四种脱氧核苷 5’－三磷酸 dNTPs（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）和 Mg2+； ’ （ 、 、 、 ） ； 游离基团的引物链。 ②带有 3’－OH 游离基团的引物链。 ’模板。 ③单链或双链 DNA 模板。 ’→3’ ’→3’ ’→5’ 外切酶活性。 作用 ①5’→ ’的聚合酶活性 ； ②5’→ ’的外切酶活性；③3’→ ’的外切酶活性。 ’→ ’→ 的外切酶活性； ’→ E. coli DNA 聚合酶Ⅰ的三种酶活性： 聚合酶Ⅰ的三种酶活性： ? ※切口平移反应：在 Mg2+作用下，DNA 酶Ⅰ在待标记的双链 DNA 分子上，随机 切口平移反应： 作用下， 分子上， 作用下 聚合酶Ⅰ 的外切作用， 产生若干单链切口后利用 E. coli DNA 聚合酶Ⅰ的 5’ →3 ’的外切作用，在切口 ’ 聚合酶Ⅰ 聚合作用下， 的 5’端将脱氧核苷酸逐个切除，同时在 DNA 聚合酶Ⅰ的 5’ →3 ’聚合作用下， ’端将脱氧核苷酸逐个切除， ’ 将底物依次连接到切口的 3’羟基上，以互补的 DNA 单链为模板合成新的 DNA 单 ’羟基上， 即为切口平移反应。 链，即为切口平移反应。 大片段酶（ （2）Klenow 大片段酶（p33） ） ） 凹端； ①补平限制酶切割 DNA 后产生的 3’凹端； 凹端 片段的 凹端进行末端标记 凹端进行末端标记； ②用[32P]dNTP 对 DNA 片段的 3’凹端进行末端标记； 克隆中， 第二链； ③在 cDNA 克隆中，用于合成 cDNA 第二链； 测序。 ④应用 Sanger 双脱氧链末端终止法进行 DNA 测序。 ? （3）T4 噬菌体 DNA 聚合酶 ） 来源： 噬菌体感染的大肠杆菌培养物。 编码， 来源：T4 噬菌体感染的大肠杆菌培养物。由 T4 噬菌体基因 43 编码，相对分子量为 114 ×103。 。 酶活性： （与 大片段酶相似） 酶活性： 与 Klenow 大片段酶相似） （ a. 5’→3’聚合酶活性； 聚合酶活性； → 聚合酶活性 b. 3’→5’核酸外切酶活性。 比 Klenow 片段强 200 倍） 核酸外切酶活性。 （比 → 核酸外切酶活性 （ a. 5’→3’聚合酶活性； 聚合酶活性； → 聚合酶活性 b. 3’→5’核酸外切酶活性。 比 Klenow 片段强 200 倍） 核酸外切酶活性。 （比 → 核酸外切酶活性 （ 在没有脱氧核苷三磷酸存在的条件下 3’ 件下， → 的核酸外切酶活性就成为 T4 噬菌体 DNA →5’ ①在没有脱氧核苷三磷酸存在的条件下， ’ ’ 聚合酶的独特功能。 聚合酶的独特功能。 ②如果反应混合物中只有一种 dNTP， ， 那么这种降解作用将进行到暴露出同反应物中唯一的 dNTP 互补的核苷酸，此时反应就会终止。 互补的核苷酸，此时反应就会终止。 当反应物中加入标记的脱氧核苷三磷酸（ ③当反应物中加入标记的脱氧核苷三磷酸（α-32P-dNTP）之后，这种局部消化的 DNA 片 ）之后， 段便起到了一种引物－模板的作用。 段便起到了一种引物－模板的作用。 T4 噬菌体 DNA 聚合酶的主要用途： 聚合酶的主要用途： （p34） （ ） ①补平或标记限制酶消化 DNA 后产生的 3’凹端； ’凹端； 分子进行末端标记； ②对带有 3’突出端或平末端的 DNA 分子进行末端标记； ’ 杂交探针； ③用取代合成法制备高比活性的 DNA 杂交探针； 的末端转化成平末端； ④将双链 DNA 的末端转化成平末端； 模板上的诱变寡核苷酸引物得以延伸。 ⑤使结合于单链 DNA 模板上的诱变寡核苷酸引物得以延伸。 聚合酶（测序酶） （4）经修饰的 T7 噬菌体 DNA 聚合酶（测序酶） ） 来源： 噬菌体感染的大肠杆菌细胞。 组成： 来源：受 T7 噬菌体感染的大肠杆菌细胞。 组成：两种亚基 T7 噬菌体编码的基因 5 蛋白质，相对分子量 84×103； 蛋白质， × ； T7 噬菌体编码的基因 5 蛋白质，相对分子量 84×103； 蛋白质， × ； 聚合酶中合成能力最强的一种。 是已知 DNA 聚合酶中合成能力最强的一种。它所催化合成的 DNA 平均长度比其他 DNA 平均长度大得多。 ’→5’ 聚合酶催化合成的 DNA 平均长度大得多。它的 3’→ ’外切核酸酶活性约为 Klenow 片段 ’→ ’→3’ 的 1000 倍。但没有 5’→ ’外切酶核酸酶活性。 ’→ 外切酶核酸酶活性。 聚合酶的用途： （p34） 修饰的 T7 噬菌体 DNA 聚合酶的用途： （ ） 用于拷贝长段模板的引物延伸反应； ① 用于拷贝长段模板的引物延伸反应； 通过补平或交换（置换）反应进行快速末端标记。 ② 通过补平或交换（置换）反应进行快速末端标记。 (5)TaqDNA 聚合酶及 AmpliTaqTMDNA 聚合酶TaqDNA 聚合酶 聚合酶（ ，从嗜热的水生菌 是耐热的依赖 DNA 的 DNA 聚合酶（分子量 65kD） 从嗜热的水生菌 Thermus aquaticus ） ， 中纯化来，现在以基因工程生产并出售（ 中纯化来，现在以基因工程生产并出售（AmpliTaqTM） ） 。 作用： ’→3’ ’→3’ 作用：具有强的 5’→ ’聚合酶活性和依赖于聚合物的 5’→ ’外切核酸酶活性。以带引 ’→ ’→ 外切核酸酶活性。 为模板，催化互补链的聚合反应， ’→3’ 物的单链 DNA 为模板，催化互补链的聚合反应，使引物按 5’→ ’方向延伸，一般用于 ’→ 方向延伸， 片段。 扩增 1kb 左右的 DNA 片段。 用途： 用途： 用于聚合酶链式反应（ ，对 片段进行体外扩增。 ①用于聚合酶链式反应（PCR） 对 DNA 片段进行体外扩增。 ） ， 测序； ②用于 DNA 测序； 该酶的最佳作用温度为 75～80℃，然而为了避免引物从模板上解离，往往需要在低于 ～ ℃ 然而为了避免引物从模板上解离， 最适温度条件下起始聚合反应 聚合酶。 （6）反转录酶 又称依赖于 RNA 的 DNA 聚合酶或 RNA 指导的 DNA 聚合酶。主要来源 ）反转录酶：又称依赖于 于鼠或禽的反转录病毒。 于鼠或禽的反转录病毒。 