奶山羊泌乳相关miR-196a基因的单核苷酸多态性的检测方法及其应用的制作方法
专利名称奶山羊泌乳相关miR-196a基因的单核苷酸多态性的检测方法及其应用的制作方法
技术领域本发明属于奶山羊选育技术领域，涉及奶山羊泌乳量相关miR-196a基因的单核苷酸多态性及其检测和其作为辅助选择标记在奶山羊育种中的应用。
背景技术我国山羊品种资源丰富，养羊业的历史悠久，羊的存栏数量占世界前列。在广大的农村、牧区及城市郊区发展养羊业有巨大的潜力。山羊业为我们的生活提供了奶、肉、羊毛、绒及皮革等多种生活产品。其中，奶山羊业，投资小，易饲养，见效快，被称为“农家的奶牛”(赵有璋2002)。羊奶具有很高的营养价值，不含过敏原，营养成分均衡，易消化吸收，与人乳蛋白质组成相似，特别适宜于病人、婴幼儿及老年人饮用，因此山羊奶是最符合人类需求的 功能性保健食品(Haenlein，2004)。然而，在我国与其它养殖业相比，奶山羊养殖规模和方式相对落后。近年来，我国奶山羊存栏总数为580万只左右，发展非常缓慢，年产商品奶约占全国总奶量的3%。因此，利用分子育种技术加快良种选育从而发展和提高奶山羊业，这是我国未来奶业发展的重点内容之一，尤其是在“三聚氰胺事件”后对牛奶产业的发展产生严重的负面影响，山羊奶则越来越受到人们的重视。应用分子标记的现代育种技术是加快良种选育和提高种群遗传品质，从而增加奶山羊的泌乳量和改善乳品质的先进的有效的方法。应用分子标记育种首先是在DNA水平上筛查和检测与奶山羊泌乳性状密切相关的遗传标记；其次是建立其基因多态性的快速检测方法；然后实现遗传标记辅助选择和实现早期诊断选择。近年来，人们发展了许多用于探寻分子遗传标记的方法，最常见的有单链构象多态技术(SSCP)、PCR-RFLP和直接测序技术等，但SSCP操作繁琐、耗时长，结果易造成误判；普通的PCR-RFLP方法要求待测多态性位点是某ー特定酶切位点，应用范围局限；直接測序技术成本较高。MicroRNA(miRNA)在转录后水平对基因表达扮演着极其重要的角色。miRNA是ー类小的单链内源性非编码RNA，能够与靶mRNA的特定序列結合，通过降解靶mRNA或抑制翻译发挥其重要调控作用(Bartel，2004)。目前研究已经发现miRNA在细胞分化与凋亡、生长发育、糖脂代谢、炎症、免疫应答以及肿瘤发生等多个生理和病理过程中均扮演着关键角色，己有实验证据表明ー些miRNAs在乳腺上皮细胞的分化增殖过程中发挥重要的调控作用。Stefanie等(Stefanie et al.，2009)应用高能量测序的方法研究产后母小鼠乳腺发育相关的miRNA表达变化规律，结果显示miR-196a參考了小鼠产后腺发育的调控。但miR-196a在奶山羊上的研究目前还未见报道发明内容
本发明解决的问题在于提供ー种奶山羊泌乳相关miR_196a基因的单核苷酸多态性的检测方法及其应用，该基因的单核苷酸多态性其检测方便，可以作为辅助选择标记在奶山羊育种中应用，加快良种选育速度和提高种群品质。本发明是通过以下技术方案来实现ー种奶山羊miR_196a基因的单核苷酸多态性，其基因单核苷酸多态性包括在如SEQ ID No. I所示的奶山羊miR-196a基因序列中，其第340位为C或T的单核苷酸多态性。ー种奶山羊miR_196a基因的单核苷酸多态性的检测方法，包括以下步骤I)以包含miR_196a基因的待测奶山羊全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增奶山羊miR-196a基因；