鼠源和禽源反转录病毒的不同点： 鼠源和禽源反转录病毒的不同点： ①鼠源反转录酶为单链多肽，具有聚合酶活性，RNA 酶 H 活性较弱；禽源反转录酶为两条 多肽链，也具有聚合酶活性，但 RNA 酶 H 活性很强； ②鼠源反转录酶在 42℃时迅速失活，而禽源反转录酶在 42℃能有效发挥作用，拷贝较复杂 的 mRNA； ③鼠源反转录酶的最佳作用 pH=7.6，而禽源反转录酶则为 pH=8.3。当反应 pH 值离最佳值 仅差 0.2 时，这两种酶催化合成的 cDNA 长度就大大降低。 鼠源和禽源反转录病毒的不同点： 鼠源和禽源反转录病毒的不同点： 禽源反转录酶 两条多肽 聚合活性 RNA 酶 H 活性强 42℃有效 pH8.6 ℃ 鼠源反转录酶 单链多肽 聚合活性 RNA 酶 H 活性弱 42℃失活 pH7.6 ℃ 反转录酶的三种酶活性 酶活性： 反转录酶的三种酶活性： RNA 指导的 DNA 合成反应；DNA 指导的 DNA 合成反应：RNA 的水解反应 合成反应； 合成反应： 反转录酶的主要用途： 反转录酶的主要用途： 文库进行克隆实验； ①将真核基因 mRNA 转录成 cDNA，构建 cDNA 文库进行克隆实验； ， ②对具有 5’突出端的 DNA 片段的 3’端进行填补（补平反应）和标记，制备探针； ’ ’端进行填补（补平反应）和标记，制备探针； 大片段， 序列测定。 ③代替 Klenow 大片段，用于 DNA 序列测定。 DNA 修饰酶※ 修饰酶※ （1）末端脱氧核苷酸转移酶 ） 末端脱氧核苷酸转移酶：简称末端转移酶， 来源于小牛胸腺， 末端脱氧核苷酸转移酶：简称末端转移酶，或 TDT 酶，来源于小牛胸腺，相对分子量 34kD 的碱性蛋白质。在二价阳离子存在下， 的碱性蛋白质。在二价阳离子存在下，末端转移酶能催化 dNTP 加于 DNA 分子的 3’羟基 ’ 端。 作用： 作用： 片段和载体分子加上同聚尾，使之重组起来。 ①给外源 DNA 片段和载体分子加上同聚尾，使之重组起来。 末端的放射性同位素标记。 ②用于 DNA 片段 3’末端的放射性同位素标记。 末端的放射性同位素标记 细菌碱性磷酸酶（ （2）碱性磷酸酶：来源 细菌碱性磷酸酶（BAP）和小牛肠碱性磷酸酶（CIP） ）碱性磷酸酶： ）和小牛肠碱性磷酸酶（ ） CIP 与 BAP 的异同点： 的异同点： 相同点： 相同点：能够催化核酸分子脱掉 5’磷酸基团，使 DNA（或 RNA）片段的 5’－P 末端转 ’磷酸基团， （ ） ’ 末端。 换成 5’－OH 末端。 ’ 不同点： 使用方便经济， 不同点：CIP 使用方便经济，它在加热到 68℃时完全失活，且比活性较 BAP 高 10～20 倍。 ℃时完全失活， ～ BAP 耐热，要终止其活性比较困难，要用酚 氯仿反复抽提多次 耐热，要终止其活性比较困难，要用酚/氯仿反复抽提多次 碱性磷酸酶的作用： 碱性磷酸酶的作用：①防止线性化的载体分子发生自我连接作用，提高重组效率； 防止线性化的载体分子发生自我连接作用，提高重组效率； 子发生自我连接作用 ②用 5’末端标记法时，必须在标记之前先除去 DNA 分子末端的 5’磷酸基，产生 5’羟 ’末端标记法时， ’磷酸基， ’ 探针。 （末端标记法在 噬菌体多核苷酸激酶中讲述） 基，再进行末端标记以制备 DNA 探针。 末端标记法在 T4 噬菌体多核苷酸激酶中讲述） （ （3）T4 噬菌体多核苷酸激酶 ） 来源： 噬菌体感染的大肠杆菌细胞中分离出来的。 来源：是从 T4 噬菌体感染的大肠杆菌细胞中分离出来的。 功能：催化γ 末端， 功能：催化γ－磷酸从 ATP 分子转移给 DNA 或 RNA 分子的 5’－OH 末端，这种作用不 ’ 受底物分子链长短大小的限制，甚至单核苷酸也同样适用。 受底物分子链长短大小的限制，甚至单核苷酸也同样适用。 2.5 单链核酸内切酶 ? （1）S1 核酸酶 ） S1 核酸酶：是米曲霉中提取的一种高度单链特异性核酸内切酶，能降解单链 DNA 和单链 核酸酶：是米曲霉中提取的一种高度单链特异性核酸内切酶 内切酶， RNA，产生带 5’磷酸的单核苷酸或寡核苷酸。 ， ’磷酸的单核苷酸或寡核苷酸。 核酸酶具有较大的抵抗力， 双链 DNA、双链 RNA 和 DNA－RNA 杂交分子对 S1 核酸酶具有较大的抵抗力，只有高浓 、 － 度的酶才可使其消化。 度的酶才可使其消化。它水解单链 DNA 的速率要比水解双链 DNA 快 75000 倍。 S1 核酸酶反应特性： 核酸酶反应特性： pH4.9 时酶活性下降 50％。 最适 pH 为 4.0～4.3， ～ ， ％。 通常酶反应在 pH4.6 进行， 变性。 进行，以防 DNA 变性。酶反应需要低浓度 Zn2+，但可被 EDTA 和柠檬酸盐等螯合剂所抑 ， 溶液也可以抑制它的活性。 制。磷酸缓冲液和 0.6％左右的 SDS 溶液也可以抑制它的活性。在 10～300 mmol／L 范围 ％ ～ ／ 浓度对酶活性无影响。该酶在尿素、 和甲酰胺中稳定。 内变化的 NaCl 浓度对酶活性无影响。该酶在尿素、SDS 和甲酰胺中稳定。 S1 核酸酶的主要功能： 核酸酶的主要功能： ①催化单链 RNA 或单链 DNA 分子降解成 5’单核苷酸。 ’单核苷酸。 能作用于双链核酸分子的单链区，并从此处切断核酸分子， ②能作用于双链核酸分子的单链区，并从此处切断核酸分子，而且这种单链区可以小到只 有一个碱基对。 有一个碱基对。 主要用途： 主要用途： 从限制酶产生的粘性末端中移去单链尾部以产生平末端； ①从限制酶产生的粘性末端中移去单链尾部以产生平末端； 时产生的发夹环结构； ②打开在从 mRNA 合成双链 cDNA 时产生的发夹环结构； 测定杂种核酸分子（ ③测定杂种核酸分子（DNA-DNA 或 RNA-DNA）的杂交程度和结构 ） （2） Bal31 核酸酶 ） 来源：从埃氏交替单胞菌中提取。 来源：从埃氏交替单胞菌中提取。 功能：该酶具有单链特异的核酸内切酶活性 也具有双链特异的核酸外切酶活性。 具有单链特异的核酸内切酶活性， 功能：该酶具有单链特异的核酸内切酶活性，也具有双链特异的核酸外切酶活性。 主要用途： 主要用途： 分子； ①通过可控方式去除双链 DNA 的末端核苷酸从而缩短 DNA 分子； 片段中的限制酶酶切位点的分布； ②定位测定 DNA 片段中的限制酶酶切位点的分布； 分子发生缺失突变。 ③诱发 DNA 分子发生缺失突变。 功能：该酶具有单链特异的核酸内切酶活性，也具有双链特异的核酸外切酶活性。 功能：该酶具有单链特异的核酸内切酶活性，也具有双链特异的核酸外切酶活性。 2.6 核酸外切酶 核酸外切酶：是一类从多核苷酸链的一头开始，按顺序催化降解核苷酸的酶。 核酸外切酶：是一类从多核苷酸链的一头开始，按顺序催化降解核苷酸的酶。 （1）核酸外切酶Ⅶ ）核酸外切酶Ⅶ 核酸外切酶Ⅶ ：是一种促加工的单链核酸外切酶 核酸外切酶Ⅶ（exoⅦ） 是一种促加工的单链核酸外切酶。它能够从 5’末端或 3’末端 Ⅶ ：是一种促加工的单链核酸外切酶。 ’ ’ 分子，产生出寡核苷酸片段 核苷酸片段， 的核酸酶。 降解 DNA 分子，产生出寡核苷酸片段，且还是唯一不需要 Mg2+的核酸酶。 的核酸酶 作用： 作用： 片段； ①可用于回收按 dA-dT 加尾法插入到质粒载体上的 cDNA 片段； ②可用于测定基因组 DNA 中间隔子和表达子的位置 （2）核酸外切酶Ⅲ ）核酸外切酶Ⅲ 核酸外切酶Ⅲ ：催化双链 核酸外切酶Ⅲ（exo Ⅲ） 催化双链 DNA3’羟基端，逐一除去单核苷酸。底物为线状双链 ： ’羟基端，逐一除去单核苷酸。 DNA 及具切口或缺口的环状 DNA，不降解单链 DNA 及 3’黏端双链 DNA。此外还具有另 ， ’ 。三种活性， 特异的内切核酸酶活性、 三种活性，即无嘌呤 DNA 特异的内切核酸酶活性、RNase H 活性及 3’磷酸酶活性（去除 ’磷酸酶活性（ 3’末端磷酸） ’末端磷酸） 。 主要用途（ ’→5’ 分子产生出单链区。 主要用途（p40） ：通过其 3’→ ’外切酶活性使双链 DNA 分子产生出单链区。 ） ’→ 外切酶活性使双链 （3） λ噬菌体核酸外切酶 ） 噬菌体核酸外切酶： 末端进行逐步的加工和水解， λ噬菌体核酸外切酶：能催化双链 DNA 分子自 5’－P 末端进行逐步的加工和水解，释放 ’ 末端。 出 5’－单核苷酸，但它不降解 5’－OH 末端。 ’ 单核苷酸， ’ 用途： 用途： 序列分析使用； ①将双链 DNA 转变成单链的 DNA，供按双脱氧法进行 DNA 序列分析使用； ， ②从双链 DNA 中移去 5’突出末端，以便用末端转移酶进行加尾 ’突出末端， 第三章 基因克隆载体 教学目的和教学要求: 教学目的和教学要求 1. 掌握克隆载体的定义 2. 熟悉载体的种类和特征 3. 掌握构成载体的必要条件 4. 掌握一般质粒载体的特点 5. 掌握穿梭载体的特点 6. 了解质粒载体命名法则 7. 了解各种载体构建的方式和策略 一、克隆载体定义 指能够承载外源基因，并将其带入受体细胞， 指能够承载外源基因，并将其带入受体细胞，同时使目的 DNA 分子得以稳定维持 的运载工具。 载体的本质： 的运载工具。 载体的本质：双链的 DNA 分子 即把目的基因通过基因工程手段送到生物细胞（受体细胞）所需要的运载工具就叫做载体。 即把目的基因通过基因工程手段送到生物细胞（受体细胞）所需要的运载工具就叫做载体。 质粒载体 噬菌体载体 粘粒载体 病毒载体 目的基因不经载体直接导入细胞的结果： 目的基因不经载体直接导入细胞的结果： 目的基因被降解 目的基因无法表达 （一）应用载体的必要性 （1）载体中包含了许多基因转录所需要的物质，如一个基因要转录，就需要启动子和终止 ）载体中包含了许多基因转录所需要的物质，如一个基因要转录， 子。 （2）启动子和终止子通常不在目的基因上，所以只能位于载体上。 ）启动子和终止子通常不在目的基因上，所以只能位于载体上。 （3）载体中必须要有标记基因，可起到筛选作用。 ）载体中必须要有标记基因，可起到筛选作用。 二、载体的分类 一）按功能进行分类 克隆载体 λ噬菌体 粘性质粒 M13 噬菌体 表达载体 大肠杆菌表达载体 哺乳动物表达载体 哺乳动物表达载体 整合载体 1. 构建 cDNA 文库： 文库： 为模板， 片段，与载体重组后转入受体菌， 以 mRNA 为模板，通过 RT-DNA，合成 cDNA 片段，与载体重组后转入受体菌， ， 得到所有重组载体， 文库。 得到所有重组载体，总称 cDNA 文库。 2. 构建 DNA 文库： 文库： 切割后，与载体连接后转入受体菌， 利用内切酶将体细胞染色体 DNA 切割后，与载体连接后转入受体菌，得到的重组 信息， 文库。 体包含了所有基因组 DNA 信息，总称基因组 DNA 文库。 3. 为研究某一基因的作用，克隆特定的目的基因。 为研究某一基因的作用，克隆特定的目的基因。表达载体的用途： 表达载体的用途： 1. 研究组织细胞内结构和功能蛋白的作用； 研究组织细胞内结构和功能蛋白的作用； 2. 为生产某种功能蛋白提供物质基础。 为生产某种功能蛋白提供物质基础。 定点打靶； 基因修复； 整合载体的用途 :1. 定点打靶；2. 基因修复；3. 定点表达 载体按来源进行的分类 质粒载体 枯草杆菌质粒载体 酵母菌质粒载体 农杆菌 Ti 质粒载体 噬菌体载体 λ 噬菌体载体 Cos 噬菌体载体 病毒载体 质粒克隆载体 特点： 能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息, 会赋予宿主细胞一些遗传性状。 特点： 能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息 会赋予宿主细胞一些遗传性状。 （一）质粒分子大小 :（几 kb～几百 kb） （ ～ ） 质粒ＤＮＡ复制的特点：在宿主细胞内；单向复制； ＤＮＡ复制的特点 质粒ＤＮＡ复制的特点：在宿主细胞内；单向复制；受质粒和宿主细胞双重遗传系统的控 制。 （二）质粒性质 １. 质粒组成与构型 分子（细菌、真菌、蓝藻、绿藻） （1）质粒组成与分布：染色体以外的双链 DNA 分子（细菌、真菌、蓝藻、绿藻） ）质粒组成与分布： ； （2）质粒结构与构型： ）质粒结构与构型： ccc-DNA、 oc-DNA、 l-DNA、 SS-DNA 、 、 、 (共价闭环状 DNA) (开环 DNA) (线性 DNA) （单链 DNA） 共价闭环状 开环 线性 ） 构建质粒的必要条件: （三）构建质粒的必要条件 1.