所述的引物对P为正向引物CAGTCGGTTATCGTCGAGGGCCCGAA；反向引物GACCTCCTTTGTCTGTCTCCAT；2)用限制性内切酶HinfI消化PCR扩增产物，再对酶切后的片段进行琼脂糖凝胶电泳，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定奶山羊miR-196a基因序列中第340位的单核苷酸多态性CC基因型表现为265bp条带；CT基因型表现为265，241和24bp条带；TT基因型表现为241和24bp条带。所述的PCR扩增的反应程序为94°C预变性594°C变性30s，58°C退火30s，72°C延伸30s，35个循环;72°C延伸IOmin0所述琼脂糖凝胶电泳为I. 5%的琼脂糖凝胶电泳。所述将奶山羊miR_196a基因第340位SNP位点的CT基因型作为有效DNA标记。所述的有效DNA标记为CT基因型作为奶山羊泌乳性状的标记辅助选择育种中提高奶山羊第二、三胎泌乳量的分子遗传标记。所述的奶山羊miR_196a基因的单核苷酸多态性在奶山羊标记辅助选择中的应用。所述奶山羊miR_196a基因第340位的单核苷酸多态性中的CT基因型作为奶山羊泌乳性状的标记辅助选择育种中提高奶山羊第二、三胎泌乳量的分子遗传标记。所述的奶山羊miR_196a基因的单核苷酸多态性在区分绒山羊与奶山羊的分子遗传标记中的应用。所述的奶山羊miR_196a基因的单核苷酸多态性在区分绒山羊与奶山羊的分子遗传标记中的应用。与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果本发明提供的奶山羊miR_196a基因的单核苷酸多态性，利用DNA池测序的方法筛查奶山羊miR-196a基因的多态性位点，结果表明该基因第340位为C或T的碱基多态性，而且进一歩表明该基因与奶山羊的泌乳量相关，多态性可作为辅助选择标记在奶山羊育种中应用，从而加快良种选育速度和提闻种群品质。本发明提供的奶山羊miR_196a基因的单核苷酸多态性的检测方法，针对其多态性的特性，设计了特定的PCR引物扩增，用限制性内切酶HinfI消化PCR扩增产物，再对酶切后的片段进行琼脂糖凝胶电泳，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定SNP多态性，能够简单、快速、成本低、精确的检测其单核苷酸的多态性。本发明提供的奶山羊miR_196a基因的单核苷酸多态性，对2个奶山羊品种和2个绒山羊样品的上述SNP进行了基因分型和基因频率分析，结果表明这个位点检测能够成为绒山羊与奶山羊的区分特征；同时也对HinfI多态位点与莎能奶山羊各胎年泌乳量之间进行了关联分析。方差分析结果表明，HinfI多态位点能够成为提高奶山羊第二胎和第三胎泌乳量的分子标记。本发明提供的奶山羊miR_196a基因的单核苷酸多态性，提供了ー种用简单、快速、低成本、精确度高的，便于推广应用的在DNA水平上筛查和检测与奶山羊泌乳性状密切相关的遗传标记，可用于奶山羊的辅助选择和分子育种。
图I是本发明的流程示意图；图2是本发明中PCR克隆筛查到的奶山羊miR_196a第340位C-T突变的SNP多态性测序结果图；图3是本发明用来检测SNP多态性的PCR引物设计和扩增产物中SNP位点突变的示意图，其中方框中表示突变位点、带下划线为内切酶识别序列，小写“g”是引入的错配碱基;图4是本发明多态性检测的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图谱，其中琼脂糖凝胶浓度为 I. 5% ；图5是本发明中奶山羊miR-196a基因第340位的HinfI-RFLP的三种基因型电泳结果，琼脂糖凝胶浓度为2. 5% ;其中，TT基因型表现为355bp条带，TC基因型表现为355，334和2Ibp条带，CC基因型表现为334和2Ibp条带；由于2Ibp较小，故在琼脂糖电泳中看不到，但不影响判别基因型。
具体实施例方式本发明首先根据miR_196a基因的保守序列设计引物，分别以4种山羊品种的基因组DNA池为模板，进行PCR扩增，并对PCR产物纯化，测序。然后，进行测序图的分析和序列的比对筛查出SNP位点；其次，对待测群体进行多态位点的HinfI-RFLP检测；最后，根据在群体中检测到的基因型，进行群体遗传统计分析和泌乳量的关联分析，筛选出与奶山羊泌乳性状密切相关的分子标记。下面对本发明做详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。a、山羊miR_196a基因DNA序列的克隆及其多态性的检测I、山羊血样的采集及处理取山羊血样10mL，加入O. 5mol/L的EDTA 500 μ L抗凝，缓慢颠倒3次后放入冰盒，_80°C保存备用。本发明采用了 4种山羊品种，包括2中奶山羊和绒山羊，具体为I)关中奶山羊血样440份采自陕西省西安市三原塔南保种场；