克隆位点 克隆位点 2. 复制起始位点（携带外源基因进入受体细胞，进行自我复制或整合到染色体 DNA 上） 复制起始位点（携带外源基因进入受体细胞， 3. 选择性标记基因 4. 具有较小的分子量和较高拷贝数 5. 安全性 6. 易从宿主细胞中回收。 易从宿主细胞中回收。 为什载体要进行构建？ 基因背景不清楚； 无用基因较多； 存在致病基因; 为什载体要进行构建？1. 基因背景不清楚；2. 无用基因较多；3. 存在致病基因 4. 达不到基因克隆的要求。 达不到基因克隆的要求。 (四)基因克隆载体的理想质粒必须满足的条件 四 基因克隆载体的理想质粒必须满足的条件 松弛性)---拷贝多 有效复制。 （1）具有复制起始点 松弛性 拷贝多 有效复制。 ）具有复制起始点(松弛性 拷贝多,有效复制 （2）具有多种限制酶的多克隆单一识别位点（MCS） ）具有多种限制酶的多克隆单一识别位点（ ） （3）具有两种易被检测的选择性标记 ） （4）具有尽可能小的相对分子质量 ） 组装各种“元件 （5）根据需要构建不同用途的克隆载体 组装各种 元件 ，如启动子、终止子等 ）根据需要构建不同用途的克隆载体,组装各种 元件”，如启动子、 （6）应为非传递性质粒（即安全性） ）应为非传递性质粒（即安全性） （五）质粒克隆载体构建的原则 1. 选用合适的出发质粒，选择正确克隆载体元件 选用合适的出发质粒， 2. 正确获得构建质粒克隆载体的元件 3. 引入易于检测的选择标记，去掉部分非必须序列 引入易于检测的选择标记， 4. 启动子最好选择外界条件诱导的原核基因启动子 5. 引入多用途的辅助序列，构建特化功能的载体。 引入多用途的辅助序列，构建特化功能的载体。 6. 构建载体的过程应力求简单。 构建载体的过程应力求简单。pBR322 质粒载体的构建过程可简单地概括如下： 质粒载体的构建过程可简单地概括如下： 质粒为基础出发， 转座子， （1）从 pMB1 质粒为基础出发，引入 Rldrd19 质粒的 Tn3 转座子，得到 13.3kb 的 pMB3 ） 质粒； 质粒； 酶切下将大部分无用片段切去， 的黏性末端连接 （2） pMB3 在 EcoRI 酶切下将大部分无用片段切去，留下小片段 DNA 的黏性末端连接 ） 质粒（ 起来后就形成了 pMB8 质粒（2.6kb） ） ； 片断， （3） 此时，另一种 pSC101 质粒在 EcoRI 消化下产生含有 tetr 抗性的 DNA 片断，这个片 ） 此时， 表型； 断和 pMB8 整合在一起就形成了 pMB9 质粒 5.3kb） 此时 pMB9 为 ampstetr 表型； （ ） 。 已初步具备载体的功能， 为使它更加完善， 性能， （4） pMB9 已初步具备载体的功能，为使它更加完善，让它具备 amprtetr 性能，在 pMB9 ） 转座子， 可以来也可以走，为了留住它， 上引入 pSF2124 的 Tn3 转座子，但 Tn3 可以来也可以走，为了留住它，我们切去了 Tn3 中表达转位酶基因，形成了 pBR313 质粒。 中表达转位酶基因， 质粒。 后分两步操作： 点除去， 质粒； 后分两步操作：一把 pBR313 的 PstI 位点除去，使成为 tetr 表型的 pBR318 质粒； 的位点切除， 质粒。 （5）另一把 pBR313 的 EcoRII 的位点切除，使之成为 amprtets 表形的 pBR320 质粒。 ） 由此得到了两种功能互补的质粒，将两质粒杂交就得到一种接近全能的载体质粒， 由此得到了两种功能互补的质粒，将两质粒杂交就得到一种接近全能的载体质粒， 这就是 pBR322 。 pBR322 的应用 构建水稻叶绿体 DNA 基因组库。2. 构建重组人体的抑生长激素基因。 的应用:1.构建水稻叶绿体 基因组库。 构建重组人体的抑生长激素基因。 pBR322 质粒载体的特点： 质粒载体的特点： 相对分子量小； 具有一个复制起始点（ ） 属松弛复制型； 具有较高的拷贝数； ，属松弛复制型 ①相对分子量小；②具有一个复制起始点（ori） 属松弛复制型；③具有较高的拷贝数； ， 含有两个选择标记基因（ ；⑤ 种限制酶的单一识别位点。 ④含有两个选择标记基因（ Tetr 和 Ampr ） ⑤有 24 种限制酶的单一识别位点。 ； 穿梭质粒（ 六、穿梭质粒（Shuttle plasmid）载体定义 ） 是指一类由人工构建的具有两种不同复制起点和选择标记， 是指一类由人工构建的具有两种不同复制起点和选择标记，因而可在两种不同的寄 主细胞中存活和复制， 在不同物质的细胞之间穿梭的质粒载体。 主细胞中存活和复制，并可以携带外源 DNA 在不同物质的细胞之间穿梭的质粒载体。 常见的穿梭质粒类型： 常见的穿梭质粒类型： 大肠杆菌－ 大肠杆菌－枯草杆菌穿梭质粒载体 大肠杆菌－ 大肠杆菌－酿酒酵母穿梭质粒载体 大肠杆菌－ 大肠杆菌－动物细胞穿梭质粒载体 通常穿梭载体可以在细菌中用于克隆、扩增克隆的基因; 通常穿梭载体可以在细菌中用于克隆、扩增克隆的基因 在酵母菌中用于基因表达分析。 在酵母菌中用于基因表达分析。 农杆菌 Ti 质粒载体的构建 Ti 质粒（细菌质粒） 自然存在于革兰氏阴菌 质粒（细菌质粒） 自然存在于革兰氏阴菌――土壤农杆菌细胞中。土壤农杆菌可感染大 ：自然存在于革兰氏阴菌 土壤农杆菌细胞中。 ： 土壤农杆菌细胞中 多数双子叶植物的受伤部位，使之产生冠瘿瘤。 多数双子叶植物的受伤部位，使之产生冠瘿瘤。 质粒的改造（ ） 关于天然 Ti 质粒的改造（1） ： 删除植物激素基因； 删除冠瘿碱合成基因； ① 删除植物激素基因；② 删除冠瘿碱合成基因；③ 删除不必要的大片段 DNA； ； 质粒的改造（ ） 加上功能序列 加上功能序列) 关于天然 Ti 质粒的改造（2）(加上功能序列 信号序列等） （1）加上选择性标记、真核细胞调控信号（启动子、 poly(A)信号序列等） ）加上选择性标记、真核细胞调控信号（启动子、 信号序列等 ； 复制起始位点； （3） 右边界序列； （2）DNA 复制起始位点； ） T-DNA 右边界序列； ） （ （4）单克隆位点、限制性内切酶复制起始位点 ）单克隆位点、限制性内切酶复制起始位点. 标记基因的种类 1）抗性标记基因（可直接用于选择转化子） ）抗性标记基因（ 直接用于选择转化子） a. 抗生素抗性基因 Apr ，Tcr ，Cmr，Kanr，G418r，Hygr ，Neor 抗生素抗性基因: ， ， ， b. 重金属抗性基因 Cur ，Znr ，Cd r 重金属抗性基因: c. 代谢抗性基因 TK，抗除草剂基因 代谢抗性基因: ， 2）营养标记基因（可直接用于选择转化子） ）营养标记基因（可直接用于选择转化子） 主要是参与氨基酸，核苷酸及其他必需营养物合成酶类的基因， 主要是参与氨基酸，核苷酸及其他必需营养物合成酶类的基因， 这类基因在酵母 转化中使用最频繁， 转化中使用最频繁，如 TRP1，URA3，LEU2，HIS4 等。 ， ， ，3）生化标记基因 ） 其表达产物可催化某些易检测的生化反应 达产物可催化某些易检测的生化反应， 其表达产物可催化某些易检测的生化反应，如 lacZ, GUS, CAT 4） 噬菌斑 ） 逆病毒克隆载体 (1) 逆病毒用于载体的优点 逆病毒用于载体的优点: i. 基因组小 易于操作；ii. 高滴度 易于导入细胞； 基因组小, 易于操作； 高滴度, 易于导入细胞； iii. 准确整合入受体细胞染色体中 外源基因可稳定表达，具有强转录增强子 可在多种 准确整合入受体细胞染色体中, 外源基因可稳定表达，具有强转录增强子, 细胞中高效表达外源基因。 细胞中高效表达外源基因。 （2）逆病毒载体的用途 ） i. 基因治疗； ii. 在胚胎组织中研究特定基因的发育功能； 基因治疗； 在胚胎组织中研究特定基因的发育功能； iii. 可用作家系标记；iv. 导入生殖细胞或胚胎干细胞 产生转基因动物； 可用作家系标记； 导入生殖细胞或胚胎干细胞, 产生转基因动物； v. 用作插入突变剂；vi. 用于逆病毒分子生物学研究。 用作插入突变剂； 用于逆病毒分子生物学研究。 （3）逆病毒的生活史和基因组结构 ） 生活史: 生活史 分子→ 病毒粒子感染 → 反转录为线状 ds-DNA → 整合到染色体中转录为 2 个 mRNA 分子→ 翻译成病毒蛋白 → 包装成病毒粒子 → 释放到细胞外 （4） 逆病毒的宿主范围 ） i. 种特异性 窄谱 如鼠白血病病毒 （M-MLV）仅限于鼠细胞； 种特异性---窄谱 窄谱): ）仅限于鼠细胞； 广谱性: 在鸟和哺乳动物细胞, 所构建的载体也可具广谱性, 广谱性 如 MLV 在鸟和哺乳动物细胞 用 M-MLV 所构建的载体也可具广谱性 只要用 广谱逆病毒的外壳蛋白包装即可 装即可。 广谱逆病毒的外壳蛋白包装即可。 ii. 组织特异性 成纤维细胞 淋巴细胞 上皮细胞 组织特异性---成纤维细胞 淋巴细胞, 上皮细胞. 成纤维细胞, iii. 免疫性 (5) 逆病毒克隆载体 i. 单基因载体 序列, 仅保留逆病毒的 LTR 序列 无标记基因 ii. 双基因载体 剪接载体 内启动子载体 双顺反子载体。 双基因载体: 剪接载体; 内启动子载体; 双顺反子载体。 在剪接载体中, 序列和剪接位点保留, 在剪接载体中 逆病毒的 LTR 序列和剪接位点保留 两基因共用一个启动子和翻译起始 在双顺反子载体中, 两基因共用一个基因启动子, 但有各自的翻译起始区; 区; 在双顺反子载体中 两基因共用一个基因启动子 但有各自的翻译起始区 在内启动子 载体中, 载体中 两基因各有自己的启动子 iii. 自失活载体 iv. 自主复制载 自主复制载 反转录病毒克隆载体（ 病毒） 七、反转录病毒克隆载体（RNA 病毒） （一）劳斯肉瘤病毒的生物学特性 RSV：含两条相同的 38S RNA（下图）; 与宿主细胞提供的 tRNATrp 结合处：PBS +ve、 结合处： ： （下图） 、 PBSCve C 结构: i. 长末端重复 长末端重复(long terminal repeat, LTR) 结构 ii. 正链和反链引物序列 PB(-), PB(+) iii. 包装序列Ψ(gag 基因编码区 5’-端 420 bp 序列 包装序列Ψ 序列) 端 iv. 反式作用基因 gag―核心蛋白 pol―反转录酶 整合酶 env-外壳糖蛋白； ―肉 反式作用基因: 核心蛋白; 反转录酶/整合酶 外壳糖蛋白； 核心蛋白 反转录酶 整合酶; 外壳糖蛋白 src 肉 瘤基因。 瘤基因。 v. RNA 剪接供体和受体序列 SD, SA 1.反转录病毒 质粒载体 反转录病毒-质粒载体 反转录病毒 关键步骤： 关键步骤：体外利用 DNA 重组删去原病毒的 gag、pol、env 等序 、 、 列，保留两端 LTR 序列以及 PBS+ve、PBS-ve、psi（包装）位点， 、 、 （包装）位点， 插入合适的选择标记如 neo、gpt 等。 、 特点：更高的转化效率， 特点：更高的转化效率，基因转移成功率 100% 改进：鉴于危险性，已建立了不需辅助反转录病毒的克隆载体系统。 改进：鉴于危险性，已建立了不需辅助反转录病毒的克隆载体系统。将缺失 psi 位点的原病 转化动物受体细胞，获得全部包装蛋白质，即辅助细胞。 毒 DNA 转化动物受体细胞，获得全部包装蛋白质，即辅助细胞。（二）腺病毒载体构建 腺病毒载体构建 特点：易感染性、宿主范围广、毒性低（安全） 可容纳的外源基因大、 、可容纳的外源基因大 特点：易感染性、宿主范围广、毒性低（安全） 可容纳的外源基因大、不整合入宿主染色 、 体 DNA。 。 个血清型， 人类腺病毒有 51 个血清型，常用的是 Ad5 和 Ad2 型。进入宿主细胞后以复制为界分早晚 两个基因表达时期。早期基因(E ～ ４ 编码调节因子 晚期基因编码病毒结构蛋白。 编码调节因子， 两个基因表达时期。早期基因 1～E４)编码调节因子，晚期基因编码病毒结构蛋白。野生 型腺病毒容纳最大外源 DNA 为 2kb。理论上，除基因组两端约 500bp 的顺式结构 和 包装 。理论上， 必需结构 外，其他结构均可被替换成外源 DNA。 。 思考题 1、名词解释：Cos 位点、受纳细胞、非受纳细胞 位点、受纳细胞、 、名词解释： 2、构建λ噬菌体载体的策略及其技术路线。 、构建λ噬菌体载体的策略及其技术路线。 3、试从 cosmid 克隆载体的构建策略上说明其特征。 