2)萨能奶山羊血样268份采自陕西省宝鸡市千阳县萨能奶山羊繁育中心(201份)和西北农林科技大学奶山羊场(67份)；3)南疆白绒山羊血样230份采自新疆维吾尔自治区乌鲁木齐地区；4)新疆白绒山羊血样119份采自新疆维吾尔自治区乌鲁木齐地区；2、血样基因组DNA的提取I)将冷冻血样室温解冻，转移500 μ L至I. 5mL Eppendorf管，加入等体积PBS缓冲液，充分混勻，12000r/min离心IOmin(4°C ),弃去上清液,重复上述步骤至上清液透明、沉淀呈淡黄色。2)在离心管中加入DNA抽提缓冲液500 μ L，摇动，使血细胞沉淀脱离离心管壁，37°C水浴Ih0 DNA抽提缓冲液的配制0. 6057g的Tris、18. 612g的EDTA 和2. 5g的SDS加超纯水500mL，灭菌、调pH至8. 0，4°C保存备用。3)加蛋白酶K3yL(20mg/mL)并混匀，55°C过夜至澄清，尚未澄清者，可补加I μ L蛋白酶K混匀继续消化至澄清。4)将反应液冷却至室温，加Tris-饱和酚500 μ L，温和摇动离心管20min，使其充分混匀；4°C，12000r/min离心lOmin，将上清液转入另一 I. 5mL离心管中，重复一次。5)加氯仿500 μ L,充分混勻20min,4°C, 12000r/min离心IOmin,将上清液转入另一 I. 5mL离心管中。6)加O. I倍体积的NaAc缓冲液及2倍体积的冰冷的无水こ醇，混合转动离心管直至白色的絮状沉淀析出，-20°C保存30 60min。7) 4°C,12000r/min离心lOmin，弃去上清液，用70%的冰冷こ醇漂洗DNA沉淀2次。8) 4°C, 12000r/min离心IOmin,弃上清液,室温下使こ醇挥发干净。9)干燥后的DNA溶于80 100 μ L的TE-缓冲液或超纯水，4°C保存直至DNA完全溶解，O. 8%琼脂糖凝胶电泳检测其质量，-80°C保存。3、DNA池的构建用紫外光光度计测定DNA样品在260nm、280nm处的OD值。计算DNA含量和OD26tl/OD280的比值。如OD26(i/OD28(i比值小于I. 6，说明样品中含有较多的蛋白质或酚，则应进行纯化；若比值大于I. 8，则应该考虑去除RNA纯化。DNA 浓度(ng ) =50 X OD260 值 X 稀释倍数DNA检测完毕后，取出一定的量稀释至50ng/ U L，然后从关中奶山羊品种30个浓度为50ng/ μ L DNA样品中取10 μ L混合构建成品种DNA池；按照同样的方法也构建萨能奶山羊、南疆绒山羊、新疆绒山羊品种DNA池。4、扩增引物设计由于山羊pri-miR_196a序列至今未知，故从NCBI数据库中(http://www. ncbi.nlm. nih. gov/)获得同源动物牛的GenBank登录号为AC_000162. I 的pri_miR-196a DNA序列，以该基因序列同源保守区序列为參考用Primer5. O设计山羊pri_miR-196a的测序PCR引物对，扩增片段总长度为578bp。其测序引物对序列如下正向引物5’-GGTTTGGCGGCTTGAGGT-3’ 18bp ；
反向引物5’-GACCTCCTTTGTCTGTCTCCAT-3’22bp ；5、PCR 克隆山羊的 pri-miRNA_196a DNA 序列分别以4个山羊品种的DNA池为模版，用相应的引物对进行PCR扩增，PCR反应体系为25 μ L，见表I ;PCR反应程序，见表2。表IPCR反应体系
1.一种奶山羊rniR-196a基因的单核苷酸多态性，其特征在于，其基因单核苷酸多态性包括
在如SEQ ID No. I所示的奶山羊miR-196a基因序列中，其第340位为C或T的单核苷酸多态性。