克隆载体的构建策略上说明其特征。 、 4、简述病毒的溶原性和溶菌性增殖途径。 、简述病毒的溶原性和溶菌性增殖途径。 5、M13 噬菌体载体有何优点和用途？ 噬菌体载体有何优点和用途？ 、 6、简述腺病毒克隆载体的策略及其主要用途。 、简述腺病毒克隆载体的策略及其主要用途。 7、痘苗病毒克隆载体有何特点？为什么要用同源重组方式构建？ 、痘苗病毒克隆载体有何特点？为什么要用同源重组方式构建？ 8、如何构建反转录病毒载体？举例说明。 、如何构建反转录病毒载体？举例说明。 3．3 ． 染色体定位整合克隆载体 质粒与病毒克隆载体的不足： 质粒与病毒克隆载体的不足： 1、转基因生物中游离的外源 DNA 分子能多拷贝复制，但易丢失，导致转基因生物的不稳 分子能多拷贝复制，但易丢失， 、 定性 2、随机插入染色体的外源 DNA 片段能稳定维持，但因插入的位点不确定，可能干扰受体 片段能稳定维持，但因插入的位点不确定， 、 细胞基因组的自稳系统 进而导致有害突变，造成选育转基因生物不可知性， 细胞基因组的自稳系统，进而导致有害突变，造成选育转基因生物不可知性，增加难度 基因整合平台系统――基因定位同源重组(基因打靶 ――基因定位同源重组 基因打靶) 基因整合平台系统――基因定位同源重组 基因打靶 整合平台： 区域， 定位整合的位置。 整合平台：即受体细胞基因组上给定的 DNA 区域，是外源 DNA 定位整合的位置。 定位整合克隆载体： 除一般质粒克隆载体必备的元件外， 定位整合克隆载体： 除一般质粒克隆载体必备的元件外， 还含有一个或两个与整合平台 DNA 区域核酸序列同 片段（长度最好＞ 源的 DNA 片段（长度最好＞1kb） ） 一、定位整合克隆载体的几种模式 （一）内源平台双交换置换克隆载体 （二）外源平台双交换置换克隆载体 （三）内源平台双交换插入克隆载体 人工染色体克隆载体的应用: 构建基因组文库;基因治疗 基因治疗； 人工染色体克隆载体的应用 构建基因组文库 基因治疗；基因功能鉴定 3.5.4 组织特异性表达克隆载体 乳腺组织特异性表达克隆载体 构建基因工程药物的生物反应器:如人凝血因子Ⅸ 构建基因工程药物的生物反应器 如人凝血因子Ⅸ 如人凝血因子 此外， 此外，EPO、hALB 均在动物乳腺组织中得以表达 、 肿瘤细胞特异性表达克隆载体 基因治疗常用携带某种目的基因的特定载体导入 靶细胞，希望能在肿瘤细胞内有效表达产物，杀伤肿瘤细胞。 靶细胞，希望能在肿瘤细胞内有效表达产物，杀伤肿瘤细胞。 ――杀伤肿瘤细胞的同时 正常细胞也受到损伤。 杀伤肿瘤细胞的同时， ――杀伤肿瘤细胞的同时，正常细胞也受到损伤。 肿瘤细胞特异性高效表达的启动子与肿瘤杀伤基因组成嵌合基因。 肿瘤细胞特异性高效表达的启动子与肿瘤杀伤基因组成嵌合基因。 思考题 1、名词解释：人工染色体、诱导型表达克隆载体 、名词解释：人工染色体、2、启动子探针型载体的检测部件组成。 、启动子探针型载体的检测部件组成。 3、染色体定位整合系统的组成。 、染色体定位整合系统的组成。 第四章 目的基因制备 教学目的和教学要求： 教学目的和教学要求： 1.掌握目的基因的概念 掌握目的基因的概念 2.掌握原核生物基因的组成 掌握原核生物基因的组成 3.掌握真核生物基因的组成 掌握真核生物基因的组成 4.熟悉其他基因组基因的组成特点 熟悉其他基因组基因的组成特点 5.掌握构建基因文库分离目的基因的基本步骤 掌握构建基因文库分离目的基因的基本步骤 6.了解目的基因化学合成法的步骤 了解目的基因化学合成法的步骤 7.了解从基因组 DNA 文库获取目的基因 了解从基因组 一、目的基因 在生物群体中分离具有优良性状的编码蛋白的结构基因（ ，从而 在生物群体中分离具有优良性状的编码蛋白的结构基因（ structural gene） 从而 ） ， 创造出有价值的新物种、表达新的生物学性状以及通过生物体获得相应产物；根据研究 创造出有价值的新物种、表达新的生物学性状以及通过生物体获得相应产物；根据研究 的特殊目的所选取的基因。 的特殊目的所选取的基因。 基因区、 （一） 结构基因组成 (基因区、启动区 基因区 启动区) 转录启动区+核糖体识别区 编码区(起始码 核糖体识别区+编码区 转录启动区 核糖体识别区 编码区 起始码 ATG、ORF、终止码 TAG）等终止转录区 、 、 ） （二）原核生物基因的组成 基因区：操纵子（ 基因区：操纵子（operon）序列，基因之间有间隔序列。 ）序列，基因之间有间隔序列。 启动区： 聚合酶识别、结合和开始转录的片段。 启动区：RNA 聚合酶识别、结合和开始转录的片段。 SD 区：起始码 ATG 上游约 10bp 处的富含嘌呤的保守区，其转录物：5’AGGAGGT3’，核 处的富含嘌呤的保守区，其转录物： ， 糖体 16S rRNA 识别和结合 mRNA 位置 转录终止子和终止因子： 序列； 转录终止子和终止因子：分别指基因或操纵子 3’ 端提供转录终止信号的 DNA 序列；协助 mRNA 聚合酶识别终止信号的辅助蛋白。原核终止子在终止点之前有一回文结构， 聚合酶识别终止信号的辅助蛋白。原核终止子在终止点之前有一回文结构， 转录物形成茎环发夹。 转录物形成茎环发夹。 SD 序列：起始密码 AUG 上游约 10bp 处的富含嘌呤保守序列区（5’-AGGAGGU-3’序列） 序列： 处的富含嘌呤保守序列区（ 序列） 序列 互补,是 的位置， 与 16SrRNA3-’序列 3’-UCCUCCA-5’互补 是 16SrRNA 识别结合 mRNA 的位置， 序列 互补 核糖体由此位置向前移动,寻找 密码子。 核糖体由此位置向前移动 寻找 AUG 密码子。 基因区： 基因区：ATG + extrons + introns + TAA（TGA 或 TAG） （ ） 转录启动区： 、 、 聚合酶Ⅰ 转录。 转录启动区：r、m、tRNA 分别由 RNA 聚合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ转录。 