2.一种奶山羊miR-196a基因的单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于，包括以下步骤
O以包含miR-196a基因的待测奶山羊全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增奶山羊miR-196a基因；
所述的引物对P为
正向引物CAGTCGGTTATCGTCGAGGGCCCGAA ；
反向引物GACCTCCTTTGTCTGTCTCCAT ；
2)用限制性内切酶HinfI消化PCR扩增产物，再对酶切后的片段进行琼脂糖凝胶电泳，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定奶山羊miR-196a基因序列中第340位的单核苷酸多态性CC基因型表现为265bp条带；CT基因型表现为265，241和24bp条带；TT基因型表现为241和24bp条带。
3.如权利要求2所述的奶山羊miR-196a基因的单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于，所述的PCR扩增的反应程序为94°C预变性594°C变性30s，58°C退火30s，72°C延伸30s，35个循环;72°C延伸IOmin0
4.如权利要求2所述的奶山羊miR-196a基因的单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于，所述琼脂糖凝胶电泳为I. 5%的琼脂糖凝胶电泳。
5.如权利要求2所述的奶山羊miR-196a基因的单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于，将奶山羊miR-196a基因第340位SNP位点的CT基因型作为有效DNA标记。
6.如权利要求5所述的奶山羊miR-196a基因的单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于，所述的有效DNA标记为
CT基因型作为奶山羊泌乳性状的标记辅助选择育种中提高奶山羊第二、三胎泌乳量的分子遗传标记。
7.权利要求I所述的奶山羊miR-196a基因的单核苷酸多态性在奶山羊标记辅助选择中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，奶山羊miR-196a基因第340位的单核苷酸多态性中的CT基因型作为奶山羊泌乳性状的标记辅助选择育种中提高奶山羊第二、三胎泌乳量的分子遗传标记。
9.权利要求I所述的奶山羊miR-196a基因的单核苷酸多态性在区分绒山羊与奶山羊的分子遗传标记中的应用。
本发明公开了一种奶山羊泌乳相关miR-196a基因的单核苷酸多态性的检测方法及其应用，其基因单核苷酸多态性包括在如SEQ ID No.1所示的奶山羊miR-196a基因序列中，其第340位为C或T的单核苷酸多态性。RFLP多态性与泌乳量关联分析证实HinfI多态位点与泌乳量之间有显著相关，基因型为CT的第二胎和第三胎泌乳量显著高于基因型为CC和TT个体的，此外TT个体的体高显著高于基因型CC和CT个体的。本发明提供的检测方法可以用于西农萨能奶山羊泌乳性状的标记辅助选择(MAS)，快速建立遗传资源优良的奶山羊种群。
文档编号C12N15/11GKSQ
公开日日 申请日期日 优先权日日
发明者陈宏 , 李转见, 郭文娇, 蓝贤勇, 黄永震, 孙加节, 王璟 申请人:西北农林科技大学您的访问出错了(404错误)
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　　单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。它是人类可遗传变异中最常见的一种，占所有已知多态性的90%以上。SNP研究是人类基因组计划走向应用的重要步骤，这主要是因为SNP将提供一个强有力的工具，用于高危群体的发现、疾病相关基因的鉴定、药物的设计和测试以及生物学的基础研究等。