编码蛋白的启动子( 聚合酶Ⅱ识别)可寻找三个保守区 可寻找三个保守区： 编码蛋白的启动子 RNA 聚合酶Ⅱ识别 可寻找三个保守区： -20~-30 的 TATAA/TA 区(Hogness 框)：解链，决定起录点； ：解链，决定起录点； -75 的 9bp 共有序列 GGT/CCAATCT 区(CAAT 框)：与 RNA 聚合酶结合有关； 聚合酶结合有关； ： -75 区上游有一共有序列 GGGCGC (GC 框):结合转录因子； 结合转录因子； 结合转录因子 真核生物基因的组成 基因区： 基因区：ATG + extrons + introns + TAA（TGA 或 TAG） （ ） 转录启动区： 、 、 聚合酶Ⅰ 转录。 转录启动区：r、m、tRNA 分别由 RNA 聚合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ转录。 编码蛋白的启动子( 聚合酶Ⅱ识别)可寻找三个保守区 可寻找三个保守区： 编码蛋白的启动子 RNA 聚合酶Ⅱ识别 可寻找三个保守区： -20~-30 的 TATAA/TA 区(Hogness 框)：解链，决定起录点； ：解链，决定起录点； -75 的 9bp 共有序列 GGT/CCAATCT 区(CAAT 框)：与 RNA 聚合酶结合有关； 聚合酶结合有关； ： -75 区上游有一共有序列 GGGCGC (GC 框):结合转录因子； 结合转录因子； 结合转录因子 转录终止区:含有终止子 含有终止子。 转录终止区 含有终止子。 4. 真核生物转录的调节控制（1）顺式作用元件： ）顺式作用元件： 序列，包括：核心启动子， 上游启动子， 可影响自身基因表达的 DNA 序列，包括：核心启动子，如 TATA 框；上游启动子， 远上游顺序，如增强子，衰减子、 静息子等。 如 CAAT 框,GC 框；远上游顺序，如增强子，衰减子、 静息子等。 ：通过与特异的顺式作用元件相互作用 （2）反式作用因子（trans-acting factor） 通过与特异的顺式作用元件相互作用（DNA-蛋 ）反式作用因子（ ） 通过与特异的顺式作用元件相互作用（ ： 蛋 白质相互作用） 或通过与其它调节因子的相互作用（蛋白质-蛋白质相互作用 ， ，或通过与其它调节因子的相互作用 蛋白质相互作用） ，反式激活 白质相互作用） 或通过与其它调节因子的相互作用（蛋白质 蛋白质相互作用） 反式激活 ， 另一基因的转录。 另一基因的转录。 反式作用因子可以分为 3 类： 通用反式作用因子，识别启动子的核心启动成分， 通用反式作用因子，识别启动子的核心启动成分，如 TBP； ； 特殊细胞的反式作用因子， 特殊细胞的反式作用因子，如淋巴细胞中的 Oct-2； ； 同反应性元件结合的反式作用因子， ，GRE（糖皮质激素反应 同反应性元件结合的反式作用因子，如 HSE（热休克反应元件） （热休克反应元件） ， （ 元件） ；TRE（肿瘤诱导剂反应元件 相应的反式作用因子。 相应的反式作用因子。 元件） MRE（金属反应元件） ； （金属反应元件） ； （肿瘤诱导剂反应元件)相应的反式作用因子 （四） 其他基因组基因的组成特点 1. 质粒基因：不含内含子 质粒基因： 2. 病毒 噬菌体 基因：重复基因，多顺反子转录。 病毒(噬菌体 基因：重复基因，多顺反子转录。 噬菌体)基因 3. 线粒体基因：多顺反子转录，无 SD 序列区。 线粒体基因：多顺反子转录， 序列区。 4. 叶绿体基因：多顺反子转录 叶绿体基因： 上碱基的编码序列具有一定的特殊意义。 （五）基因排列的特殊性 直线排列于 DNA 上碱基的编码序列具有一定的特殊意义。 1. 重叠基因 2. 重复基因 真核基因是多拷贝基因。 约 30%真核基因是多拷贝基因。 真核基因是多拷贝基因 3. 加倍基因 倍性染色体和多倍基因不易获得基因突变体， 倍性染色体和多倍基因不易获得基因突变体， 同时为外源基因的整合创造了 条件。 条件。 4. 基因重排 同意基因簇处在不同细胞中时，基因的排列顺序会发生改变。 同意基因簇处在不同细胞中时 基因的排列顺序会发生改变。 基因簇处在不同细胞中时， 二、目的基因的制备 （一） 直接分离法 1. 限制性核酸内切酶酶切分离法 ①已定序（一次或多次酶切、纯化） ②已定位（两侧 限制性核酸内切酶酶切分离法: 已定序（一次或多次酶切、纯化） ；② ； 已定位（ 的识别位点酶切） 未定序或无定位（酶切、构建简单文库钓出） ；③ 的识别位点酶切） ③未定序或无定位（酶切、构建简单文库钓出） ； 2. 物理化学分离法 (1) 密度梯度离心法 (GC 非洲爪蛙 rRNA) (2) 单链酶解法 单链酶解法(GC 的热稳定度高 海胆 rRNA) (3) 分子杂交法 分子杂交法(DNA 互补 β半乳糖 苷酶基因) 苷酶基因 3. 双抗体免疫法分离编码蛋白的基因 的多聚核糖体→ （1） 利用抗体 分离 mRNA 的多聚核糖体→ 复合+二抗 ） 利用抗体+分离 二抗 ↓ Rephrase 4B 亲和层→不连续的蔗糖梯度离心 亲和层→ ↓ 分离 氯仿---抽提 柱层析--（2）酚---氯仿 抽提 oligo dT 柱层析 mRNA---cDNA ） 氯仿 抽提/ （二） 酶促合成法制取目的基因 为模板， 是以某一目的基因的 mRNA 为模板，用逆转录酶先合成其互补的 DNA（cDNA）的 （ ） 第一链， 第一链，再酶促合成双链 cDNA。 。 真核生物细胞中的 mRNA 高丰度 mRNA（较适于此方法） 低丰度 mRNA （较适于此方法） mRNA----- cDNA 分离合成分子量较大，转录产物 mRNA 易分离的目的基因。 分离合成分子量较大， 易分离的目的基因。 （三）构建基因组文库分离法 在一种载体分子中随机地克隆着某种生物的器官、 在一种载体分子中随机地克隆着某种生物的器官、 组织或细胞类型的所有的 DNA 片 段而构成的克隆集合体。在理想的情况下，它应包含该物种的全部遗传信息。 段而构成的克隆集合体。在理想的情况下，它应包含该物种的全部遗传信息。文库， 基因文库也称 DNA 文库，包括基因组文库和 cDNA 文库两种类型 1. 几个基本概念 基因测序“鸟枪法” 霰弹法 ） 基因测序“鸟枪法”“霰弹法”： （ 是先将整个基因组打乱，切成随机碎片，然后测定每个小片段序列， 是先将整个基因组打乱，切成随机碎片，然后测定每个小片段序列，最终利用计算机 对这些切片进行排序和组装，并确定它们在基因组中的正确位置。 