　　经过近年检测技术的发展，科研人员可以通过NGS或SNP芯片筛选与疾病关联基因或区段，进而针对这个特定区段或基因上的SNP进行更为仔细研究，也有科研人员会通过已发表文章查询到与其研究相关的基因，再通过对该基因的DNA序列变化分析遗传机制，但如何查询特定区段或基因上的有用SNP位点呢？是很多刚接触科研的师弟师妹们的苦恼，小忆秋在此分享一下个人经验，供参考哈~
　　本人查询关注基因的SNP信息，一般会通过NCBI数据库进行，首先打开NCBI数据库链接：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/，在信息栏选择gene选项，在搜索栏中输入需要检索的基因name或ID，假如我们查询human的APC基因（不知道该基因的ID号），
　　输入后点击search，会出现如下界面：
　　结果中会包含不同物种的APC基因信息，我们选择human的一项点开，即可获得该基因的相关信息，如下图。如果我们知道要查询基因ID号，直接在搜索栏中输入ID，例如human的APC基因，gene ID为324，点击search，会直接出现一样的搜索结果。
　　将以上页面下拉，可查询该基因的相关信息，其中有一项，如下图显示，可看出该基因有3个转录本（分别为NM_、NM_和NM_），如果需要对转录本层面进行SNP查询，可在随后操作进行区分。
　　继续浏览页面右侧信息，可以发现SNP: GeneView选项，
　　点开，即可获得该基因SNP的所有信息（见下图）。其中红色框中描述了该搜索结果显示SNP的参考基因组版本以及如何搜索其他版本基因组信息介绍；粉色框中包含的即为上面所述的不同转录本信息，共有6条记录，其中前3条记录为后3条记录的未更新链接，后3条记录可以与我们刚才看到的3条转录本号一一对应；深绿色框中限定显示SNP的条件，一般我们常选择cSNP（编码区的SNP位点）。至于为什么选择cSNP呢，文章最后有介绍哦~
　　如果您没有特别关注的转录本，那可以选择NM_，这个转录本最长，对应的DNA序列最长，可以含有更多SNP信息，具体操作是点击 NM_最右侧的View snp on GeneModel即可， 如下图，想看哪条转录本信息，就点击哪条即可。
　　这样输出的结果即为需要查看转录本的SNP信息（如下图）。其中红色底纹的是错义突变，绿色底纹的为同义突变。如果想要看每一个SNP的具体信息，可以点击rs号查看。每一个rs号都会有两行记录，其中Chr. Position是SNP位点所在染色体位置；mRNA pos是SNP位点所在mRNA序列上的位置；dbSNP rs# cluster id是SNP的ID号；Function是突变类型或SNP所在区域（是非编码区还是编码区，是同义突变还是错义突变）；db SNP allele是碱基变化情况，其中第一行是突变后的碱基，第二行是参考碱基；Protein residue是氨基酸变化情况，其中第一行是突变后的氨基酸，第二行是参考序列氨基酸；Codon pos是指突变的碱基位于组成氨基酸的3个密码子中的哪一个位置，Amino acid pos是突变的氨基酸位于该蛋白氨基酸序列的位置。
　　按照上面的办法，挑选错义突变的SNP位点即可，如果还是觉得位点比较多，可以根据MAF值进行筛选。
　　Ps：为什么选择错义突变的cSNP研究呢？
　　cSNP是位于编码区内的SNP，比较少。从对生物遗传性状的影响上来看，cSNP又可分为2种：一种是同义cSNP（synonymous cSNP），即SNP所致的编码序列的改变并不影响其所翻译蛋白质的氨基酸序列，突变碱基与未突变碱基的含义相同；另一种是非同义或错义cSNP（non-synonymous cSNP或missense cSNP），指碱基序列的改变可使以其为蓝本翻译的蛋白质序列发生改变，从而影响蛋白质功能，这种改变常是导致生物性状改变的直接原因。因此错义突变的cSNP位点在遗传性疾病研究中却具有重要意义，也更受关注。
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