对这些切片进行排序和组装，并确定它们在基因组中的正确位置。 基因组 DNA 文库 用限制酶切， 重组，再全部转化宿主细胞， 将某一基因组 DNA 用限制酶切，与载体 DNA 重组，再全部转化宿主细胞，存在于转 文库。 化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组 DNA 的集合称为基因组 DNA 文库。 cDNA 文库： 文库： 为模板， 以某种细胞的全部 mRNA 为模板，利用逆转录酶合成与 mRNA 互补的 DNA（cDNA） （ ） 与适当的载体连接后转化入受体菌， 的种群， 再复制成双链 cDNA,与适当的载体连接后转化入受体菌，得到含全部表达基因的种群，称 与适当的载体连接后转化入受体菌 得到含全部表达基因的种群 文库(cDNA library)。 为 cDNA 文库 。 cDNA 文库具有组织细胞特异性。 文库具有组织细胞特异性。 基因组文库的大小 （Clark 和 Carbon 的经验公式 基因组文库的克隆数目=基因组 全长/DNA 插入片段的平均长度 基因组文库的克隆数目 基因组 DNA 全长 N=In(1-P)/In(1-f) 其中： 克隆数目; 片段出现的概率; 其中： N-------克隆数目 P---------含目的基因 DNA 片段出现的概率 克隆数目 含目的基因 f--------插入片段的大小与全基因组大小的比值。 插入片段的大小与全基因组大小的比值。 插入片段的大小与全基因组大小的比值 从基因组 DNA 文库获取目的基因 组织或细胞染色体 DNA↓限制性内切酶基因片断↓克隆载体重组 DNA 分子↓受体菌含重组分子的转化菌 3. 构建λ噬菌体基因组文库的步骤 构建λ 片段； （1）获取含基因的 DNA 片段； ） 物理方法: 超声波切割； 生物化学方法: ① 物理方法 超声波切割；②生物化学方法 酶切 Alu I , Hae II , Mbo I, Sau 3AI； ； 噬菌体克隆载体重组。 （2）与λ噬菌体克隆载体重组。 ） 克隆载体（柯斯质粒载体） （四）cosmid 克隆载体（柯斯质粒载体） 1.构建策略：由质粒和含 cos 位点的λDNA 片段组装成的载体，即 cosmid。 构建策略： 位点的λ 片段组装成的载体， 构建策略 。 2. 柯斯质粒 柯斯质粒(cosmid) 一种人工构建的克隆载体， 包含λ 基因。 柯斯质粒能被包装到λ 一种人工构建的克隆载体， 包含λ噬菌体的 cos 基因。 柯斯质粒能被包装到λ噬菌体粒子 感染大肠杆菌 片段（ 中，感染大肠杆菌；它携带入宿主细菌的 DNA 片段（超过 45kb）比质粒载体携带的要 ） 大得多。 大得多。 3. cosmid 的特征 分子, 一般＜ （1）环形双链 DNA 分子 ≤36.4kb, 一般＜10kb ） （2）具有质粒的性质，可转化大肠杆菌，并按质粒方式复制； ）具有质粒的性质，可转化大肠杆菌，并按质粒方式复制； 末端→ （3）含有一个 cos 位点 A 蛋白 cos 末端→体外包装成为噬菌体 ） 较小， （4）cosmid 较小，可承载更大的外源 DNA； ） ； 若 cosmid 为 6.5kb，则可承载 44.5(51-6.5)kb 外源 DNA，且能被包装成具有感染能力的噬 ， ， 菌体颗粒。因此， 克隆广泛用于构建基因组文库。 菌体颗粒。因此，cosmid 克隆广泛用于构建基因组文库。 (五) YAC 载体基因组文库 五1. 真 核 生 物 染 色 体 的 几 个 关 键 部 位 ： *** （ 1 ） 着 丝 粒 （ CEN ） 2 ） 端 粒 （ TEL ） （ （4）选择标记（ ） （3）自主复制序列（ARS） ）选择标记（5）克隆位点 ）自主复制序列（ ） （ YAC 载体是以质粒形式出现，因此常以 pYAC 形式出现。 载体是以质粒形式出现， 形式出现。 (六) 构建基因文库分离目的基因的基本步骤 六 (1) 从组织细胞中制备高纯度的染色体基因组 DNA； ； (2) 用合适的限制酶把 DNA 切割成许多片段； 切割成许多片段； (3) DNA 片段群体与适当的载体分子在体外重组； 片段群体与适当的载体分子在体外重组； (4) 重组载体 或包装成重组噬菌体 被引入受体细胞； 重组载体(或包装成重组噬菌体 被引入受体细胞； 或包装成重组噬菌体)被引入受体细胞 (5) 在培养基上生长繁殖成重组菌落或噬菌斑，即克隆； 在培养基上生长繁殖成重组菌落或噬菌斑，即克隆； (6) 设法筛选出含有目的基因 DNA 片段的克隆。 片段的克隆。 (七) 真核基因组 DNA 文库的构建过程 七 （1）从细胞中分离制备高分子量和高纯度的基因组 DNA ） （2）高分子量基因组 DNA 的限制酶部分消化 ） （3）含有目的基因 DNA 片段的分部分离与富集 ） 琼脂糖凝胶电泳 蔗糖梯度离心 （4）基因组 DNA 片段与载体连接并包装成基因文库 ） （5）从基因文库中分离筛选出含有目的基因的重组克隆 ） （八） cDNA 文库的构建及目的基因分离 1. 构建 cDNA 文库的主要步骤： 文库的主要步骤： 的制备； （ 第一链和第二链的酶促合成和分级分 （1）总 RNA 的提取及 mRNA 的制备； ）cDNA 第一链和第二链的酶促合成和分级分 ） （ （ 与各种接头连接并克隆到载体中； （ 包装及转染宿主菌； （ 离； ）与各种接头连接并克隆到载体中； ）包装及转染宿主菌； ）cDNA 文库的 （ （ （ 质量检测及保存。 质量检测及保存。 （1）大肠杆菌 RNase H 酶降解取代法 ） （2） Oligo(dG)寡聚引物法合成双链 DNA ） 寡聚引物法合成双链 （3） PCR 法合成双链 cDNA 分子 ） （4）cDNA 末端快速扩增 ） （5）载体引物引导 cDNA 的合成 ） （6）固体支持物合成全长双链 cDNA ） 2. 真核细胞总 RNA 的分离注意事项（略） 的分离注意事项（ 3. mRNA 的分离纯化与分析 Oligo-dT 纤维素柱层析法分离 mRNA Northern 杂交（RNA 印迹法）分析 杂交（ 印迹法） 4. mRNA 丰度与}